白酒作为中国传统的民族工业，具有悠久的历史，它拥有独特的酿造工艺和独特的酒体风味，是世界六大蒸馏酒之一[1]。有关科学研究院以及生产企业通过科学的检测研究，将白酒划分为12种香型[2]，不同香型的白酒拥有不同的工艺特点及风味特征。在划分的12种香型中，浓香、清香、酱香作为三大主体香型具有不可撼动的地位[3]。报告显示，2020年浓香、清香、酱香三种香型白酒占市场比例高达93%，其余香型仅占7%[4]。清香型白酒又分为小曲清香、大曲清香和麸曲清香[5]，其中小曲清香酒质柔和、清香纯正，深受当代年轻人喜爱[6]。
检测白酒风味物质的方法有许多种，例如气相色谱（gas chromatography，GC）法[7]、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）法[7-8]、气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS）[9]、气相色谱-四极杆飞行时间质谱（gas chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry，GC-QTOF MS）[10]等，其中，GC-QTOF MS具有准确定量、快速筛查[11]，高灵敏度、高精确度[12]，数据采集简单方便[13]等优点，目前已广泛应用于农药残留[11，13-14]、烟草[15]、蜂王浆[16]等领域。栗新峰等[10]对原酒进行感官定级以及通过气相色谱-四极杆飞行时间质谱对样品中的43种挥发性风味成分进行定性和定量分析，利用因子分析方法从43种挥发性风味物质成分中筛选出23种挥发性风味组分，并能够将3个等级原酒进行有效分类。但利用气相色谱-四极杆飞行时间质谱技术进行白酒风味物质检测的运用范围不广。
本研究以3种不同香型（浓香、酱香、小曲清香）的24个白酒样品为研究对象，采用气相色谱-四极杆飞行时间质谱（GC-QTOF MS）检测白酒中40种挥发性风味物质。对结果进行Z-score标准化后结合层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）以及偏最小二乘法-判别分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）3种化学计量学方法，分析不同香型白酒中风味物质的差异，充分认识白酒香型的实质[17]，以期为白酒香型的鉴别与分类予以有效、合理、科学的技术方式，为白酒香型的快速鉴别提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酒样：3个香型共计24个原酒酒样，包括浓香型（NX）原酒酒样8个（N1～N8）；酱香型（JX）原酒酒样8个（J1～J8）；小曲清香型（XQQX）原酒酒样8个（Q1～Q8）；验证原酒酒样6个（Y1～Y6，其中Y1、Y2为浓香型，Y3、Y4为酱香型，Y5、Y6为小曲清香型）所有原酒酒样均由相应酒厂提供。
甲酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯等标准品（纯度均≥99.9%）：上海西格玛奥德里奇公司；叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸（纯度均≥99.9%）：天津市津科精细化工研究所。
1.2 仪器与设备
超纯水处理系统：美国的密理博公司、VF-WAXms色谱柱CP9207（60 m×0.25 mm×0.25 μm）、7890B/7200Q-TOF气相色谱-四级杆飞行时间质谱仪：美国安捷伦公司；Labserv-LS-0610干燥箱：梅特勒-托利多仪器（上海）公司；电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 标准品溶液及供试品溶液的制备
酯类标准品的配制：准确称取甲酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异戊酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、亚油酸乙酯、棕榈酸乙酯、油酸乙酯15种酯类物质于100 mL容量瓶中，用体积分数为60%的乙醇稀释至刻度，摇匀，为混标1，备用。混标1中各组分的质量浓度分别为322.825 mg/L、2 697.23mg/L、997mg/L、128.3375mg/L、59.4mg/L、60.12mg/L、151.83 mg/L、3 265 mg/L、305 mg/L、3 511.512 5 mg/L、167.17 mg/L、116.062 5 mg/L、75.625 mg/L、127.45 mg/L、138.52 mg/L。
