玉米须(Stigma maydis)是玉米的花柱和柱头,大部分的玉米须通过烧掉或废弃扔掉等方式进行处理,不仅造成了极大的环境污染,同时也带来了有效资源的浪费[1]。玉米须中含有很多生理活性物质,包括黄酮类化合物[2-3]、花青素[4]、多糖[5-6]、甾醇[7]等。玉米须多糖具有保护肠道[8]、抗氧化[9]、降血糖[10-11]、抗肿瘤[12]等生理功能。
目前,关于玉米须多糖的提取方法研究较多,有化学法[13-14]、物理法[15-16]、物理或化学辅助生物酶法[17]。而生物发酵法制备玉米须多糖目前鲜见报道,生物发酵法是利用菌株发酵产生的淀粉酶、蛋白酶等水解原料中淀粉、蛋白质为微生物的生长代谢提供碳源和氮源,同时生成纤维素酶等代谢产物,得到多糖。食用菌是公认的安全菌株,食用菌生长过程中可生成淀粉酶,蛋白酶等多种酶系。淀粉酶和蛋白酶利用原料中的淀粉和蛋白质,为微生物的生长繁殖提营养物质,提高了原料的利用率。同时,它使得微生物产酶与酶解过程合二为一,省去了酶解反应过程中的分离纯化过程[18]。由于食用真菌“药食同源”的特点,利用食用真菌发酵制备多糖已经成为研究热点。董玉玮等[19]利用固体发酵灵芝产多糖,得到多糖含量为24.85 mg/g。HU W等[20]对猴头菇发酵菌丝体的多糖进行纯化。
本研究玉米须为原料,以黑木耳(Auricularia auricula)为菌株,采用液体发酵制备玉米须多糖,通过单因素试验和响应面试验优化其发酵工艺条件,并考察玉米须多糖清除羟基自由基及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基能力,为提高玉米须资源的附加值,为其深度开发利用提供理论依据。
1.1.1 原材料
黑木耳(Auricularia auricula)、马铃薯、玉米须(自然晾干,粉碎,过100目):市售。
1.1.2 化学试剂
葡萄糖、酵母粉、磷酸二氢钾、硫酸镁,维生素B1(vitamin B1,VB1)、维生素C(vitamin C,VC)、乙醇、氯化亚铁、3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)、苯酚、浓硫酸、柠檬酸、氢氧化钠(均为分析纯):北京化工厂;溴化钾(分析纯):上海源叶生物科技有限公司;水杨酸(分析纯):国药集团化学试剂有限公司;DPPH(分析纯):上海瑞永生物科技有限公司。
1.1.3 培养基
菌种培养基:200 g马铃薯切块,加水煮沸30 min,过滤,滤液中添加15 g葡萄糖,充分溶解后过滤,加水定容至1 L,分装,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
发酵培养基:取10 g粉碎玉米须置于1 L蒸馏水中,调节pH值为6.0,50 ℃保温2 h,添加30 g葡萄糖、4 g酵母粉、1 g KH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O和0.1 g VB1。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
BSA224S电子天平:赛多利斯科学仪器有限公司;MLS-37型高压蒸汽灭菌锅:日本SANYO公司;HZQ全温振荡器:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;BCN-1360净化工作台:上海新苗医疗器械制造有限公司;Cary 300 scan紫外可见分光光度计:美国瓦里安VARIAN公司;VERTEX70傅里叶红外光谱仪:德国Bruker公司。
1.3.1 玉米须粗多糖的制备
母种培养液的制备:向装液量为50 mL/250 mL的菌种培养基中接种质量为1 g的菌株,在温度25 ℃,摇床转速100 r/min条件下培养5 d,得到母种培养液。
发酵液的制备:在装液量为60 mL/250 mL的发酵培养基中接种一定量的母种培养液,在设定的温度下、摇床转速100 r/min培养一定的时间。
玉米须粗多糖的制备:将发酵液冻干,得到玉米须粗多糖。
1.3.2 分析检测
(1)发酵液中多糖含量测定[21]
