黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）是一种新兴小浆果果树，为蔷薇科腺肋花楸属多年生落叶灌木，俗称不老莓[1]。果实为紫黑色球形小浆果，口感酸涩[2]，果实中含有丰富的黄酮类和酚酸类物质，如原花青素、花青素、绿原酸等，具有较强的清除自由基和抗氧化活性的能力[3]，主要应用于酿酒、饮料、酵素等方面[4]，如干酒[5]、冰酒[6]、白兰地[7]等。关于黑果腺肋花楸酒的挥发性香气成分也有研究报道，魏春雨等[8]在添加不同酵母的黑果腺肋花楸酒中检验出77种挥发性物质，主要香气成分包括乙酸乙酯、乙酸异戊酯等；毛建利等[9]检测出黑果腺肋花楸酒中醇类物质含量最高，酯类物质对香气贡献最大，黑果腺肋花楸酒的主体香气物质是大马士酮、辛酸乙酯等。
波特酒是在葡萄酒发酵进行到一半时通过向基酒中添加葡萄蒸馏酒或白兰地使酵母的活动被迫受到抑制来终止发酵，使酒精度升到16%vol以上[10]，得到酒精度较高的强化型葡萄酒，酒精发酵停止后保留的高残糖和源自葡萄蒸馏酒的大量高级醇、酯、醛赋予了波特酒独特的风格[11-12]。MOREIRA N等[13]检测出年份波特酒中部分羰基化合物含量高，如丙醛、戊醛等，并随着年份的增长，其含量随着木桶中的老化而增加。目前市场上常见的波特酒大多部分是用酿酒葡萄单一或混合酿造，未经加工的新鲜黑果腺肋花楸果实因具有涩味而很少直接用于鲜食，作为酿酒原料也存在苦涩味重，风味不明显等问题。利用二者优势互补进行混酿，增进酒体的丰富性[14]，得到香气馥郁的波特酒[15]。
顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）结合全二维气相色谱-飞行时间质谱（comprehensive two-dimensional gas chromatograph/time of flight mass spectrometry，GC×GC-TOF-MS）技术应用于分析白酒的挥发性组分较多，葡萄酒方面应用较少[16-17]，该技术具有分辨率高、灵敏度高、分离效果好等特点，是实现复杂样品挥发性成分鉴定的有效工具[18]。
本研究以黑果腺肋花楸和赤霞珠为原料，在混合发酵过程中添加无核白、霞多丽、赤霞珠3种葡萄蒸馏酒终止酒精发酵，制备波特酒。采用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC-TOF-MS）技术测定3种黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒的挥发性香气成分，并对结果进行主成分分析（principal component analysis，PCA），对比3种黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒的香气特点，有助于增进对波特酒香气特点的认识，为波特酒终止发酵添加的葡萄蒸馏酒的选择提供科学依据。对开发特色加强型葡萄酒类新产品，在带动葡萄酒产业发展具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑果腺肋花楸，采收于2022年8月：新疆睿洋农业有限公司；酿酒葡萄赤霞珠，采收于2022年9月：新疆伊犁产区；果胶酶RF（酶活40 000 U/g）、葡萄酒活性干酵母CY3079：上海兔杰工贸有限公司；偏重亚硫酸钾（分析纯）：北京奥博星生物技术有限责任公司；蔗糖、乙醇（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；酒石酸（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；无核白、霞多丽、赤霞珠葡萄蒸馏酒（酒精度分别为64.03%vol、65.15%vol、61.10%vol）：实验室2020年11月酿制。
1.2 仪器与设备
WYT-4 型手持糖度计：泉州中友光学仪器有限公司；LAL2T酒精浓度计：广州市速为电子科技有限公司；JC-9320比重计：北京市宏海永昌仪表技术开发中心；LE203E/02分析天平：上海波博特勒-托利多仪器有限公司；7890A/Pegasus 4D全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪：美国LECO公司；7890A-5977MSD气相色谱-质谱联用仪、DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、DB-17HT色谱柱（2.0 m×0.1 mm×0.1 μm）：美国安捷伦公司；DC-12型氮吹仪：上海安谱科学仪器有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头：美国色谱科公司。
