花椒（Zanthoxylum bungeanum）是芸香科（Rutaceae）花椒属（Zanthoxylum L.）植物的果皮。花椒被誉为中国八大味之一，是我国人民常用的香辛料[1]。花椒精油是花椒的源次生代谢物质，也是花椒香气的主要来源。目前关于花椒精油的提取方法主要有CO2超临界萃取[2-3]、水蒸气蒸馏萃取（steam distillation extraction，SDE）[4-5]、溶剂提取[6-7]、冷榨法[8]、亚临界流体萃取法（subcritical fluid extraction，SFE）[9]及一些超声、微波、酶解等辅助方法[10-12]。超临界CO2提取法作为一种绿色的工业级精油生产方法，除有无化学污染的优势外，还有提取率高，操作温度较低，能防止热敏性物质的功能性被破坏的优点，但设备昂贵，能耗较高，产能较小等缺点，在一定程度上限制了其大规模的工业推广。水蒸气蒸馏法提取花椒精油，有保持花椒香气浓郁的优势，但很难提取出花椒酰胺、崖椒酰胺等滋味物质，并且提取得率较低，设备运行成本昂贵。溶剂提取法提取的花椒精油有提取滋味物质完整，香气均匀，口感饱满的优点，但化学物质易残留而降低精油的食品安全性。冷榨法提取的花椒精油颜色较好，香气浓郁且麻味素含量较高，但是颜色不稳定且带有苦味。超声波、微波、酶解等辅助方法能加速植物细胞壁破裂，有效成分的溶出，缩短提取时间，增加提取效率，但一般不单独使用[13]。亚临界流体萃取作为一种新型提取技术，使用常温萃取，低温脱溶生产工艺，能有效防止粕和油中的热敏性物质的分解；投资小、成本低、规模大，并且生产中无“三废污染”，属环保工程，近几年受到广泛的推崇[14]。
为了提高花椒精油的萃取效率，本研究以甘肃武都大红袍花椒为原料，采用水蒸气蒸馏萃取法（SDE）及亚临界流体萃取法（SFE）提取花椒精油。以花椒精油得率为评价指标，采用单因素试验和正交试验优化花椒精油的萃取工艺。通过固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）气相色谱-质谱联用（gas chromatography-massspectrometry，GC-MS）技术对比分析SFE及SDE提取花椒精油挥发性成分，以期为亚临界流体萃取法工业化生产花椒精油提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干大红袍花椒：甘肃武都；CO2（纯度＞99.9%）、氦气（He）（纯度＞99.99%）：成都科源气体有限公司。
1.2 仪器与设备
3P多功能热泵干燥车间装置：广东凯能电器科技有限公司；WFJ-60食品香料粉碎机：江阴市普友粉体设备有限公司；CBE-5L型亚临界流体萃取装置：河南亚临界生物技术有限公司；Agilent 9000气相色谱仪、5977B质谱仪：美国安捷伦公司；THT-4挥发油提取缩罐冷凝装置：北京国卫和教医药设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 花椒精油的萃取
干大红袍花椒置于多功能热泵干燥车间中，设置温度60 ℃连续干燥，调节水分约至8%。采用粉碎机粉碎，过30目筛，备用。
花椒精油亚临界流体萃取：称取一定量的大红袍花椒粉于亚临界的萃取罐中，排除空气，加入萃取溶剂丁烷。在设置的萃取条件下进行萃取，萃取液经蒸发系统蒸发掉溶剂后制得红花椒毛油，将毛油2 000 r/min离心20 min。室温静置2～4 h后，得到大红袍花椒精油[15]。
花椒精油水蒸气蒸馏萃取：取150 g花椒加入500 mL浓缩罐中，以300 mL蒸馏水为溶剂，浸泡1 h后通入冷凝水，加热回流4 h，停止加热，自然冷却至室温。从挥发油提取装置中收集花椒精油。
花椒精油得率计算公式如下：
1.3.2 亚临界流体萃取工艺优化
（1）单因素试验
固定花椒精油的亚临界流体萃取基本条件为液料比（1.0∶2.5）（g∶mL）、萃取3次、萃取温度45 ℃、萃取时间60 min，分别考察萃取次数（1、2、3、4、5次）、萃取温度（35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55℃）、萃取时间（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）、料液比（1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、1.0∶2.5、1.0∶3.0（g∶mL））对大红袍花椒精油得率的影响。
