牡蛎（Crassostrea gigas）是我国重要的养殖贝类，山东乳山牡蛎全国盛名。李时珍在《本草纲目》中记载牡蛎肉“甘、温、无毒。牡蛎熟食、治虚损、调中、解丹毒、妇人血气。以姜、醋生食，治丹毒，酒后烦热，止渴。炙食甚美，令人细肌肤，美颜色”。牡蛎多糖是一种重要的活性物质，占牡蛎干质量的20%～40%[1]。具有抑制血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）、降血糖、抗氧化、免疫调节等功能[2-5]。侯丽等[6]研究发现，牡蛎多糖具有保护小鼠急性酒精肝损伤的作用；CAI B N等[7-8]研究发现，牡蛎多糖具有减轻5-氟尿嘧啶引起的肠炎症和营养不良的功能，是制备功能饮品的重要成分。
无花果（Ficus carica Linn）富含糖类、蛋白质、维生素、微量元素及芳香类和类黄酮、香豆素类等活性成分[9]，具有清热生津、健脾开胃、解毒消肿等功效，兼具食用和药用价值。其属于跃变型果实，含水量和含糖量较高，营养成分易损失，易遭受机械损伤，其采收期短、采后易腐烂，常温只能保存3～5 d，难以远距离运输和长期贮藏[10-11]。为增加经济价值，对成熟度较高的无花果进行产地加工十分必要[12]。目前关于无花果的研究主要集中在混合果酒发酵、果醋发酵等[13-18]，添加牡蛎多糖保健饮品开发相对较少，远不能满足市场需求。
无醇及低醇饮料最大的特点是降低了酒精含量，减少了酒精对人体的危害，同时很大程度保持了其原有的色泽及风味。根据《中国葡萄酿酒技术规范》[19]，通常认为低醇果酒酒精度在1%vol～7%vol左右，在满足人们饮用的同时，消除了酒的某些副作用。近年来，国内外低醇果酒的生产及消费都呈快速增长的趋势，具有良好的市场前景。本研究以山东荣成无花果为原料，制备低醇无花果酒。采用单因素试验及响应面试验设计，探究发酵时间、初始糖度、酵母菌接种量、牡蛎多糖添加量、发酵温度对其酒精度和感官评分的影响，并优化低醇无花果酒发酵工艺。旨在为产业化生产牡蛎多糖低醇无花果酒提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
无花果：山东荣成；牡蛎多糖：艾特生物科技有限公司；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；果胶酶（酶活＞50 000 U/g）、抗坏血酸、柠檬酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
CP3102分析天平：奥豪斯仪器有限公司；BCM-1000A生物洁净台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；PAL-109D数显酒精浓度计：杭州齐威科技有限公司；JYZ-C501打浆机：九阳股份有限公司；L-8900氨基酸自动分析仪：日本日立公司；PB-10 pH计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SPX-250BSH-II生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；SHA-C大容量恒温振荡器：常州国华电器有限公司；HH-S4恒温水浴锅：金坛市国旺实验仪器厂；WZS-32手持折光仪：上海仪电物理光学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 牡蛎多糖低醇无花果酒酿造工艺流程及操作要点
操作要点：
选用山东荣成完全成熟青皮无花果，清洗沥干，无花果与水按照料水比1∶3（g∶mL）加入饮用水，同时添加4 g/L抗坏血酸和4 g/L柠檬酸护色，用打浆机（已灭菌）进行破碎匀浆。加入0.3%（以果质量计）果胶酶，在50 ℃、pH=3.0的条件下酶解2 h，然后置于70 ℃水浴中灭酶5 min。降温后，用8层纱布进行过滤，得到无花果果汁。
将无花果果汁酸度调节至pH 3.5，调节初始糖度，添加一定量的牡蛎多糖，于（85±2）℃水浴中进行灭菌30 min，待冷却至室温，加入一定量（0.02%～0.06%）已活化（将相应含量酵母加入15倍35 ℃的纯水中30 min）的酿酒酵母，在一定温度条件下进行酒精发酵。待酒精含量不再升高，发酵结束。然后进行倒罐、陈酿（4 ℃，30 d）、灌装后得到牡蛎多糖低醇无花果酒成品。
1.3.2 牡蛎多糖低醇无花果酒发酵工艺参数优化
（1）单因素试验设计
