百香果（Passionis fructum）含有蛋白质、脂肪、糖类和多种维生素及氨基酸等，营养丰富，具有“果汁之王”美称，含有丰富的膳食纤维和丰富的维生素，具有通便润肠，清热解毒，提高身体的免疫力以及美容养颜等功效[1-3]。百香果在食用后，给人一种饱腹感，可以帮助减肥，同时含有很多的超纤维，具有帮助人体排除毒素，防治胃肠炎以及痔疮等疾病的效果，所以百香果具有一定的药用价值[4]。黑枸杞（Nigrum wolfberry），属茄科是中国西部的一种药用植物，味甘，性平和，有丰富的脂肪、糖类、生物碱和维生素等各种成分，以及丰富的天然水溶性的原花青素，具有较强的抗氧化性，并被誉名为野生的“蓝色妖姬”[5-6]。它可以延缓衰老，防治糖尿病，易溶于水，属于天然的水溶性黄酮类降血脂，还可以作滋补身体、降血压和药用，并富含多种蛋白质[7]。发酵乳是以生牛乳或乳粉为原料，经杀菌、发酵后制成的pH值降低的产品[8]，牛乳发酵后，牛奶中的钙被转化为水溶性钙，很容易被机体所吸收利用，具有增强人体免疫力，调节机体生理，预防疾病等保健功效。另外，由于生物体代谢可产生大量自由基，自由基可攻击正常细胞甚至使细胞癌变，还会引起老年痴呆、动脉粥样硬化和癌症等近百种疾病，是导致人体衰老的主要因素，而抗氧化剂在一定程度上可清除自由基，具有自由基清除活性的抗氧化活性物质已成为研究热点[9]。
该研究以黑枸杞、百香果为主要原料制备乳饮料，采用单因素、模糊数学评价和响应面相结合的方法，以感官评价和蛋白质含量为标准，优化黑枸杞百香果乳饮料的工艺条件，测定其抗氧化性能及理化、微生物指标，可为黑枸杞发酵型乳饮料的产业化开发提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
百香果：市售；宁安堡黑果枸杞：宁夏宁安堡土特产品有限公司；新鲜牧场纯牛奶：江苏光明银宝乳业公司；蔗糖（一级）：广西都安永鑫糖业有限公司；复配增稠剂（食品级）BDS1005：丹尼斯克（中国）有限公司：菌种ABY-10（200 U/袋）：科汉森（北京）贸易有限公司；MRS、MC培养基：海博生物技术；孟加拉红、平板计数琼脂：北京陆桥技术股份有限公司；氢氧化钠、乙酸铅、磷酸氢二钠、浓硫酸、硫酸铜、氨水、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠标准品、硫酸钾、乙醚、石油醚、甲醇、乙腈、辛烷磺酸钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；三聚氰胺标准品（色谱纯）：武汉中昌国研标物科技；氯化铁、硫酸亚铁、双氧水、抗坏血酸、Tris、邻苯三酚（分析纯）：天津致远化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯）：福州飞净生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
UV1800紫外分光光度计：南京科捷分析仪器有限公司；Kjeltec8400全自动凯式定氮仪：丹麦福斯分析仪器有限公司；1260高效液相色谱仪、7890B气相色谱仪：美国安捷伦有限公司；PHB-4型pH计：上海精科仪器有限公司；XG1.CD-300M卧式灭菌锅：山东新华医疗器械有限公司；XPE205DR分析天平：瑞士梅特勒公司；N1-50全自动氮吹浓缩仪：广州仪德精密科学仪器股份有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱：上海博讯医疗生物器械有限公司；FT1乳品快速分析仪：丹麦福斯公司；DH3600B Ⅱ电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；BX53F显微镜：德国蔡司股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 黑枸杞百香果乳饮料的制备工艺及操作要点[10]
黑枸杞汁的制备[11-12]：选取果实比较丰富饱满、外表无损坏的优质黑枸杞，将准备好的黑枸杞放入纯水中清洗，清洗完去除表面的灰尘。然后按照料液比1∶15（g∶mL）的比例称质量后煮沸，然后将料液放入破碎打浆机中打碎成浆。80目过滤塞过滤，得到枸杞汁。
百香果汁的制备：应挑选个头大、果实饱满、香味浓郁、光滑，皮薄、成熟度高的果实；将选好的果实用清水反复清洗干净，并沥去果皮表面残留的水分，去掉外壳；将果肉放入打浆机中打碎成浆，并放入离心机中3 000 r/min离心20 min，80目过滤塞过滤，得到百香果汁
