拐枣（Hovenia acerba）为鼠李科枳椇属植物，又名枳棋、万寿果、鸡爪连等，拐枣肉质果梗肥厚扭曲，红褐色，香味浓郁，滋味甘甜[1]。拐枣不仅含有丰富的葡萄糖、果糖、氨基酸、维生素及人体必需的矿物质，还含有多糖、黄酮类等活性物质，具有健胃补血、增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤、降血脂等营养保健功能[2-5]。山楂（Crataegus pinnatifido）为蔷薇科山楂属植物，又名山里红、山里果、红果等[6]。山楂果实不仅富含有机酸、氨基酸、维生素C、胡萝卜素、矿物质等营养成分，还含有大量的黄酮类活性成分，具有抗氧化、降血脂、抗肿瘤、调节血压等作用[7-10]。
近年来，随着人民健康意识的提高，低醇度、富营养、具备保健功能的果酒类越来越受到消费者的青睐，研制生产低醇度果酒具有良好的市场前景。我国具有丰富的拐枣和山楂资源，且二者也可以药食两用，具有较高的保健作用和经济价值。目前关于拐枣和山楂的开发主要集中在鲜食、果脯、果汁饮料[11-12]及果酒[13-15]加工上。近年来，复合果酒酿造工艺方面亦有较多成果，如红枣山楂酒[16]、无花果山楂酒[17]和黑藜麦山楂酒[18]等，研究方向主要是果酒工艺的优化、香气化合物、总黄酮及抗氧化性的测定等。复合果酒通过将水果进行混合发酵，使不同原料间的营养物质、香气、色泽及活性成分等相辅相成，制得口感好、风味佳、营养高的果酒，解决了果酒口感和风味单一的问题，提升了果酒品质。通过市场调研发现，目前市面上所售的拐枣酒和山楂酒大多为露酒，酒精度较高，将拐枣和山楂混合发酵制备果酒未有报道。该研究以拐枣和山楂为原料进行混合发酵，并对果酒的理化指标、微生物指标及抗氧化性进行研究，旨在丰富果酒的品种，为拐枣和山楂资源的开发利用提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
拐枣：购于河南信阳；山楂：河南省农业高新科技园；白砂糖：云南滇鹏糖业有限公司；Lalvin 71B降酸酵母菌（3.2×108 CFU/g）、果胶酶（30 000 U/mL）：法国拉曼德公司。
平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基、煌绿乳糖胆盐肉汤（brilliant green lactose bile broth，BGLB）培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂（violet red bile aga，VRBA）培养基：北京陆桥技术股份有限公司；芦丁标准品（纯度＞98%）：北京索莱宝科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）（纯度为97%）：美国Sigma公司；无水乙醇、维生素C、过氧化氢、水杨酸、硫酸亚铁（均为分析纯）：天津富晨化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
FA1604电子分析天平：上海光学仪器一厂；206A破壁机：美的股份有限公司；VORTEX 21K高速冷冻离心机：湘仪离心机仪器有限公司；SPX-250B-ZⅡ生化培养箱、BJ-2CD超净工作台：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；PHS-25 pH计：上海雷磁仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 拐枣山楂酒制备工艺与操作要点
原料选取→预处理→破碎→酶解→调配→接种→主发酵→过滤→后发酵→澄清→过滤→陈酿→成品
操作要点：
原料选取：选取形态饱满、红褐色、无霉变及病虫害的新鲜拐枣；选取颜色鲜红、无霉变及病虫害的新鲜山楂。
预处理、破碎：拐枣和山楂清洗干净，将山楂去籽后置于90 ℃热水中热烫5 min，冷却后按照1∶3（g∶mL）的料水比分别将拐枣和山楂破碎打浆。
酶解：将拐枣浆和山楂浆混合后按质量比加入0.3%的果胶酶，然后在40 ℃条件下酶解4 h。酶解结束后，将其置于80 ℃水浴条件下灭酶15 min，冷却后备用。
调配、接种、过滤、发酵：根据试验设计向果浆中补加白砂糖，调节发酵液的初始糖度。然后按照0.03%的质量比加入偏重亚硫酸钾进行杀菌。根据设定配方加入71B降酸酵母菌，搅拌均匀后进行恒温酒精发酵。每天对发酵醪的酒精度和糖度进行测量，待其糖度和酒精度变化缓慢时停止发酵，过滤去渣，0～4 ℃环境下陈酿2个月，得到果酒成品。
1.3.2 单因素试验
原料配比优化：在初始糖度21°Bx，酵母接种量0.3 g/L，发酵时间7 d，发酵温度22 ℃的条件下，分别设置拐枣浆和山楂浆质量比3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3进行发酵。发酵结束后，对果酒进行感官评定并测定糖度和酒精度。