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。配制0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液,分别吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL及0.5 mL葡萄糖标准溶液,各试管用蒸馏水补至1.0 mL。加入0.5 mL 6%的苯酚溶液和2.5 mL的浓硫酸后振荡混匀,静置冷却30 mL,以蒸馏水1 mL同等操作为空白对照,于波长490 nm处测定吸光度值。以葡萄糖质量浓度(x)为横坐标,吸光度值(y)为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。得到标准曲线线性回归方程:y=0.024 7x+0.018 7,相关系数R2=0.994 7。
将发酵液根据标准曲线的方法进行处理。于波长490nm处测定吸光度值,代入葡萄糖标准曲线回归方程中计算多糖含量。
(2)发酵液中纤维素酶活性测定[22]
纤维素酶可以水解玉米须中的纤维素,有利于多糖的溶出,因此纤维素酶活也是一个重要指标。
取50 mg滤纸,剪碎后加至4.0 mL 0.1 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 5.0)中,加热至50 ℃;添加1 mL发酵液于混合物中,50 ℃水浴保持2 h,采用加热法终止酶反应(95 ℃、10 min);冷却后用DNS比色法测定酶解液中还原糖增加量。纤维素酶酶活定义:1 mL粗酶液单位时间(1 min)内50 ℃水解滤纸产生l μmol葡萄糖定义为一个酶活单位(U/mL)。
纤维素酶酶活计算公式如下:
式中:X为试样纤维素酶的活性,U/g;m为根据标准曲线方程上计算得到的的葡萄糖的质量,mg;M为葡萄糖的摩尔质量,180.2 g/mol;t为酶解反应时间,min;1 000为单位换算因子,1 mmol=1 000 μmol;n为稀释倍数。
(3)粗多糖红外光谱分析[19]
取2 mg冻干后的玉米须粗多糖样品,加入200 mg kBr充分研磨后,进行压片,在波数400~4 000 cm-1范围内用红外光谱仪进行扫描。
1.3.3 发酵工艺优化
(1)单因素试验
以接种量7%,发酵温度25 ℃,发酵时间6 d为基础培养条件,分别单独考察接种量(3%、5%、7%、9%、11%)、发酵温度(15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃)和发酵时间(2 d、4 d、6 d、8 d和10 d)对发酵液中多糖含量和纤维素酶活的影响。
(2)响应面试验
利在单因素试验的基础上,以发酵液中多糖含量(Y)为响应值,采用Design-Expert8.0.6软件对接种量(A)、发酵温度(B)和发酵时间(C)3个因素进行响应面设计,Box-Behnken试验设计因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments
1.3.4 玉米须粗多糖的抗氧化活性测定
(1)对·OH的清除作用
于10mL具塞试管中依次加入2mL质量浓度为1mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL的样品溶液、0.5 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、0.5 mL 9 mmol/L FeCl2溶液、6.5 mL去离子水和0.5 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液,混合均匀,37 ℃水浴反应1 h,反应结束后以蒸馏水调零,在波长510 nm处测吸光度值,以VC作为阳性对照[23]。·OH的清除率计算公式如下:
式中:A1为样品溶液的吸光度值;A2为去离子水代替FeCl2的吸光度值;A3为去离子水代替样品溶液的吸光度值。
(2)对DPPH·的清除作用
于试管中加入2 mL质量浓度分别为1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL的样品溶液和2 mL 0.5 mmol/L的DPPH溶液(以体积分数95%乙醇配制),混匀后,室温下避光反应30 min,反应结束后在波长517 nm处测定吸光度值。以VC作为为阳性对照。DPPH·的清除率计算公式如下[24]:
式中:A1为样品溶液的吸光度值;A2为体积分数95%乙醇代替DPPH溶液的吸光度值;A3为去离子水代替样品溶液的吸光度值。
1.3.5 数据处理
利用SPSS 21.0进行数据分析,采用Design-Expert 8.0.6进行响应面试验设计,采用Origin 2018作图。
2.1.1 接种量对多糖含量和纤维素酶活的影响