（2）正交试验
在单因素试验的基础上，以花椒精油得率为评价指标，考察4个因素（萃取次数、萃取温度、萃取时间和料液比）对花椒精油得率的影响。采用L9（34）试验设计进行4因素3水平正交试验，以确定最佳提取工艺。
1.3.3 花椒精油挥发性风味成分GC-MS分析
（1）SPME萃取条件
萃取头：二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷；老化温度：220 ℃；老化时间：30 min；样品量：3 mL；顶空瓶：10 mL；萃取温度：55 ℃；萃取时间：30 min。
（2）GC-MS检测条件
GC条件：DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 m）；载气为高纯氦气；进样口温度250 ℃；流速1.4 mL/min；分流比33∶1；气化室温度250 ℃；升温程序：起始温度40 ℃，保持3 min，升温速率5 ℃/min，升温至250 ℃，保持20 min。
MS条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，接口温度280 ℃，离子源温度250 ℃，质量扫描范围35～350 m/z。
（3）定性定量分析
将检测到的物质与美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology,NIST）11谱库进行比对，根据保留时间进行定性分析，采用峰面积归一化法定量。
1.3.4 数据处理
实验样品均有3次重复实验。正交试验结果采用SPSS 22.0软件进行显著性分析，P＜0.05为差异显著。
2 结果与分析
2.1 亚临界流体萃取花椒精油工艺优化单因素试验
2.1.1 萃取次数对花椒精油得率的影响
萃取次数对花椒精油得率的影响见图1。由图1可知，萃取次数在1～5次范围内的增加，花椒精油得率总体有先上升后趋于平缓的趋势。当萃取次数在1～3次时，花椒精油得率显著增加（P＜0.05）；继续增加萃取次数，萃取率的增加幅度趋于平缓。因此，综合考虑萃取效率、生产成本等因素，选择3次为最佳萃取次数。
图1 萃取次数对精油得率的影响
Fig.1 Effect of extraction times on essential oil yield
2.1.2 萃取温度对花椒精油得率的影响
萃取温度可以加速溶剂和溶质分子的热运动，增加溶质的溶解度和扩散速率，从而提高萃取效率，但萃取温度过高也会导致一些热敏性成分被分解破坏[16]。亚临界萃取温度对花椒精油得率的影响结果见图2。由图2可知，随着萃取温度在35～45 ℃范围内的升高，花椒精油得率随之迅速上升（P＜0.05）；当萃取温度为45 ℃时，精油得率最高，为14.71%；当萃取温度高于45 ℃之后，随着萃取温度继续升高，精油得率随之呈现显著下降趋势（P＜0.05），同时也会增加生产能耗。因此，综合考虑，选择45 ℃为最佳萃取温度。
图2 萃取温度对精油得率的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on essential oil yield
2.1.3 萃取时间对花椒精油得率的影响
油脂在亚临界流体中达到溶解平缓需要一定的时间，但过长的萃取时间会增加能耗[17]。亚临界萃取时间对花椒精油得率的影响结果见图3。由图3可知，随着萃取时间在20～40 min范围内的增加，花椒精油得率随之显著增加（P＜0.05）；当萃取时间在40 min时，花椒精油得率最高，为14.73%；当萃取时间＞40 min之后，花椒精油得率不再有显著变化（P＞0.05）。因此，选择40 min为最佳萃取时间。
图3 萃取时间对精油得率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on essential oil yield
2.1.4 料液比对花椒精油得率的影响
