木聚糖是植物半纤维素的一种主要组成成分，是除纤维素外自然界含量最丰富的多糖，降解后可产生低聚木糖及其他小分子物质应用于工业生产[1]。木聚糖结构复杂，主链以β-1,4-D糖苷键连接木糖而成，侧链主要由O-乙酰基、β-L-阿拉伯呋喃甲酰基、葡萄糖醛基、4-甲基葡糖醛基以及酚酸等构成[2]。木聚糖的完全降解需要多种酶如木聚糖酶、α-L-阿拉伯糖苷酶以及α-D葡糖苷酸酶等酶系相互协同作用[3]。其中，木聚糖酶可作用于木聚糖β-1,4-糖苷键，将其水解为木糖、木二糖、木三糖等其他低聚木糖，对木聚糖的解聚起着主要作用[4]。木聚糖酶也是一种重要的工业酶制剂，在纸浆漂白、食品和饲料加工等工业领域有着广阔的应用前景[5]。木聚糖酶往往需要在极端的环境下参与工业化生产进程，如高温、强酸强碱、高盐等环境，而大多数天然木聚糖酶在极端环境下稳定性较差，从而限制了木聚糖酶的使用范围[6]。热稳定性一直都是木聚糖酶工业化应用的一种限制性因素，如在饲料加工过程中，木聚糖酶作为饲料添加剂需要一个高温处理的过程[7]。自然界大多数木聚糖酶属于中温木聚糖酶，热稳定性较差，难以满足工业需求，为了解决这一问题，诸多研究者对木聚糖酶进行研究，以提高木聚糖酶热稳定性[8]。如刘回民等[9]对玉米半胱氨酸蛋白酶进行W308C突变，获得突变体W308C，该突变体在70 ℃保温120 min仍能保持15%左右的酶活性，而野生型在10%左右，催化活性也提高了86%。李同彪等[10]对来源于黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S的木聚糖酶XynZF-2 N-端进行定点突变，得到突变体XynZF-2V1C，该突变体最适温度为50 ℃，比野生型提高了10 ℃，酶活性半衰期t1/245℃提高了10 min。蔡刘滕子等[11]对黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S木聚糖酶XynZF-2进行定点突变，构建突变体XynCDH（V1C/G116D/N171H），该突变体比野生型XynZF-2最适温度提高了5 ℃，酶活性半衰期t1/240℃、t1/245℃分别提高了5 min和8 min。以上研究表明，定点突变引入半胱氨酸（Cysteine，Cys）对酶的酶学性质改变有较大的影响。
本研究利用快速定点突变技术，在溶糖曲霉（Aspergillus saccharolyticus）JOP1030-1木聚糖酶XynASP的Loop结构第95位点引入半胱氨酸（Cys），获得突变基因xynN95C，构建重组表达载体，在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中异源表达，并进行酶学性质分析，旨在获得热稳定性有所改良的木聚糖酶突变体，探究Loop结构引入半胱氨酸对木聚糖酶热稳定性的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种与质粒
大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）和大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α：瑞士Novagen公司。
重组质粒pET-28a-xynASP：由Sangon公司合成，本实验室保存。
1.1.2 试剂
T4脱氧核糖核酸连接酶（T4 deoxyribonucleic acid ligase，T4 DNA Ligase）、限制性内切酶DpnⅠ、异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）：日本TaKaRa公司；榉木木聚糖：德国Sigma公司；DNA Marker、DNA质粒提取试剂盒、Ni-NTA蛋白纯化试剂盒（NO.C600332）、酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、琼脂、甘油（均为生化试剂）：生工生物工程（上海）有限公司；DNA片段回收试剂盒：北京鼎国昌盛生物技术公司。
1.1.3 培养基
LB液体培养基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.4。
LB固体培养基：LB液体培养基中添加20 g/L琼脂。TB培养基：胰蛋白胨14 g，酵母提取物27 g，甘油9 mL，蒸馏水1 000 mL。
以上培养基均于121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
T100梯度聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪：美国Bio-Rad公司；DYY-6C电泳仪：北京六一生物科技有限公司；XMTE-3102恒温摇床：江苏科析仪器有限公司；SIGMA 3-18K型冷冻高速离心机：北京金运创新科技发展有限公司；DSX-18L高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂。
1.3 方法