初始糖度优化：在拐枣浆和山楂浆质量比1∶1，酵母接种量0.3 g/L，发酵时间7 d，发酵温度22 ℃的条件下，通过添加白砂糖分别调整初始糖度为17°Bx、19°Bx、21 °Bx、23°Bx、25°Bx进行发酵。发酵结束后，对果酒进行感官评定并测定糖度和酒精度。
酵母接种量优化：在拐枣浆和山楂浆质量比1∶1，初始糖度21°Bx，发酵时间7 d，发酵温度22 ℃的条件下，设置酵母接种量为0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L进行发酵。发酵结束后，对果酒进行感官评定并测定糖度和酒精度。
发酵时间优化：在拐枣浆和山楂浆质量比1∶1，初始糖度21°Bx，酵母接种量0.3 g/L，发酵温度22 ℃的条件下，设置发酵时间为4 d、5 d、6 d、7 d、8 d进行发酵。发酵结束后，对果酒进行感官评定并测定糖度和酒精度。
1.3.3 正交试验
在单因素试验的基础上，设计4因素3水平正交试验，考察拐枣浆和山楂浆质量比（A）、初始糖度（B）、酵母接种量（C）及发酵时间（D）对拐枣山楂果酒感官评分的影响，正交试验因素水平设计见表1。
表1 拐枣山楂果酒发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for Hovenia acerba-hawthorn wine fermentation condition optimization
1.3.4 测定方法
（1）感官评价
参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》制定感官评分细则[20]。感官评定小组由10名经过培训的人员组成，要求对拐枣山楂果酒的外观、香气、滋味和典型性进行评价，评分标准详见表2，取平均值作为最终感官评分，满分为100分。
表2 拐枣山楂果酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Hovenia acerba-hawthorn wine
续表
（2）理化和微生物指标的测定
参照NY/T 1508—2017《绿色食品 果酒》[19]，对果酒的酒精度、总酸、挥发酸、总糖[20]、菌落总数[21]及大肠菌群[22]分别进行测定；总黄酮含量的测定参照文献[23-24]方法，采用紫外可见分光光度法。
（3）抗氧化性的测定
测定拐枣山楂果酒和对照果酒（市面上所售的拐枣露酒和山楂露酒，均为高度酒泡制制成）的体外抗氧化能力。参考文献中的方法，测定并计算样品和市售果酒的DPPH自由基清除能力[25]以及羟基自由基清除能力[26]，以维生素C作为阳性对照，对果酒进行体外抗氧化性分析。
1.3.5 数据分析
试验数据采用SPSS 19.0和Excel 2013软件进行分析，用Origin8.6制图。所有试验均平行测定3次，结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 原料配比的确定
原料配比对果酒品质的影响见图1。由图1可知，随着山楂浆比例的增加，果酒的总糖呈现下降趋势，酒精度和感官评分呈现先升高后降低的趋势。新鲜拐枣含糖量基本是山楂的2倍，随着其在原料比例中的减少，发酵醪的含糖量随之减少，发酵结束时，果酒中总糖减少。拐枣加入量过大会掩盖山楂风味，果酒颜色较淡，且略带涩味。山楂加入量大则果酒颜色鲜亮，但酸度较高，酸甜比例失调。综合考虑，选拐枣浆和山楂浆最佳质量比为1∶2。
图1 原料配比对拐枣山楂果酒品质的影响
Fig.1 Effect of raw material ratio on the quality of Hovenia acerbahawthorn wine
2.1.2 初始糖度的确定
不同初始糖度对果酒品质的影响见图2。由图2可知，果酒中总糖随着初始糖度的增加而增加，酒精度和感官评分呈现先上升后下降的趋势。当初始糖度为17°Bx时，经过酵母菌的转化之后残糖量较低，拐枣山楂果酒甜味不足，酸味明显，口感不协调；当初始糖度为25°Bx时，含糖量较高影响酵母菌的发酵，导致酒精度下降，同时酒液稳定性差，口感较甜腻。初始糖度为21°Bx时，所得果酒纯净有光泽，有明显的拐枣和山楂果香，酸甜比协调，感官评分达到91分。综合考虑，最佳初始糖度为21°Bx。
图2 初始糖度对拐枣山楂果酒品质的影响
Fig.2 Effect of initial sugar contents on the quality of Hovenia acerbahawthorn wine
2.1.3 酵母接种量的确定
酵母接种量对果酒品质的影响见图3。由图3可知，随着接种量的增加，拐枣山楂果酒的总糖呈现下降趋势，酒精度和感官评分呈现先上升后下降的趋势。当酵母接种量为0.1 g/L时，发酵醪中酵母菌数量少，发酵周期长，增加了有害微生物污染的风险，发酵后果酒香气不明显，有异味，口感不协调；增加酵母接种量可缩短发酵周期，但加入量过大则由于酵母菌自身生长繁殖需要消耗发酵醪中大量糖分，最终会影响果酒的整体协调性，酒香不够自然；当酵母接种量为0.3 g/L时，果酒酸甜协调，有明显的拐枣和山楂果香，酒香自然，风格明显，感官评分最高。故选择最佳酵母接种量为0.3 g/L。