酸类标准品的配制：准确称取乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸7种酸类物质于100 mL容量瓶中，用体积分数为60%的乙醇稀释至刻度，摇匀，为混标2，备用。混标2中各组分的质量浓度分别为1 590.26 mg/L、166.925 mg/L、735.33 mg/L、78.4 mg/L、1 860 mg/L、120.825 mg/L、63.5 mg/L。
醛酮类标准品的配制：准确称取乙醛、乙缩醛、异戊醛、糠醛、3-羟基-2-丁酮5种醛酮类物质于100 mL容量瓶中，用体积分数为60%的乙醇稀释至刻度，摇匀，为混标3，备用。混标3中各组分的质量浓度分别为1 418.58 mg/L、668.8 mg/L、62 mg/L、662.86 mg/L、67.5 mg/L。
醇类标准品的配制：准确称取甲醇、2-丁醇、正丙醇、异丁醇、正丁醇、2-甲基丁醇、异戊醇、正戊醇、己醇9种醇类物质于100 mL容量瓶中，用体积分数为60%的乙醇稀释至刻度，摇匀，为混标4，备用。混标4中各组分的质量浓度分别为634.23 mg/L、610.5 mg/L、2 458.7 mg/L、579.1 mg/L、292.22mg/L、232.15mg/L、1438.35mg/L、80.7mg/L、152.08mg/L。
吡嗪类标准品的配制：准确称取2,5-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪4种吡嗪类物质于100 mL容量瓶中，用体积分数为60%的乙醇稀释至刻度，摇匀，为混标5，备用。混标5中各组分的质量浓度分别为3.06 mg/L、2.32 mg/L、2.23 mg/L、5.27 mg/L。
内标溶液的配制：准确称取叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸3种内标物于200 mL容量瓶中，用体积分数为60%的乙醇稀释至刻度，摇匀，其质量浓度分别为158.746 8 mg/L、169.209 1 mg/L、158.899 5 mg/L。
供试品溶液：取酒样5 mL，再将混合内标溶液100 μL加入其中，轻晃混合均匀。
1.3.2 GC-QTOF MS检测条件
色谱条件：VF-WAXms色谱柱；进样量1 μL；进样口温度245 ℃；分流比20∶1；升温程序为以35 ℃的初始温度持续10 min，以每分钟3 ℃升温至120 ℃，持续5 min，然后再以每分钟8 ℃升温至245 ℃，持续10 min；载气为高纯氦气（He）；载气流速为1 mL/min。
质谱条件：扫描质量范围为29～500 m/z，接口温度为280 ℃，电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，质量扫描范围29～500 m/z。
1.3.3 定量和定性分析
定性分析：全扫描和检测自动进样，可运用直接进样法，而通过电脑检索美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）2012图谱库，用以明确3种不同香型（浓香、酱香、小曲清香）的24个白酒样品中所含有的40种风味物质中的特征离子碎片以及相对保留时间，为了定性分析的准确性，要选用丰度较高的碎片离子。
定量分析：通过各标准物质的含量和峰面积计算校正因子，以混合标准品中各组分与对应内标含量比值为横坐标（x），各组分与对应内标的峰面积比值为纵坐标（y）计算获得40种物质的标准曲线回归方程进行定量分析。
1.3.4 原始数据标准化
对原始数据进行Z-score标准化处理。将原始数据数据减去这一变量的平均数，再除以这一变量的标准差，有效消除原始信息数据之间存在的量纲差异和影响，使信息数据的可比性更高。
1.3.5 数据分析
分别采用软件SIMCA 14.1和SPSS 24.0对数据进行化学计量学分析，采用Excel2013软件对数据进行整理统计，采用Origin2021进行绘图。
2 结果与分析
2.1 白酒样品风味物质的测定
采用GC-QTOF MS对白酒样品中挥发性风味物质进行检测，结果见表1。由表1可知，白酒样品中共检出风味物质40种，其中酯类15种，酸类7种，醛酮类5种，醇类9种，吡嗪类4种。酯类是白酒中主要的呈香呈味物质，具有令人愉悦的水果香气[18]，但在不同香型的酒样中酯类物质的含量差异较大。NX酒样中乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯的含量较高；JX酒样中除乙酸乙酯和乳酸乙酯外，其余酯类物质含量相差较小，且乙酸乙酯和乳酸乙酯含量高于NX和XQQX酒样；XQQX酒样中仅测得10种酯类，其中乙酸乙酯含量最高，但其质量浓度也低于NX酒样与JX酒样。酸类[18]作为糖类发酵之后的一种产物，在其浓度较低时，可以加深白酒香气的层次感和复杂性，但若是存在较高浓度时，则会产生酸败感。NX酒样的酸类物质均以乙酸和己酸为主，JX和XQQX酒样的酸类物质均以乙酸为主，其余酸类物质在含量上相差不大。醛酮类化合物与白酒的香气也息息相关，其很大程度上影响着白酒香味物质的构成[19-20]。NX和XQQX酒样的醛酮类物质以乙醛和乙缩醛为主，而JX酒样则以乙醛和糠醛为主。醇类由发酵过程中氨基酸脱氨或糖脱羧产生[21]，适量的醇类物质能与酸酯化形成酯类物质，使酒体更加丰满[22]。在3个香型中，NX酒样的醇类物质含量相较于其余2个香型稍低；JX酒样中的各醇类物质含量较高且较为均匀；XQQX酒样中异戊醇的含量明显高于其他2个香型，其余醇类物质含量相差不大。吡嗪类物质阈值低，气味强度高，对焦香的形成发挥着很重要的作用，是白酒中重要的风味物质[23]。在本次实验的样品中，仅在JX酒样中检测到4种吡嗪类物质，且含量较小。结果表明，香型不同的白酒也有着不同种类和含量的风味物质，因此，为了保证数据的准确性以及科学合理性，对数据进行标准化处理。