1.3 方法
1.3.1 波特酒加工工艺流程及操作要点
黑果腺肋花楸、赤霞珠→除梗破碎→添加偏重亚硫酸钾→添加果胶酶→调整成分→接种酵母→发酵→粗过滤→基酒→添加葡萄蒸馏酒终止发酵→过滤→灌装→波特酒成品
操作要点：对黑果腺肋花楸、赤霞珠挑选并去除坏果，因波特酒发酵时间较短，为充分提取果实中的色素和单宁采取手动破碎的方法破碎果实，以黑果腺肋花楸与赤霞珠1∶0.8质量比混合装于20 L不锈钢发酵罐中。取少量蒸馏水将偏重亚硫酸钾溶解加入静置2 h后，添加果胶酶浸渍处理24 h，再向发酵液中添加蔗糖调节发酵液可溶性固形物含量为24°Bx，接种活化好的葡萄酒干酵母进行发酵；由于波特酒的工艺特点为在发酵进行至一半时终止发酵保持高含糖量，在发酵至43 h，其酒精度达7.50%vol时进行粗滤，得到黑果腺肋花楸与赤霞珠混酿基酒，再向基酒中分别加入体积分数为28%的无核白、霞多丽、赤霞珠葡萄蒸馏酒来抑制酵母活性从而终止酒精发酵，由于此时含有较多的二氧化碳，静置24 h后用八层纱布进行过滤，灌装后置于0 ℃冷库保存，得到添加无核白、霞多丽、赤霞珠葡萄蒸馏酒的3种黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒，分别编号为WHB、XDL、CXZ。
1.3.2 理化指标的检测
波特酒的酒精度、总酸、挥发酸、还原糖、pH等理化指标根据国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]规定的方式执行。
1.3.3 挥发性香气成分测定
（1）顶空固相微萃取条件
新购买的萃取头先按照说明书在GC进样口270 ℃条件下活化1 h，使用前在GC进样口250 ℃条件下解吸8 min，以除去吸附的挥发性物质。取5 mL样品加1 g NaCl于顶空瓶中，加盖密封，使用萃取头DVB/CAR/PDMS对顶空瓶中的样品进行萃取。上机检测插入GC进样口，平衡时间15 min，萃取温度40 ℃，萃取时间30 min，解吸附时间5 min。
（2）气相色谱条件
进样口温度250 ℃；分流比5∶1；载气为氦气（H2）（纯度99.999%）；流量1 mL/min；柱温40 ℃保持1 min；以5 ℃/min升至130 ℃，以2 ℃/min升至160 ℃；以20 ℃/min升至240 ℃，保持7 min。二维柱温：始终高于第一维柱10 ℃调制解调器温度：始终高于第二维柱15 ℃；调制周期5 s；传输线温度270 ℃。样品运行采用恒流模式，载气为氦气（He）（纯度99.999%），流量1 mL/min。
（3）飞行质谱条件
电离方式为电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量为70 eV，温度为230 ℃，传输线温度为270 ℃。离子源温度：220 ℃；检测器电压：1 680 V；质量扫描范围：30～500 amu。采集频率为100 spectra/s。
（4）定性定量方法
根据美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）2014版质谱数据库鉴定得到的化合物，采用峰面积归一化法计算各成分的相对含量。参照ZHU S K等[20]筛选相似度＞80%的化合物作为初步鉴定结果，包括化合物名称、一维保留时间、相似度、化合物、峰面积和分子式等信息。
1.3.4 数据处理
采用MicrosoftOfficeExcel2016对数据进行整理，Origin 2021进行绘图，SPSS19.0进行显著性检验（P＜0.05）及主成分分析。
2 结果与分析
2.1 波特酒酒样理化指标检测结果