乳饮料的制备：以乳饮料的总质量为基准，加入蔗糖和黑枸杞汁以及百香果汁，原料混匀后，将混合液在70 ℃水浴锅中灭菌20 min，并冷却至35～40 ℃，加入菌种ABY-10，搅拌均匀，覆盖保鲜膜隔氧，将混合液置于40 ℃恒温条件下发酵，待混合液由液态变为固态凝乳，滴定酸度达到70 T°结束发酵。将发酵后的乳饮料放于4 ℃的冰箱中后熟24 h即得黑枸杞百香果乳饮料成品。
1.3.2 黑枸杞百香果乳饮料的感官评价标准
邀请10个专业感官评价人员对于乳饮料的气味、滋味、状态和色泽四个方面进行感官评价，满分10分，感官评价参考国标GB 7101—2015《饮料》的方法对乳饮料进行评价。黑枸杞百香果乳饮料感官评定标准见表1。
表1 黑枸杞百香果乳饮料感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of black wolfberry passion fruit milk beverage
1.3.3 工艺条件优化单因素试验
设置总添加量为100%，纯牛奶添加量随其他因素添加量的改变而改变，基本条件为增稠剂的添加量均为0.06%[13]，百香果添加量为8%，蔗糖添加量为5%，菌种添加量为0.002%，发酵时间5 h，黑枸杞汁添加量为7%。
黑枸杞汁添加量分别为5%、7%、9%、11%、13%；百香果汁添加量分别为4%、6%、8%、10%、12%；蔗糖添加量分别为3%、4%、5%、6%、7%；菌种添加量分别为0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%；发酵时间分别为4 h、5 h、6 h、7 h、8 h。
1.3.4 工艺条件优化响应面试验设计
依据单因素的试验结果，固定黑枸杞汁的添加量为11%，选择百香果汁添加量（A）、蔗糖添加量（B）、接种量（C）以及发酵时间（D）作为主要影响因素，以感官评分R1和蛋白质含量R2作为主要响应值，根据Box-behnken基本原理，运用Design-Expert 10.0.7软件设计响应面试验。响应面试验因素与水平见表2。
表2 黑枸杞百香果乳饮料工艺优化响应面试验因素与水平
Table 2 Response surface test factors and levels of black wolfberry passion fruit milk beverage
1.3.5 黑枸杞百香果乳饮料感官品质的模糊数学评价法
（1）因素集和评语集的建立
以气味、滋味、状态和色泽为因素集，以优、良、中、差为评语集，因素集F=（气味，滋味，状态，色泽），评语集为V=（优，良，中，差）。模糊数学评价法模型为Mi=W*Fi，其中Mi是模糊数学评价集，W是权重系数，Fi是模糊矩阵。
（2）权重集的确定
权重系数的确定由10位感官评价人员进行，首先是用户调查法，然后由感官评价人员根据因素的重要性采用二元对比法[14-15]，权重分布见表3。
表3 评价指标权重系数
Table 3 Weight coefficient of evaluation index
1.3.6 抗氧化性的测定
DPPH·清除率的测定：待测样液的配制参考李静等[9]的方法，将发酵前和发酵后样液分别稀释至原浓度的5%、25%、50%、75%、100%（即待测样液体积分数分别为0.05 mL/mL、0.25 mL/mL、0.50 mL/mL、0.75 mL/mL、1.00 mL/mL），检测及计算方法参考王文琼等[16-17]的方法。
1.3.7 理化指标以及微生物指标的测定
脂肪的测定：参考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定第三法碱水解法》；乳饮料中蛋白质的测定：参考GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定第一法凯氏定氮法》；乳饮料中乳糖、蔗糖的测定：参考GB 5413.5—2016《婴幼儿食品和乳品中蔗糖、乳糖含量的测定第二法莱茵-埃农氏法》；乳饮料中酸度的测定：参考GB 5009.239—2016《食品酸度的测定第一法酚酞指示剂法》；乳饮料中水分的测定：参考GB 5009.3—2016《食品中水分的测定第一法直接干燥法》；乳饮料中脂肪非脂乳固体的测定：参考GB 5413.39—2010《乳和乳制品中非脂乳固体的测定》；乳饮料中亚硝酸盐的测定：参考GB 5009.33—2016《食品硝酸盐与亚硝酸盐的测定第二法分光光度计法》；三聚氰胺的检测：参考GB/T 22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法第一法高效液相色谱法》。微生物、乳酸菌测定：参考GB 4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌检测》；霉菌及酵母计数：参考GB 4789.15—2016《食品微生物学检验霉菌与酵母计数》。