表1 不同香型白酒风味物质质量浓度范围
Table 1 Mass concentration range of flavor substances in different flavor Baijiu
续表
注：“-”表示未检出。
2.2 层次聚类分析
对不同香型的24个白酒样品进行层次聚类分析（HCA），通过使用SPSS 24.0软件，根据白酒样品相关特征的相似度进行归类，检测标准为欧氏距离平方，并以此为基础，获得详细的聚类分析结果见图1。
图1 不同香型白酒中风味物质含量的层次聚类分析
Fig.1 Hierarchical cluster analysis of flavor substance contents in different flavor Baijiu
由图1可知，24个酒样分为3大类，表明不同香型白酒之间风味物质的含量存在较大差异。其中8种酱香型（JX）白酒很好地归为一类，8种小曲清香型（XQQX）白酒归为一类，8种浓香型（NX）白酒归为一类，表明以40种风味物质为原始变量可以将不同香型白酒进行正确归类。
2.3 主成分分析
通过系数矩阵适应性检验相关数据的结果表明，白酒样品中40种风味物质之间的关系为显著正相关，充分反映出白酒样品中所含的风味物质有着较强的相关性，可进行主成分分析（PCA）。使用SPSS 24.0软件对3种香型的白酒进行PCA，特征值及累计方差贡献率见表2，主成分载荷系数矩阵表3。由表2可知，前两个主成分的累计方差贡献率为91.464%（≥85%），说明这两个主成分反映了原始数据的大部分信息。由表2和表3可知，主成分1（principal component，PC1）方差贡献率为56.074%，其代表物质主要包括：丙酸乙酯、乙酸乙酯以及甲酸乙酯等酯类物质和酸类、吡嗪类物质；主成分2（PC2）方差贡献率为35.390%，其代表物质主要为丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯等酯类物质和部分酸类、醇类物质。
表2 不同香型白酒风味物质主成分分析特征值及累计方差贡献率
Table 2 Characteristic value of principal component analysis and contribution rate of cumulative variance of flavor substance of different flavor Baijiu
续表
表3 各风味物质主成分系数载荷矩阵
Table 3 Loading matrix of principal component coefficient of each flavor compound
续表
以主成分PC1为X轴，PC2为Y轴，建立不同香型白酒样品前2个主成分分布的二维散点图，结果见图2。由图2可知，NX酒样分布在第二象限，JX酒样的分布集中在第一象限，XQQX酒样分布在第三象限。结果表明，PCA能高效区分3种不同香型的白酒，而且分类的各白酒样品相关的情况，基本与获得的HCA结果相同，充分反映出HCA与PCA在鉴别和分类白酒香型的过程中是能互相验证的。
图2 不同香型白酒样品前2个主成分分布的二维散点图
Fig.2 Two-dimensional scatter plot of distribution of the first 2 principal components in different flavor Baijiu samples
2.4 偏最小二乘法-判别分析
对3个香型的白酒样品进行偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA），结果见图3。由图3可知，PLS-DA能够有效区分不同香型酒样，X轴的负半轴皆为XQQX酒样，第一象限分布NX酒样，第四象限集中JX酒样，NX酒样分布的散点距离相对较远，而JX酒样分布的散点较为集中。最终结果表明，PLS-DA散点图区分不同香型白酒酒样会更为精准、科学、直观，而且其最终分类的相关结果类似于PCA和HCA相关的结果，均能高效分类与鉴别白酒样品。
图3 不同香型白酒样品偏最小二乘法-判别分析散点图