3种黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒酒样理化指标检测结果见表1。由表1可知，三款波特酒酒精度20.083%vol～20.63%vol，按制作工艺划分属特种葡萄酒；还原糖含量均＞45.0 g/L，按含糖量划分属甜型酒；总酸含量6.26～6.74 g/L，挥发酸含量0.45～0.71 g/L，各项理化指标均符合国标GB/T 15037—2006《葡萄酒》[21]规定要求。添加不同品种葡萄蒸馏酒波特酒的酒精度无显著性差异（P＞0.05），霞多丽蒸馏酒的酒精度在三种葡萄蒸馏酒中最高，故添加XDL波特酒的酒精度最高为20.63%vol。WHB和XDL波特酒的总酸和pH无显著差异（P＞0.05），但均显著低于CXZ波特酒（P＜0.05）。挥发酸主要是由酒精发酵，苹果酸-乳酸发酵，细菌污染引起的酸败引起[22]，XDL波特酒挥发酸含量低于其他两种，由于霞多丽葡萄蒸馏酒度数在三者之间较高，在终止发酵过程中较于其他两种蒸馏酒更快的延缓基酒中微生物活动[23]。3种波特酒的还原糖含量无显著差异（P＞0.05）。综上，根据理化指标分析得到CXZ波特酒较好。
表1 3种黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒酒样理化指标
Table 1 Physicochemical indexes of 3 kinds of Aronia melanocarpa and Cabernet Sauvignon port wine samples
注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
2.2 挥发性香气成分检测结果
2.2.1 添加不同品种葡萄蒸馏酒的波特酒挥发性香气成分分析
通过顶空固相微萃取（HS-SPME）结合全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪（GC×GC-TOF-MS）对黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒中香气成分进行检测和分析，3种黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒中挥发性香气成分相对含量测定结果见表2。由表2可知，在3款波特酒中共检出68种挥发性香气化合物，其中酯类25种、醇类21种、酸类7种、酮类6种、醛类4种、其他5种。WHB波特酒共检出挥发性物质50种，XDL波特酒共检出的挥发性物质49种，CXZ波特酒共检出的挥发性物质51种。
表2 3种黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒酒样香气成分相对含量检测结果
Table 2 Determination results of relative contents of aroma components in 3 kinds of Aronia melanocarpa and Cabernet Sauvignon port wine samples
续表
注：“-”表示未检测出。
3种黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒酒样挥发性香气物质种类和相对含量结果见图1。由图1可知，WHB波特酒检测出的主要挥发性物质共有50种，其中酯类15种、醇类18种、酸类6种，醛类3种、酮类5种、其他物质3种，分别占总挥发性香气成分的35.62%、52.92%、3.51%、4.03%、2.92%、1.00%。XDL波特酒检测出的主要挥发性物质共有49种，其中酯类19种、醇类18 种、酸类2种，醛类3种、酮类4种、其他物质3种，分别占总挥发性香气成分的34.89%、56.72%、1.32%、4.50%、1.42%、1.15%。CXZ波特酒检测出的主要挥发性物质共有51种，其中酯类15种、醇类18种、酸类6种，醛类3种、酮类5种、其他物质4种，分别占总挥发性香气成分的29.54%、56.32%、1.83%、6.09%、2.80%、3.42%。3种波特酒共存在34种相同的香气化合物，如乙酸乙酯、异戊醇、癸酸乙酯等。
图1 3种黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒酒样挥发性香气物质种类（a）和相对含量（b）
Fig.1 Types (a) and relative contents (b) of volatile aroma components in 3 kinds of Aronia melanocarpa and Cabernet Sauvignon port wine samples
2.2.2 添加不同品种葡萄蒸馏酒的波特酒挥发性香气成分比较