对黑木耳进行母种培养后,在装液量为60 mL/250 mL的三角瓶中分别接种3%、5%、7%、9%和11%的母种培养液,25 ℃摇床培养(100 r/min)6 d,测定发酵液中多糖含量和纤维素酶活的结果见图1。
图1 接种量对多糖含量和纤维素酶活的影响
Fig.1 Effect of inoculum on polysaccharide content and cellulase activity
由图1可知,随着接种量在3%~11%范围内的增加,多糖的含量和纤维素酶活均呈现先增加后减小的趋势。当接种量为3%~7%时,多糖含量和纤维素酶活均随之升高;当接种量为7%时,糖含量和纤维素酶活分别为12.2 mg/L和117.5 U/L,均达最大值;当接种量>7%之后,多糖含量和纤维素酶活有所下降。这可能是由于当接种量增加到一定程度时,可以利用的玉米须发酵培养基中的碳源、氮源、无机盐等营养物质有限,不利于发酵代谢产物的产生[25]。因此,选择最佳接种量为7%。
2.1.2 发酵温度对多糖含量和纤维素酶活的影响
温度是影响微生物生长、代谢产物积累的主要因素之一,而且,温度还会影响酶的活性,影响酶促反应的进行,最终影响代谢产物的合成。对黑木耳进行母种培养后,在装液量为60 mL/250 mL的三角瓶中接种7%的母种培养液,发酵温度分别为15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃的条件下摇床培养(100 r/min)6 d,测定发酵液中多糖含量和纤维素酶活的结果见图2。
图2 发酵温度对多糖含量和纤维素酶活的影响
Fig.2 Effect of fermentation temperature on polysaccharide content and cellulase activity
由图2可知,随着发酵温度在15~35 ℃范围内的升高,多糖的含量和纤维素酶活均呈现先增加后减小的趋势。当发酵温度为15~25 ℃时,多糖含量和纤维素酶活均随之升高;当发酵温度为25 ℃时,多糖含量和纤维素酶最高,分别为12.52 mg/L和126.4 U/L;当发酵温度高于25 ℃之后,多糖含量和纤维素酶活有所下降。因此,选择最佳发酵温度为25 ℃。
2.1.3 发酵时间对多糖含量和纤维素酶活的影响
对黑木耳进行母种培养后,在装液量为60 mL/250 mL的三角瓶中接种7%的母种培养液,在温度为25 ℃的条件下摇床(100 r/min)分别培养2 d、4 d、6 d、8 d和10 d,测定发酵液中多糖含量和纤维素酶活的结果见图3。
图3 发酵时间对多糖含量和纤维素酶活的影响
Fig.3 Effects of fermentation time on polysaccharide content and cellulase activity
由图3可知,随着发酵时间在2~10 d范围内延长,多糖含量和纤维素酶活均呈先增加后减小的趋势。当发酵时间为2~6 d时,多糖含量和纤维素酶活均随之升高;当发酵时间为6 d时二者达到峰值,分别为12.5 mg/L和121.7 U/L;当发酵时间超过6 d之后,多糖含量和纤维素酶活均有所下降。发酵初期营养充足,多糖逐渐积累,发酵后期营养匮乏,生长环境改变,菌体进入衰亡期,酶活降低,代谢产物不再积累。因此,选择最佳发酵时间为6 d。
基于单因素试验结果,以多糖含量(Y)作为响应值,选取接种量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)为自变量,进行响应面分析,试验设计结果见表2,方差分析见表3。
表2 Box-Behnken试验设计及结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注:“**”表示对结果影响极显著(P<0.01);“*”表示对结果影响显著(P<0.05)。
将表2试验数据采用Design Expert 8.0.6软件进行非线性多元回归统计分析,建立二次多项式的拟合,得到回归方程如下:Y=12.4+0.7A+0.83B+0.47C+0.075AB+1.03AC-0.52BC-1.56A2-1.46B2-0.66C2。