料液比对花椒精油得率的影响见图4。当料液比在1.0∶1.0～1.0∶2.0（g∶mL）时，花椒精油得率随之显著增加（P＜0.05）；当料液比为1.0∶2.0（g∶mL），精油得率达到14.68%，再继续增加萃取溶剂用量，精油得率基本平稳。综合考虑后续溶剂回收的问题，萃取溶剂使用过多，会增加溶剂使用成本及整体生产能耗。因此，选择1.0∶2.0（g∶mL）为最佳料液比。
图4 料液比对精油得率的影响
Fig.4 Effect of solid and liquid ratio on essential oil yield
2.2 亚临界流体萃取花椒精油工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，以精油得率为评价指标，考察萃取次数（A）、萃取温度（B）、萃取时间（C）和料液比（D）对花椒精油得率的影响，设置L9（34）正交试验设计进行4因素3水平正交试验，正交试验结果与分析见表1，方差分析结果见表2。
表1 亚临界流体萃取工艺优化正交试验结果与分析
Table 1 Results and analysis of orthogonal tests for subcritical fluid extraction process optimization
表2 正交试验结果方差分析
Table 2 Variance analysis of orthogonal tests results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
由表1可知，对结果影响由大到小顺序为萃取次数＞料液比＞萃取时间＞萃取温度，最优萃取工艺组合为A2B1C2D2（A2B2C2D2），即萃取次数3次、萃取温度40 ℃（45 ℃）、萃取时间40 min、料液比1.0∶2.0（g∶mL）。为保留精油的风味物质，选择A2B1C2D2。在此最佳萃取工艺条件下进行3次平行验证试验，花椒精油平均得率为15.11%[18]，且在此条件下花椒精油的提取率高于正交试验方案中的最高值（14.99%），说明该优化方案是可行的[19-21]。由表2可知，萃取次数对结果影响显著（P＜0.05），萃取温度、萃取时间及料液比对结果影响不显著（P＞0.05）。
2.3 花椒精油挥发性风味成分分析
2.3.1 总离子流色谱图
采用水蒸气蒸馏萃取法（SDE）及亚临界流体萃取法（SFE）提取花椒精油，花椒精油挥发性风味成分GC-MS分析总离子流色谱图见图5。
图5 水蒸气蒸馏萃取（a）及亚临界流体萃取（b）花椒精油中挥发性风味成分GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.5 Total ion chromatogram of volatile flavour components in Zanthoxylum bungeanum essential oil extracted by steam distillation extraction (a) and subcritical fluid extraction (b) analyzed by GC-MS
2.3.2 花椒精油挥发成分分析
用水蒸气蒸馏萃取法（SDE）及亚临界流体萃取法（SFE）提取花椒精油，两种不同方法提取花椒精油挥发性成分GC-MS分析结果见表3。
表3 花椒精油挥发成分测定结果
Table 3 Determination results of volatile components of Zanthoxylum bungeanum essential oil
续表
注：“-”表示未检出。
2.3.3 花椒精油挥发性化合物种类及含量
水蒸气蒸馏萃取花椒精油样品中共检出37种化合物，包括烯类16种、酯类7种、醇类7种、醛类2种、芳香烃类1种、呋喃类1种、酮类1种、萜类1种和酸类1种。其中相对丰度＞1%的化合物有：芳樟醇（15.01%）、（+）-柠檬烯（13.74%）、桉叶油醇（10.51%）、β-蒎烯（10.19%）、桧烯（9.86%）、3-蒈烯（9.66%）、乙酸芳樟酯（6.19%）、4-萜烯醇（4.94%）、3,6,6-三甲基-双环（3.1.1）庚-2-烯（4.91%）、间-异丙基甲苯（3.22%）、乙酸香叶酯（1.93%）、左旋-β-蒎烯（1.78%）、月桂烯（1.33%）、α-松油醇（1.26%）、乙酸橙花酯（（Z）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇乙酸酯）（1.09%）、2-蒎烯（1.03%）共计16种，与王娟等[22]研究结果相似。