图3 酵母接种量对拐枣山楂果酒品质的影响
Fig.3 Effect of yeast inoculum on the quality of Hovenia acerbahawthorn wine
2.1.4 发酵时间的确定
发酵时间对拐枣山楂果酒品质的影响见图4。由图4可知，随着发酵时间的延长，拐枣山楂果酒的总糖呈现下降趋势，酒精度呈现先上升后稳定的趋势，感官评分呈现先上升后下降的趋势。发酵时间短，果酒中残糖量较高，偏甜，口感不协调，澄清度也较差；发酵时间过长，由于发酵醪中含糖量的下降及酒精度的升高导致果酒不够柔和爽口，酸甜比不协调；在发酵时间为7 d时感官评分达到最大值92分，此时拐枣山楂果酒酸甜协调，有自然优雅的拐枣和山楂香，酒香浓郁。
图4 发酵时间对拐枣山楂果酒品质的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of Hovenia acerbahawthorn wine
2.2 果酒发酵条件优化正交试验
以感官评分为评价指标，进行4因素3水平正交试验，结果见表3。由表3可知，用感官评分作为评价指标时，影响拐枣山楂果酒品质的主次因素为A＞C＞D＞B，即拐枣浆和山楂浆质量比＞酵母接种量＞发酵时间＞初始糖度，最优组合为A2B2C2D3，最佳工艺条件为拐枣浆和山楂浆质量比1∶2，初始糖度21 °Bx，酵母接种量0.3 g/L，发酵时间8 d。在此条件下进行验证试验，得到的果酒感官评分达到93.1分，酒精度为8.4%vol，糖度为7.9 g/L。
表3 拐枣山楂果酒发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for Hovenia acerba-hawthorn wine fermentation technology optimization
2.3 拐枣山楂果酒成品检测结果及分析
拐枣山楂果酒澄清透明，颜色浅宝石红色有光泽，无悬浮物及沉淀；有明显的拐枣和山楂果香，酒香自然；酸甜协调，柔和爽口，风格明显。理化和微生物指标检测结果见表4。由表4可知，按最佳工艺条件制作的拐枣山楂果酒的理化指标及微生物限量均符合食品安全国家标准GB2758—2012《发酵酒及其配制酒》。
表4 拐枣山楂果酒理化及微生物指标检测结果
Table 4 Determination results of physiochemical and microbiological indexes of Hovenia acerba-hawthorn wine
2.4 抗氧化性检测结果
不同浓度样品对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力测定结果见图5。由图5可知，拐枣山楂果酒、拐枣露酒及山楂露酒对DPPH自由基、羟基自由基的清除作用都随着浓度的增加而增强，具有良好的量效关系。VC、拐枣山楂果酒、拐枣露酒和山楂露酒清除DPPH自由基的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值分别为4.9 μg/mL、0.36 mL/mL、0.45 mL/mL和0.63 mL/mL，即对DPPH自由基的清除能力为VC＞拐枣山楂果酒＞拐枣露酒＞山楂露酒；清除羟基自由基IC50值分别为410 μg/mL、1.89 mL/mL、3.10 mL/mL和4.09 mL/mL，即羟基自由基的清除能力为VC＞拐枣山楂果酒＞拐枣露酒＞山楂露酒，拐枣山楂果酒抗氧化能力高于泡制的露酒。主要原因可能是拐枣和山楂中的黄酮类化合物通过原料破碎及微生物发酵作用更多的溶入发酵液中，起到抗氧化作用。
图5 不同浓度样品清除DPPH自由基（A）以及羟基自由基（B）的能力
Fig.5 DPPH free radical (A) and hydroxyl free radical (B) scavenging ability of samples with different concentrations
3 结论
该研究在单因素试验基础上，通过正交试验对拐枣山楂果酒进一步优化，确定最佳工艺条件为拐枣浆和山楂浆质量比1∶2，初始糖度21 °Bx，酵母接种量0.3 g/L，22 ℃条件下发酵8 d，所制得的果酒澄清透明，颜色呈浅宝石红色，有明显的拐枣和山楂果香，酸甜协调，风格明显，感官评分达到93.1分，各项理化及微生物指标均符合食品安全国家标准。成品果酒富含黄酮，对DPPH自由基和羟基自由基清除能力均高于拐枣露酒和山楂露酒，具有良好的保健功效，可为高品质果酒的开发提供依据。
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