1.3.1 重组木聚糖酶XynASP同源建模及模型优化评估
将重组木聚糖酶的XynASP 氨基酸序列提交至SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/），进行同源建模，并利用Discovery Studio进行模型优化。同时，利用Ramanchandran Plot评估二面角以及Profile-3D评估氨基酸匹配度。
1.3.2 定点突变
基于快速定点突变策略[12]设计定点突变引物（表1），以重组质粒pET-28a-xynASP为模板，利用单点突变引物进行重叠延伸聚合酶链式反应（gene splicing by overlap extension polymerase chain reaction，SOE PCR）法扩增[13]，构建重组突变质粒pET-28a-xynN95C。再将重组质粒用化学法转入大肠杆菌DH5α，经卡那霉素（kalamycin，Kan）抗性筛选后，挑选出阳性单克隆子[14]，送Sangon公司进行基因测序。
表1 引物序列
Table 1 Sequences of primer
注：下划线为突变位点。
1.3.3 重组木聚糖酶诱导表达及纯化
将测序正确的克隆子提取质粒，化学法转入大肠杆菌BL21（DE3），构建大肠杆菌基因工程菌[15]，挑取单克隆子接种于2mL的LB液体培养基（含Kan终质量浓度为50μg/mL），37 ℃、180 r/min过夜培养[16]，转接于TB培养基，37 ℃、180 r/min培养3 h，加入IPTG（终浓度为2 mmol/L），30 ℃、180 r/min诱导2 h。诱导结束后，6 000 r/min离心10 min，收集菌体，加入10 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液重悬后，进行细胞破碎（细胞破碎条件：5 s，间隙时间：5 s，工作总时间：7 min，频率：10%），破碎后将细胞破碎液分装于2 mL离心管中离心（11 000 r/min、4 ℃、20 min），取上清液用作粗酶[17]。
利用Ni-NTA蛋白纯化试剂盒对重组木聚糖酶进行纯化[18]，纯化步骤参照试剂盒说明书。以10%分离胶和5%浓缩胶对纯化后的重组木聚糖酶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）检测分析[19]。
1.3.4 重组木聚糖酶酶活性测定
采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法进行木聚糖酶活性测定[20]，取1.5 mL 0.5%的榉木木聚糖和1 mL适当稀释的酶液在适当温度下反应15 min，加入2.5 mL DNS终止反应，水浴煮沸反应7 min；冷却后加5 mL双蒸水（ddH2O），振荡混匀，于波长540 nm处测定吸光度值。
木聚糖酶的活力单位定义：在上述测定活性条件下，每分钟水解木聚糖生成1 μmol木糖所需要的酶量，U。
1.3.5 酶学性质测定
重组木聚糖酶最适温度及热稳定性测定：采用DNS法，在35～60 ℃条件下测定野生型XynASP和突变体XynN95C酶活性，以最高酶活性为100%，计算各温度条件下酶的相对酶活性。将野生型XynASP和突变体XynN95C分别在35 ℃和40 ℃保温1 h，每隔10 min取样，在各自最适温度下测定残余酶活性，以未保温酶的酶活性为100%，计算不同保温时间下酶的残余酶活性。
重组木聚糖酶最适pH及pH稳定性测定：采用DNS法，在最适反应温度下，分别测定pH 3.0～8.0条件下野生型XynASP和突变体XynN95C酶活性，以最高酶活性为100%，计算各pH值条件下酶的相对酶活性。酶在不同pH条件下，35 ℃保温1 h后测定残余酶活性，以未保温酶的酶活性为100%，计算不同pH条件下酶的残余酶活性。
重组木聚糖酶金属离子及有机溶剂耐受性测定：野生型XynASP和突变体XynN95C金属离子及有机溶剂耐受性测定方法参照文献[21]。
2 结果与分析
2.1 重组木聚糖酶XynASP三维结构建立及突变位点确定
利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）对重组木聚糖酶XynASP进行同源建模。将建模结构提交至Discovery Studio进行优化，优化后模型见图1。
图1 木聚糖酶XynASP三维结构模型
Fig.1 Three-dimensional structure model of xylanase XynASP
图中棒状结构表示催化残基Glu110和Glu201。
由图1可知，XynASP空间结构主要由一个α-螺旋和两个反向平行的β-折叠片层构成，呈右手半握状结构，催化残基由谷氨酸（glutamic acid，Glu）110和谷氨酸（Glu）201组成，属于GH11家族木聚糖酶。XynASP的结构模型经Ramanchandran Plot评估得出该模型中95%氨基酸的二面角在允许的区域内，且有90%的氨基酸在最适区域内，经Profile-3D评估发现模型与自身氨基酸序列匹配度较高，匹配度得分为110.43，远高于期望值（87.06），并且发现模型中氨基酸相容性得分（verify score）均在“0线”以上，表明构建的XynASP模型的氨基酸空间构象合理（图2）。以上评估结果说明该建模结构的可信度高，可用于XynASP热稳定性分子理性设计的可靠结构。