1.3.8 数据处理
单因素试验结果以“平均值±标准差”来表示，SPSS21.0用于数据方差分析及误差值的结果计算，Excel 2013用于误差折线图的绘制，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。
2 结果与分析
2.1 工艺条件优化单因素试验
工艺条件优化单因素试验结果见图1。如图1a所示，随着黑枸杞汁添加量的增加，感官评分变化不大，蛋白质的含量稍有降低，但变化不大。当黑枸杞添加量为5%时，乳饮料色泽较差，呈暗灰色，随着黑枸杞汁的增加色泽逐渐改善，当黑枸杞汁的添加量为11%时，感官评分最高，呈诱人的浅咖啡色，有枸杞和百香果清淡的香味，香气协调；当黑枸杞汁添加量＞11%时，颜色较深，色泽不佳。综上所述，黑枸杞汁添加量对乳饮料的影响不大，综合选择黑枸杞汁添加量为11%。如图1b所示，随着百香果汁添加量的增加，蛋白质的含量逐渐降低。感官评分先上升后下降的趋势，当百香果汁添加量为4%时，百香果风味较淡；当百香果添加量为6%时，有百香果的清香味，感官评分最高；当百香果汁添加量＞6%时，乳饮料呈酸涩味，且随着百香果汁的增加，涩味增加，光泽也逐渐降低，故选择百香果汁添加量为6%。如图1c所示，随着蔗糖量的增加，感官评价先增加后降低，当蔗糖量达到6%时，乳饮料的感官评价达到最高，此时蛋白质的含量相对较高，当蔗糖的含量低于或高于6%时，乳饮料的甜味不协调，感官评价相对偏低。可能是糖用量过多，产品甜感明显，百香果味易被掩盖，百香果特点不突出[18-19]。综合选择蔗糖添加量为6%。如图1d所示，随着接种量的增加，感官评价先增加后降低，当接种量达到0.003%时，其感官评价达到最大，蛋白质含量此时也相对偏高一些。当添加量少于这个添加量时，乳饮料状态不好，稍有乳清析出，添加量大于这个数值时，乳饮料偏酸，影响感官评价。接种量过低时，由于其基数少，菌的数量增加相对缓慢；接种量过高时，由于较高酸度又会抑制乳酸菌的继续繁殖与生长[20-21]。选择的接种量为0.003%。如图1e所示，随着产品发酵时间的延长，感官评价先增加后降低，发酵时间过短，乳酸菌生长繁殖不充分[21]，长时间的发酵使乳饮料的酸度增高[22]，其影响乳饮料的口感，当乳饮料的发酵时间到达6 h时，感官评价达到最高值，发酵时间5 h、6 h、7 h时，蛋白质含量变化较小。综合选择，最佳发酵时间为6 h。
图1 工艺条件优化单因素试验结果
Fig .1 Results of single factor tests for technology conditions optimization
2.2 工艺条件优化响应面优化试验
根据1.3.4进行响应面试验，感官评价人员对各因素投票数见表4，响应面试验设计及结果见表5。
表4 感官评价票数结果分布
Table 4 Distribution of vote results of sensory evaluation
续表
将表4中的数据建立模糊评价矩阵，以1号产品为例，其模糊矩阵为：
将1号样品各因素的得票数除以10，比如滋味优、良、中、差得票数分别为5、3、1、1，即可得矩阵中第一行滋味为（0.5，0.3，0.1，0.1），同理，第二、三、四行气味、色泽和状态分别为（0.4，0.3，0.2，0.1）、（0.4，0.5，0.1，0）、（0.6，0.2，0.1，0.1），由此可得到上矩阵F1。同理，可以依次得到F2-F29。根据模糊数学计算原理，按照前1.3.5中模糊数学评价方法，1号样品感官评分结果根据矩阵乘法计算M1=W×F1=（0.478，0.317，0.125，0.08），将优、良、中、差四个等级分别赋值为9分、8分、7分、6分，M1中计算出来的各个数值分别乘以相应赋值，再相加，即1号样品感官评分为0.478×9+0.317×8+0.125×7+0.08×6=8.193，同理可以计算出2～29号样品的感官得分。
利用响应面软件Design-Expert 10.0.7对试验数据结果进行了多元回归拟合，结果见表5。所获得的响应值R1感官评价和R2蛋白质含量的回归模型方程分别是：
表5 响应面试验设计与结果
Table 5 Design and results of response surface experiments
对以感官评分为评价指标的回归模型进行方差分析，结果见表6。
表6 以感官评分为评价指标的回归模型方差分析结果
Table 6 Variance analysis results of regression model with sensory score as evaluation index