由表3可知,此模型回归显著(P<0.000 1),失拟项不显著(P>0.05),决定系数R2为0.971 4,表明97.14%试验结果能由此方程解释,校正决定系数R2adj为0.934 7,反映了93%左右的多糖含量变异散布于接种量、发酵温度及发酵时间3个因素内,说明模型拟合度较好[24]。变异系数(coefficient of variation,CV)为3.83%,该值反映每个平均值相对偏离情况,试验稳定性越好CV值越小,因此可以看出本试验具备相对高的置信度及可靠性。综上分析,该响应面试验可以用于黑木耳发酵玉米须制备多糖的参数预测。由表3中F值可知,影响多糖含量的主次顺序为:B(发酵温度)>A(接种量)>C(发酵时间)。由P值可知,一次项A、B,交互项AC及二次项A2、B2对响应值影响作用均达极显著水平(P<0.01),一次项C,交互项BC及二次项C2对响应值影响作用均达显著水平(P<0.05)。
2.3 响应面曲面图分析
运用Design-Expert 8.0.6软件得到各因素交互作用对多糖含量影响的响应面及等高线见图4。3个响应面曲面均为凸形,发酵过程中的参数变化对多糖含量会产生不同的影响。在所选取的试验范围内,响应值存在极大值,可以模拟出该试验的最优条件,响应面越陡,反映出各因素之间的两两交互作用越显著。由图4a可知,接种量和发酵温度的曲面图较平缓,因素间交互作用较小,由图4b和4c可知,发酵时间和接种量、发酵温度和发酵时间的曲面图较陡,交互作用对结果影响显著(P<0.05),这与方差分析结果一致。随着发酵时间的增大,多糖的含量先增加,而后在较高接种量时,增幅不大。
图4 各因素交互作用对多糖含量影响的响应面及等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on polysaccharide content
由Design-Expert 8.0.6软件得出最佳发酵工艺条件为:接种量8%、发酵温度26 ℃、发酵时间7 d。在此条件下得到玉米须多糖含量理论值为12.77 mg/L。此优化条件下进行3次平行验证试验,得到多糖含量实际值为13.12 mg/L,与理论值12.77 mg/L接近,其发酵液中纤维素酶的活力为130.7 U/L,说明该模型能较好地预测实际多糖含量。
由图5可知,波数3 392 cm-1处的宽吸收峰在3 200~3600cm-1范围内,为饱和的O-H伸缩振动区域,波数2929cm-1的吸收峰在2 800~3 000 cm-1范围内,为饱和C-H伸缩振动吸收峰;波数1 200~1 400 cm-1范围内出现的吸收峰属于C-H的变角振动,波数1 632 cm-1处吸收峰为C=O的非对称伸缩振动吸收峰,波数1 421 cm-1附近吸收峰为C-H的变形振动吸收峰[26],这些区域所出现的峰均为糖类的特异吸收峰。
图5 玉米须粗多糖的红外光谱测定结果
Fig.5 Determination results of infrared spectrum of Stigma maydis crude polysaccharide
由图6a可知,玉米须粗多糖对·OH的清除能力存在浓度依赖关系,在10 mg/mL的质量浓度时,多糖对·OH的清除能力与0.1 mg/mL VC持平。玉米须粗多糖对·OH的最大清除率为40%左右。由图6b可知,黑木耳发酵玉米须多糖清除DPPH·的能力较强,但弱于VC。质量浓度在1~10 mg/mL范围内,多糖的清除能力与溶液质量浓度成正比例关系,在多糖质量浓度为10 mg/mL时,其清除率为43.3%。
图6 玉米须粗多糖对·OH(a)和DPPH·(b)的清除能力
Fig.6 Scavenging ability of Stigma maydis crude polysaccharide on·OH (a) and DPPH·(b)
在单因素试验的基础上对黑木耳发酵玉米须的工艺条件进行优化,优化发酵工艺条件:接种量为8%、发酵温度为26 ℃、发酵时间为7 d。此优化条件下,多糖含量为13.12 mg/L,其发酵液中纤维素酶的活力为130.7 U/L,说明该模型能较好地预测实际提取量。并对得到的多糖进行红外光谱分析和抗氧化能力分析,结果表明其红外谱图具有糖类物质的特征吸收峰,且多糖对羟基(OH)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基最大清除率分别为34.5%和43.3%,后续研究可以对粗多糖对进行纯化,以提高其抗氧化活性。
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Optimization of fermentation technology and antioxidant activity of Stigma maydis polysaccharide