图2 基于Ramanchandran Plot（a）、Profile-3D（b）XynASP模型评估结果
Fig.2 Evaluation results of XynASP model based on Ramanchandran Plot (a) and profile-3D (b)
利用DNAMAN6.0以及DS Client 2016对木聚糖酶XynASP氨基酸序列以及结构分析。同时，利用氨基酸结构相似性，将第95位点的天冬酰胺（asparagine，Asn）替换为半胱氨酸（Cys），构建突变体XynN95C。
2.2 快速定点突变和重组木聚糖酶表达及纯化
以重组质粒pET-28a-xynASP为模板，利用引物N95C-F和N95C-R进行PCR扩增突变质粒pET-28a-xynN95C，经限制性内切酶Dpn I消化模板，化学法转入大肠杆菌DH5α，经Kan抗性筛选后，挑取阳性单克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因测序，测序结果见图3。
由图3可知，经过测序发现，原来第95位点的天冬酰胺密码子AAC突变成半胱氨酸密码子TGT，因此基因突变成功。将重组大肠杆菌工程菌BL21/pET-28a-xynASP和BL21/pET-28a-xynN95C分别进行蛋白诱导表达，经超声波破碎细胞获得粗酶液，并利用Ni-NTA蛋白纯化试剂盒获得纯化的重组木聚糖酶，对重组木聚糖酶粗酶液和纯化后的酶液进行SDS-PAGE电泳，结果见图4。
图3 突变质粒pET-28a-xynN95C测序结果
Fig.3 Sequencing results of mutated plasmid pET-28a-xynN95C
红色方框表示突变密码子。
图4 重组木聚糖酶XynASP和XynN95C的SDS-PAGE分析结果
Fig.4 SDS-PAGE analysis results of the recombinant xylanase XynASP and XynN95C
M表示蛋白质Marker，1表示突变体XynN95C的粗酶液；2表示野生型XynASP的粗酶液；3表示突变体XynN95C的纯酶液；4表示野生型XynASP的纯酶液。
由图4可知，野生型XynASP和突变体XynN95C的粗酶液和纯酶液均在27 kDa处有明显条带，且纯化后的蛋白样品纯度较高，达到了电泳纯，可满足酶学性质分析要求。
2.3 酶学性质比较与分析
2.3.1 温度对野生型XynASP与突变体XynN95C酶活性的影响
由图5可知，野生型XynASP最适温度为45 ℃，突变体XynN95C最适温度为50 ℃，相比野生型（45 ℃）提高了5 ℃。测定重组木聚糖酶热稳定性发现，在35 ℃保温60 min后，野生型XynASP和突变体XynN95C均保留较高的稳定性。突变体XynN95C的残余酶活性为91.2%，相比于野生型（87.5%）略有提高；40 ℃保温20 min后，野生型XynASP相对酶活性明显下降，仅保留了50.6%的残余酶活性，而突变体XynN95C残余酶活性仍高达77.56%；40 ℃保温40 min后，突变体XynN95C仍保留了54.6%的残余酶活性，而野生型残余酶活性下降到了41.0%。
图5 野生型XynASP和突变体XynN95C最适温度比较
Fig.5 Comparison of optimum temperature between the wild-type XynASP and mutant XynN95C
由图6可知，突变体XynN95C的半衰期t1/240℃为38 min，相比野生型提高了18 min。由此表明，突变体XynN95C热稳定性相比野生型XynASP明显提高。
图6 野生型XynASP和突变体XynN95C热稳定性比较
Fig.6 Comparison of thermal stability between the wild-type XynASP and mutant XynN95C
2.3.2 突变体XynN95C与野生型XynASP最适pH及pH稳定性比较
由图7可知，在pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0条件下，野生型XynASP的最适pH为6.0，突变体XynN95C的最适pH为5.0。相比野生型，突变体XynN95C的最适pH有所降低，更偏酸性。
图7 突变体XynN95C与野生型XynASP最适pH比较
Fig.7 Comparison of optimum pH between mutant XynN95C and wild-type XynASP
由图8可知，在pH 3.0～8.0条件范围内，野生型XynASP与突变体XynN95C残余酶活性均在40.0%～80.0%之间，突变体XynN95C对于酶的pH稳定性没有明显改善。
图8 突变体XynN95C与野生型XynASP pH稳定性比较