亚临界流体萃取样品中共检出40种挥发性物质，包括烯烃类16种、酯类7种、醇类8种、醛类2种、芳香烃类1种、呋喃类2种、酮类1种、萜类1种、酸类1种和萘类1种。其中相对丰度＞1%的化合物有：（+）-柠檬烯（22.92%）、乙酸芳樟酯（14.12%）、芳樟醇（12.71%）、β-蒎烯（7.57%）、桧烯（7.34%）、3-蒈烯（6.05%）、萜品油烯（5.25%）、桉叶油醇（4.54%）、3,6,6-三甲基-双环（3.1.1）庚-2-烯（3.76%）、乙酸香叶酯（2.73%）、2-蒎烯（2.67%）、乙酸松油酯（2.04%）、乙酸橙花酯（（Z）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇乙酸酯）（1.69%）、乙酸（1.15%）共计14种。曹雁平等[23]研究表明，超临界萃取花椒精油的主要挥发性成分有芳樟醇（47.18%）、乙酸芳樟醇（12.11%）和D-柠檬酸（10.59%），和本实验样品结果相似。
2.3.4 花椒精油风味对比分析
两种提取方式的红花椒样品中，共检测出48种挥发性物质，包括烯烃类20种、酯类8种、醇类8种、醛类3种、芳香烃类2种、呋喃类2种、酮类2种、萜类1种、酸类1种和萘类1种。
对比亚临界流体萃取和水蒸气蒸馏提取中相对丰度＞1%的19个主要挥发性化合物，结果表明亚临界提取红花椒精油和水蒸气蒸馏的红花椒精油中均含有（+）-柠檬烯、β-蒎烯、桧烯、3-蒈烯、萜品油烯、3,6,6-三甲基-双环（3.1.1）庚-2-烯、2-蒎烯、乙酸芳樟酯、乙酸香叶酯、乙酸松油酯、乙酸橙花酯（（Z）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇乙酸酯）、芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇、桉叶油醇和乙酸16种物质，这些物质是红花椒中常见的挥发性化合物[24]。亚临界流体萃取样品中的（+）-柠檬烯（柠檬气味）、萜品油烯（柠檬气味）、乙酸芳樟酯（类似香柠檬、薰衣草等果香和花香）、乙酸松油酯（类似香柠檬、薰衣草等果香和花香）、乙酸（酸味）的峰面积分别是水蒸气蒸馏的2.0、74.0、2.66、3.1、2.3倍，这些物质沸点较高，可能与亚临界流体萃取香气持久性有关；水蒸气蒸馏样品中新检出左旋β-蒎烯（具有特有的松节油香气、干燥木材和松脂气味）、月桂烯（具有清淡的香脂香气）、间-异丙基甲苯（具有芳香气味及刺激性）等新化合物且4-萜烯醇（呈暖的胡椒香、较淡的泥土香和陈腐的木材气息）、α-松油醇（具有丁香气味）、桉叶油醇（樟脑气息和清凉的草药味道）分别是超临界萃取的4.75、4.48、2.0倍，这些挥发性化合物及其香气可能与水蒸气蒸馏红花椒精油的头香香气强有关，很好的解释了水蒸气蒸馏精油香气较强但留香型差劲，亚临界萃取不仅能很好的萃取香气成分，还能萃取部分滋味物质，对其香气有一定的干扰，留香型较强，远远高于水蒸气蒸馏的精油[25-26]。
3 结论
本研究采用亚临界流体萃取装置对花椒进行萃取，以精油得率为考察指标，在单因素试验的基础上进行正交试验优化，得出最佳的萃取条件为：萃取3次、萃取温度40 ℃、萃取时间40 min、料液比1.0∶2.0（g∶mL）。通过GC-MS对比分析亚临界流体萃取法和水蒸气蒸馏法制备的花椒精油中香气成分，结果表明，两种精油中主要含有（+）-柠檬烯、β-蒎烯、桧烯、3-蒈烯、萜品油烯、3,6,6-三甲基-双环（3.1.1）庚-2-烯、2-蒎烯、乙酸芳樟酯、乙酸香叶酯、乙酸松油酯、乙酸橙花酯（（Z）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇乙酸酯）、芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇、桉叶油醇和乙酸等挥发性风味物质，亚临界流体萃取法精油得率及峰面积较水蒸气蒸馏法高且留香型持久。亚临界流体萃取法应用于花椒精油的提取，效果更优，为花椒的进一步开发利用提供了研究基础。
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