试验以酒精度和感官评分为指标，分别研究了牡蛎多糖添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、初始糖度（15°Bx、16 °Bx、17 °Bx、18 °Bx、19 °Bx）、酵母菌接种量（0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%）、发酵温度（20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃）、发酵时间（6 d、7 d、8 d、9 d、10 d）对试验指标的影响。
（2）响应面试验设计
在单因素试验的基础上，以酒精度（Y1）和感官评分（Y2）为响应值，选取初始糖度（A）、酵母菌接种量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）为自变量，设计4因素3水平响应面试验，Box-Behnken试验因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization
1.3.3 分析检测
（1）感官评价
邀请具有感官评价资质人员9人，按照国标GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[20]相关要求，将样品放置于（20±2）℃环境中平衡24 h后，采用密码标记后进行感官品评，感官评分标准见表2。
表2 牡蛎多糖低醇无花果酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard of oyster polysaccharide low-alcohol fig wine
（2）理化指标
酒精度测定：采用酒精计法；牛磺酸的测定：采用氨基酸自动分析仪法[20]；pH测定：pH计法；初始糖度测定：折光仪法；Zn含量测定：参照GB 5009.14—2017《食品安全国家标准食品中锌的测定》[22]。
（3）微生物指标
参照GB4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》[23]、GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》[24]、GB/T 4789.25—2003《食品卫生微生物学检验酒类检验》[25]进行测定。
1.3.4 数据处理
采用Microsoft Office Excel 2016、SPSS 20.0进行试验数据分析，采用Design-Expert V8.0.6进行响应面试验分析，每个试验重复3次，结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 牡蛎多糖添加量的影响
不同牡蛎多糖添加量对试验结果的影响见图1。由图1可知，随牡蛎多糖添加量增加，感官评分呈现先上升后下降的趋势。当牡蛎多糖添加量为0.1%～0.3%时，感官评分随之增加；当牡蛎多糖添加量为0.3%时，感官评分最高，为95.25分；当牡蛎多糖添加量＞0.3%之后，感官评分呈现明显下降的趋势。经单因素方差分析，牡蛎多糖添加量对感官评分影响极显著（P＜0.01）。牡蛎多糖添加量对酒精度影响不大，酒精度基本稳定在6.7%vol～6.8%vol之间，且经单因素方差分析，牡蛎多糖对酒精度影响不显著（P＞0.05）。综合考虑，确定最适牡蛎多糖添加量为0.3%。
图1 牡蛎多糖添加量对牡蛎多糖低醇无花果酒感官评分和酒精度的影响
Fig.1 Effect of oyster polysaccharide addition on alcohol content and sensory score of oyster polysaccharide low-alcohol fig wine
2.1.2 初始糖度的影响
不同初始糖度对试验结果的影响见图2。由图2可知，随初始糖度在15～17°Bx范围内增加，酒精度和感官评分随之呈现上升趋势；当初始糖度为17°Bx时，酒精度和感官评分最高，分别为7.2%vol、95分；当初始糖度＞17°Bx之后，感官评分和酒精度随之下降。综合考虑，确定最适初始糖度为17°Bx。
图2 初始糖度对牡蛎多糖低醇无花果酒感官评分和酒精度的影响
Fig.2 Effect of initial sugar contents on sensory score and alcohol content of oyster polysaccharide low-alcohol fig wine