Fig.8 Comparison of pH stability between mutant XynN95C and wild type XynASP
2.3.3 突变体XynN95C与野生型XynASP金属离子和有机溶剂稳定性比较
由图9可知，在40 ℃条件下，将金属离子（K+、Na+、Fe2+、Cu2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe3+）分别与野生型XynASP和突变体XynN95C保温1 h，测定重组木聚糖酶酶活性，以不加金属离子的重组木聚糖酶酶活性为100%，分析金属离子对野生型XynASP和突变体XynN95C酶活性影响，结果见图9。由图9可知，K+、Na+和Mg2+对野生型XynASP的酶活性有明显的激活作用，相对酶活性分别为112.1%、108.8%和120.9%，而Fe3+对野生型XynASP酶活性有明显抑制作用。其他金属离子对野生型XynASP的酶活性基本没有影响。突变体XynN95C酶活性受Cu2+的影响较大，表现出较大的抑制作用，相对酶活性为52.2%。值得关注的是，Fe3+处理后，突变体XynN95C相对酶活性高达93.9%，而野生型XynASP相对酶活性为65.9%。由此得出，突变体XynN95C对Fe3+有较高的耐受性。
图9 突变体XynN95C与野生型XynASP金属离子稳定性比较
Fig.9 Comparison of metal ions stability between mutant XynN95C
and wild-type XynASP
由图10可知，通过分析不同浓度的有机溶剂（甲醇、乙醇和异丙醇）对野生型XynASP和突变体XynN95C酶活性影响发现，随着甲醇、乙醇和异丙醇浓度的增加，野生型XynASP和突变体XynN95C对这三种有机溶剂的耐受性均有所下降，且突变体XynN95C下降的更为明显。
图10 突变体XynN95C与野生型XynASP有机溶剂稳定性比较
Fig.10 Comparison of organic solvent stability between mutant XynN95C and wild-type XynASP
2.3.4 重组木聚糖酶结构分析
以野生型XynASP三维结构为模板，对突变体XynN95C同源建模，并进行结构比对分析，结果见图11。
图11 野生型XynASP和突变体XynN95C结构比对
Fig.11 Structure alignment of wild-type XynASP and mutant XynN95C
图中蓝色cartoon表示野生型XynASP结构，绿色cartoon表示突变体XynN95C结构，黄色棒状表示野生型中残基Asn95，绿色棒状表示XynN95C中残基Cys95，红色箭头表示突变体
XynN95C结构偏移方向。
由图11可知，突变体XynN95C由于第95位点天冬酰胺（Asn）突变成半胱氨酸（Cys），使得第95位点附近结构向活性中心内发生一定的偏移，且第95位点结构由原来的Loop结构进一步演变成β-折叠，相比柔性较大的Loop结构更加稳定，因此，这就可能导致蛋白结构更加的稳定，从而改善了酶的热稳定性。
2.4 讨论
由于GH11家族木聚糖酶对木聚糖有较高的特异性，催化效率较高，专一性强，可以更多地应用于食品、纺织、饲料和制浆等工业，获得更多有价值的产品[22-23]。随着木聚糖酶工业应用环境的不断拓展，木聚糖酶性能的改善引起了研究者的重视，尤其是木聚糖酶热稳定性的改善。很多研究者通过定点突变技术对木聚糖酶进行热稳定性分子改造，获得可喜的成就，并为后续木聚糖酶热稳定性分子改造提供了方向，如陈亚文等[24]在黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S木聚糖酶XynZF-2 N-端引入半胱氨酸，得到的突变体Xyn-E27C最适温度相比野生型提高了5 ℃，且半衰期t1/245℃增加了17 min，酶的热稳定性得到了很大提高。由此可见，在木聚糖酶N-端引入半胱氨酸对木聚糖酶的热稳定性有一定的影响[25]。
3 结论
本研究以溶糖曲霉（Aspergillussaccharolyticus）JOP1030-1木聚糖酶XynASP为研究对象，在其Loop结构中引入半胱氨酸（Cys），进行N95C定点突变，获得突变体XynN95C，并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，通过酶学性质分析，突变体XynN95C最适温度相比野生型XynASP提高5 ℃，半衰期t1/240℃为38 min，相比野生型提高了18 min，热稳定性大大提高，且最适pH从6.0降至5.0。突变体XynN95C结构相比野生型发生一定的改变，第95位点结构由原来的Loop结构变成β-折叠，导致该部位更加的稳定，进而改善了XynASP的热稳定性。由此得出，在Loop结构引入半胱氨酸也可提高木聚糖酶的热稳定性，为GH11家族木聚糖酶的热稳定性改造提供又一思路。
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