Fig.3 Scatter plot of partial least squares-discrimination analysis of different flavor Baijiu samples
2.5 不同香型白酒风味物质差异及其原因
通过各风味物质的含量差异有效结合化学计量学（HCA、PCA及PLS-DA）可以根据不同的白酒样品香型对24个酒样进行有效分类和鉴别，其原因主要在于：①曲药各不相同[24]。浓香型白酒所使用的酒曲一般是采用小麦或添加大麦、豌豆、高粱等制成的中高温大曲，酱香型白酒所使用的是小麦制成的高温大曲，而小曲清香型白酒所使用的是以米粉或米糠为原料，加入适当辅料，接入一定量的种曲，在人工控湿控温下培养而成的小曲。因为曲药的生产原料不同、制作温度不同，导致了不同香型白酒中的风味物质含量差异。②发酵工艺不同[24]。不同的发酵工艺会导致发酵时间不同、发酵温度不同，从而使酒中的酯类、高级脂肪醇等物质的类型与含量的不同。浓香型白酒工艺特点为“续糟配料，混蒸混烧”，酱香型白酒则拥有“2次投粮，9次蒸煮，8次发酵，7次取酒”的特殊酿造工艺[25]，小曲清香型白酒的主要工艺特点为“培菌糖化、清蒸清烧”。③窖池不同[26-28]。不同香型白酒发酵所使用的窖池不同，浓香型白酒使用的是泥窖，酱香型白酒所使用的是泥底石窖，而小曲清香型白酒发酵多采用水泥窖。窖池材料的不同会造成微生物群落的差异，从而导致不同香型白酒中的风味物质含量差异。④地理位置、土壤类型、酿造环境等差异[24]。不同环境差异会对白酒中风味物质的形成造成影响。
2.6 方法验证
作为PLS-DA模型变量的变量权重值，变量重要性投影（variable importance for the projection，VIP）值通常用于代谢物积累差异分类，判别每组样本影响强度以及解释能力的衡量，而在实际生活中，运用较为普遍的差异代谢物筛选标准为VIP值≥1[29]。为了对不同香型白酒中存在的风味物质差异进行深入分析，通过VIP值将酒样分类的风味物质贡献进行量化，从而将特征风味物质筛选出来。VIP值和分类贡献度（变量的）呈正相关，VIP值越大，该风味物质对不同香型白酒差异贡献越大。不同香型白酒样品的风味物质VIP值见图4。
图4 不同香型白酒风味物质的变量重要性投影值
Fig.4 Variable importance projection values of flavor substances in different flavor Baijiu
为了筛选不同香型和风味物质的分类酒样，研究分析9种VIP值≥1的风味物质，由图4可知，存在较大贡献度的风味物质（VIP值≥1）包括：糠醛、己酸乙酯、乙酸、乳酸乙酯、正丙醇、异戊醇、己酸、乙酸乙酯和异丁醇，其VIP值分别为：1.098 30、3.165 99、1.125 42、2.714 01、1.126 21、2.222 47、1.159 19、1.938 26和1.384 49。
基于GC-QTOF MS结合化学计量学建立的不同香型白酒的区分模型，将Y1～Y6的白酒样品作为验证酒样，测定验证酒样中VIP值≥1的9种风味物质（己酸乙酯、乳酸乙酯、异戊醇、乙酸乙酯、异丁醇、己酸、正丙醇、乙酸、糠醛）的含量，结果见表4。
表4 验证酒样中风味物质的含量
Table 4 Content of flavor substances in validated Baijiu samples mg/L
对验证酒样风味物质的信息数据进行分析，获得验证酒样偏最小二乘法-判别分析PLS-DA散点图见图5。由图5可知，酒样Y1、Y2与NX归为一类，酒样Y3、Y4与JX归为一类，酒样Y5，Y6与XQQX归为一类。结果表明，可根据9种风味成分对不同香型白酒进行正确归类。这一方式可以准确、高效的鉴别3种香型的白酒，而且该方式还能有效识别不同香型白酒中含有的风味物质及其分布的相关规律。
图5 验证酒样偏最小二乘法-判别分析散点图
Fig.5 Scatter plot of partial least squares-discrimination analysis of validated Baijiu samples
3 结论
本研究采用GC-QTOF MS技术将3种不同香型（浓香、酱香、小曲清香）的24个白酒样品中挥发性风味成分进行检测，对结果进行Z-score标准化后，对全部的白酒样品进行HCA、PCA以及PLS-DA分析。结果表明，以24个酒样风味物质的数据建立的PLS-DA模型也能有效地识别出3种不同香型的酒样。通过VIP值（≥1）确定构成不同香型白酒差异的9种风味物质为：己酸乙酯、乳酸乙酯、异戊醇、乙酸乙酯、异丁醇、己酸、正丙醇、乙酸、糠醛，而且在方法验证的过程中发现，实验酒样以及验证酒样均能通过不同的香型归类白酒样品，这也充分体现出不同香型的白酒所存在的风味物质差异。因此，GC-QTOF MS结合各化学计量学为白酒香型的快速鉴别分类提供科学有效的技术手段。
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