2.1.3 酵母菌接种量的影响
不同酵母菌接种量对试验结果的影响见图3。由图3可知，随酵母菌接种量在0.02%～0.04%范围内的增加，酒精度随之上升；当酵母接种量为0.04%时，酒精度最高，为6.8%vol；当酵母接种量＞0.04%之后，酒精度稍有下降。这说明碳源含量一定时，酵母发酵产生酒精的能力与酵母菌接种量密切相关，酵母接种量越大，酒精度越高，但是酵母菌接种量超过一定量时，酵母菌接种量增大，酒精度保持稳定或略有下降。随酵母菌接种量在0.02%～0.05%范围内的增加，感官评分随之上升；当酵母接种量为0.05%时，感官评分最高，为94分；当酵母接种量＞0.05%之后，感官评分有所下降。综合考虑，确定最适酵母菌接种量为0.05%。
图3 酵母菌接种量对牡蛎多糖低醇无花果酒感官评分和酒精度的影响
Fig.3 Effect of yeast inoculum on sensory score and alcohol content of low-alcohol oyster polysaccharide fig wine
2.1.4 发酵温度的影响
不同发酵温度对试验结果的影响见图4。由图4可知，随发酵温度在20～24 ℃范围内升高，酒精度和感官评分随之上升；当发酵温度为24 ℃时，感官评分和酒精度最高，分别为93分，6.8%vol；当发酵温度高于24 ℃之后，感官评分和酒精度逐渐下降。发酵温度升高促进酵母菌大量繁殖，因营养成分消耗殆尽导致菌体死亡，致使酒体略呈现浑浊和不良滋味。综合考虑，确定最适发酵温度为24 ℃。
图4 发酵温度对牡蛎多糖低醇无花果酒感官评分和酒精度的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on sensory score and alcohol content of oyster polysaccharide low-alcohol fig wine
2.1.5 发酵时间的影响
不同发酵时间对试验结果的影响见图5。由图5可知，随发酵时间在6～7 d范围内的延长，发酵时间在7 d时，酒精度最高为7.1%vol；发酵时间超过7 d之后，酒精度趋于稳定。感官评分随发酵时间在6～8 d范围内延长而逐渐提高，发酵时间在8 d时，感官评分最高为94分；发酵时间超过8 d之后，感官评分逐渐下降。发酵时间延长有利于酵母菌发酵产生酒精及风味成分，但当发酵时间过长，因酵母菌大量繁殖，产生代谢废物，出现菌体死亡等现象，且体系中可被酵母菌利用的糖类逐渐减少，出现风味变差、酒体浑浊等不良感官现象，这与李夏等[26-27]的研究结果相似。综合考虑，确定最适发酵时间为8 d。
图5 发酵时间对牡蛎多糖低醇无花果酒感官评分和酒精度的影响
Fig.5 Effect of fermentation time on sensory score and alcohol content of oyster polysaccharide low-alcohol fig wine
2.2 发酵工艺优化响应面试验结果及分析
在单因素试验的基础上，以酒精度（Y1）和感官评分（Y2）为响应值，选取初始糖度（A）、酵母菌接种量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）为自变量，设计4因素3水平响应面试验，利用Design-Expert V 8.0.6进行响应面试验设计，Box-Behnken试验结果见表3，方差分析见表4。
表3 Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments
以酒精度（Y1）为响应值，经二次多项回归拟合得到方程为：Y1=7.08+0.087A+0.11B+0.037C+0.11D+0.019AB+0.031AC+0.031AD-0.069BC+0.031BD-0.006 25CD-0.13A2-0.15B2-0.22C2-0.13D2。
由表4可知，该模型显著（P值=0.001 2＜0.05），失拟项不显著（P值=0.186 8＞0.05），模型拟合度较好，能较好地反映酒精度与各因素的变化规律。模型决定系数R2=0.835 8，校正决定系数R2adj=0.682 5，变异系数为3.05%，表明试验数据有3.05%的变异性可以用该模型对发酵工艺进行分析和预测。由P值可知，一次项A、B、D对酒精度影响显著（P＜0.05），二次项A2、B2、C2及D2对酒精度影响极显著（P＜0.01），其他因素影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，各因素对酒精度影响顺序为酵母菌接种量=发酵时间＞初始糖度＞发酵温度。