注：“*”表示影响显著，P＜0.05，“**”表示影响极显著，P＜0.01。
由表6可知，模型的P＜0.000 1且其失逆项P=0.155 9＞0.05，说明此模型是极显著且数据具有较高的可靠性[19-20]；R2=0.999 7，说明此模型的可信度极高，拟合度较好，且R2Adj=0.999 4，说明有99.94%的试验符合该模型[23-24]，CV%=0.15，远小于5%，说明此模型的重现性极好[24]，综合以上说明，此模型完全可以用来评价此次试验结果且较合理。根据P值大小，同时由表中F值的大小可知，A、B、C、D对试验结果影响大小顺序为D＞A＞B＞C。一次项A、B、C、D和二次项AB、AC、AD、BC、BD、A2、C2、D2均影响极显著，二次项B2影响显著，响应面图如图2所示。
响应面越陡峭，表明该因素对实验结果影响越显著[25]。由图2可知，CD、AD响应面最陡峭，影响最显著，同时在任意二者的交互响应面图上也可以看出，响应值均存在一个极大值，说明此模型数据合理。等高线呈现椭圆形，二者存在交互作用。从等高线以看出，任意二者之间均存在一定的交互作用，且交互作用显著（P＜0.05）。该结果与方差分析结果一致。
图2 各因素交互作用对感官评分影响的响应面及等高线
Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory evaluation
经过Design-Expert 10.0.7综合优化，黑枸杞百香果乳饮料的最佳工艺条件为：百香果汁添加量4.70%，蔗糖添加量6.90%，菌种接种量0.002 8%，发酵时间6.52 h。在此优化条件下，感官评分理论值为8.999分，蛋白质含量理论值为3.09 g/100 g。考虑到实际操作可行性，将优化工艺条件调整为：百香果汁添加量5%，蔗糖添加量7%，菌种接种量0.003%，发酵时间6.5 h。在此优化条件下进行3次平行验证试验，感官评分实际值为8.96；蛋白质含量实际为3.08 g/100 g，与预测值接近，说明该模型可以用于优化此乳饮料工艺条件。
2.3 抗氧化性的测定
乳饮料发酵前后的抗氧化性测定结果见图3。由图3可知，黑枸杞百香果乳饮料在发酵前和发酵后对DPPH·清除率均随着体积分数的增大而增大，呈现正相关的量效关系，原红霞等[26]提炼花青素的抗氧化性与浓度之间亦是线性的量效关系。由图3还可以看出，发酵后对DPPH·清除率比发酵前有提升，这是因为发酵过程花青素含量虽然没有变化[27]，但是发酵却引起了异黄酮和酚类物质的增加[28]，因此发酵促使乳饮料对DPPH·清除率提升，发酵液发酵前和发酵后对DPPH·的清除率分别达到71.5%和73.7%。
图3 黑枸杞百香果乳饮料对DPPH自由基清除率的清除效果
Fig.3 DPPH free radical scavenging effect of black wolfberry passion fruit milk beverage
2.4 黑枸杞百香果乳饮料品质
感官品质：黑枸杞百香果乳饮料有百香果和黑枸杞的清香，并且有乳饮料特有的风味，有均匀的淡黄色，有光泽，酸甜合适，入口有黑枸杞百香果清香，质地均匀，良好，无乳清。符合国标要求。
理化指标：脂肪3.35 g/100 g蛋白质3.08 g/100 g，酸度75.5 T°，亚硝酸盐0.003 86 g/100 g，乳酸菌1.36×109 CFU/mL，乳糖4.86 g/100 g，非脂乳固体7.8 g/100 g，灰分0.623 g/100 g，总固形物含量18.23 g/100 g。三聚氰胺未检出。
微生物指标：大肠菌群及致病菌未检出。
黑枸杞百香果乳饮料的感官、理化及微生物指标均符合国标GB 19302—2010《饮料》的要求。
3 结论
以百香果、黑枸杞和纯牛奶为原料制备乳饮料，利用单因素、模糊数学评价和响应面法，优化黑枸杞百香果乳饮料的工艺条件，并测定其抗氧化性。黑枸杞百香果风味乳饮料的最佳工艺条件为：纯牛奶77%，百香果汁5%，黑枸杞汁11%，蔗糖7%，增稠剂0.06%，菌种0.003%，发酵时间6.5 h。此优化条件下，乳饮料感官评分8.96分，蛋白质含量3.08 g/100 g。抗氧化性结果表明，黑枸杞百香果乳饮料发酵后对DPPH·的清除率为73.7%，具有一定的抗氧化性能。微生物和理化检测结果为均符合国标相关要求。此配方得到的乳饮料呈淡黄色，具有良好的组织状态，无乳清析出，不分层，具有百香果和黑枸杞的清香，并具有乳饮料特有的风味，酸甜比例合适。
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