以感官评分（Y2）为响应值，经二次多项回归拟合得到方程为：Y2=93.67+0.42A+0.50B-0.50C+0.42D+0.38AB+0.50AC-0.37AD+0.50BC-0.12BD+0.25CD-2.54A2-2.92B2-2.54C2-2.29D2。
由表4可知，该模型显著（P＜0.000 1＜0.05），失拟项不显著（P=0.381 3＞0.05），模型拟合度较好，能较好地反映感官评分与各因素的变化规律。模型决定系数R2=0.977 7，校正决定系数R2adj=0.957 0，变异系数为1.07%，表明试验数据有1.07%的变异性可以用该模型对发酵工艺进行分析和预测。由P值可知，一次项A、B、C、D，交互项AC、BC对感官评分影响显著（P＜0.05），二次项A2、B2、C2及D2对酒精度影响极显著（P＜0.01），其他因素影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，各因素对感官评分影响顺序为发酵温度=酵母菌接种量＞发酵时间=初始糖度。
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
发酵温度、酵母接种量、初始糖度交互作用对感官评分影响的响应面与等高线见图6。由图6可知，交互项AC、BC对感官评分影响显著（P＜0.05），这与表4结果一致。
图6 酵母菌接种量、初始糖度与发酵温度间交互作用对牡蛎多糖低醇无花果酒感官评分影响的响应面与等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between yeast inoculum,initial sugar contents and fermentation temperautre on sensory score of oyster polysaccharide low-alcohol fig wine
利用Design-Expert V8.0.6软件，通过优化得到最佳发酵条件为：发酵温度24.9 ℃，发酵时间7.1 d，初始糖度17.1°Bx，酵母菌接种量0.05%。在此最佳条件下，酒精度预测值为7.102%vol，感官评分预测值为93.74分。结合实际操作可行性，将最佳发酵条件修正为：发酵温度25 ℃，发酵时间7 d，初始糖度17°Bx，酵母菌接种量0.05%。按此发酵工艺条件进行3次平行验证试验，得到平均酒精度实际值为7.17%vol，感官评分实际值为94.2分，与模型预测基本一致，表明该模型有效可行。
2.3 牡蛎多糖低醇无花果酒品质分析
2.3.1 感官指标
牡蛎多糖无花果酒酒体清澈透明、呈橙红色，果香浓郁，酒香适宜，无腥味，酒体柔和、口感酸甜，具有无花果固有的风味，典型性良好，感官评分为94.2分。
2.3.2 理化指标
在优化条件下，牡蛎多糖低醇无花果酒酒精度为7.17%vol，牛磺酸含量为482 mg/L，Zn含量为13.3 mg/L，总酸（以酒石酸计）含量为5.2 g/L。符合国标GB 2758—2012《食品安全国家标准发酵酒及其配制酒》要求。
2.3.3 微生物指标
牡蛎多糖低醇无花果酒菌落总数＜50 CFU/mL，金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均未检出，符合GB 2758—2012《食品安全国家标准发酵酒及其配制酒》要求。
3 结论
本研究利用响应面法优化得到牡蛎多糖低醇无花果酒的最佳发酵工艺为：原料选用完全成熟的荣成青皮无花果，经清洗、护色、匀浆、酶解、过滤等工序得到果汁滤液，调整pH值为3.50、初始糖度为17°Bx，添加0.3%的牡蛎多糖，灭菌冷却，添加0.05%已活化的酿酒酵母，于25 ℃条件下发酵7 d。发酵结束后进行倒灌、陈酿、灌装，最后得到成品。产品经过质量评价，口感良好、风味独特，其感官评分为94.2分，酒精度为7.17%vol，牛磺酸含量为482 mg/L，Zn含量为13.3 mg/L，菌落总数＜50 CFU/mL，致病菌未检出，是一款兼具口感与营养、安全卫生的低醇健康饮品。
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