波特酒中的醇类物质来源于两个方面，一方面是基酒在发酵过程中由微生物作用于糖、果胶质、氨基酸产生的，一方面是通过添加葡萄蒸馏酒而赋予的高级醇，赋予了波特酒独特的风格。醇是酒体的基本组成成分，又是酒的醇甜和助香物质。当酒中高级醇与酸类、酯类物质含量配比恰当，有助于酒的呈香，若过量会影响产品质量[28]。醇类物质多具有令人不愉快的香气[29]，但在3款波特酒共有的主要醇类物质中大多是令人愉悦的香气，2,3-丁二醇、苯甲醇等15种化合物，它们赋予了波特酒烘烤味、苦杏仁味、玫瑰花味、青草、吐司等风味。异戊醇属高级醇，由表2可知，在WHB、XDL、CXZ波特酒中相对含量分别为16.35%、9.71%、13.09%，在醇类物质中除乙醇外相对含量最高，高级醇的生成通过酵母的氨基酸的异化作用[30]，也可通过糖的合成代谢经由氨基酸的合成代谢途径生成，对呈香有重要作用，可提高酒的感官品质。苯乙醇作为典型的高级醇，由苯丙氨酸代谢产生，呈玫瑰香、茴香、栀子花香[31]等多样风味。由图2可知，在WHB、XDL、CXZ波特酒中共检测出21种醇类物质，其种类以及相对含量存在一定差异，可能因为不同品种的葡萄蒸馏酒赋予了波特酒不同的高级醇[32]，高级醇在酒中的差异赋予了3款酒不一样的特征。
酯类物质是波特酒挥发性成分的重要组成部分，也是主要呈香物质，增加了酒体的复杂性、多样性和愉悦性[33]。酯是由醇和酸的酯化作用形成的，适量时能烘托主体香使酒体完美，使气味趋于平衡方向[34]。对酒体的后味起缓冲作用，过多会抑制主体香。3款波特酒中共检测出酯类物质25种，共有的酯类物质有10种，由表2可知，癸酸乙酯百分含量最高，具有梨香、似白兰地酒香和果香；其次为乙酸乙酯、正己酸乙酯、乙酸异戊酯，具有菠萝香、青苹果香、花香、香蕉香，是黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒中主要的酯类物质。辛酸乙酯、十三酸乙酯为WHB波特酒所特有的酯类物质，呈果香、蜡香。酯类物质的香气物质种类和相对含量的不同，可能是造成3种波特酒香气存在差别的主要原因。
酸类物质的主要贡献是呈味作用和作为酯的前驱物质及稳定剂作用，对香味的直接贡献较小，酸是微生物在发酵阶段共同作用的产物，可以赋予波特酒愉快的香气[35]。由表2可知，WHB波特酒中的酸类物质相对含量最高的是丙酮酸，为2.15%，有果味。XDL和CXZ波特酒中相对含量最高的是乙酸，相对含量为1.08%和1.3%，乙酸可与醇类物质反应生成具有水果香的醋酸酯，增加酒体的发酵香，但需在其阈值范围内，若超过阈值则说明酒样被醋酸菌、乳酸菌污染，具有酸味等不愉快的气味[33]。除此之外，XDL和CXZ波特酒中还共同检测到了正葵酸和辛酸，辛酸的产生源自于葡萄发酵过程醛类物质的氧化，属于低级脂肪酸，具有奶酪的气味，并带有粗涩的味感，对波特酒的整体具有协调作用。
在3款波特酒中共检测出10种醛酮类物质，其中苯甲醛、乙醛、2,3-戊二酮、2,3-戊酮、2,3-丁二酮为共有的，它们赋予了波特酒杏仁、咖啡香、奶油味。虽然相对含量较低，但其香气阈值较低，所以对波特酒的影响很大[36]，波特酒中的醛酮类物质可能来自于发酵原料水果本身，也可能来源于加强酒精时添加的葡萄蒸馏酒中，蒸馏酒在酿造过程和陈酿期间由其他物质结合得到。波特酒中的醛酮类物质通过与其他香气物质共同作用，从而对波特酒整体香气起到平衡或改善的作用。
3款波特酒的香气成分种类和相对含量存在差异，WHB波特酒的香气成分种类最少，CXZ波特酒的香气成分种类最多。XDL波特酒酯类和醇类物质种类较多，是构成波特酒整体香气的主要部分。挥发性风味成分检测结果表明，XDL波特酒较好。
2.2.3 添加不同品种葡萄蒸馏酒的波特酒共有挥发性香气成分主成分分析
对3种添加不同品种葡萄蒸馏酒中止酒精发酵的波特酒共有的34种挥发性香气成分进行主成分分析，大量原始信息被降为2个主成分，分别占总体方差贡献率的62.35%和37.65%，累积方差贡献率为100%，表明前2个主成分在波特酒品质指标评价中起主导作用，且能全面反映波特酒品质特性综合评价的主要信息。各指标在2个主成分上的载荷图见图2。由图2可知，WHB、XDL、CXZ波特酒中共有的34种香气化合物在PC1正半轴和负半轴均有聚集分布，但整体分布较为散乱，说明WHB、XDL、CXZ的香气品质存在差异。PC1主要与乙酸、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、苯甲醇、苯甲醛、乙酸乙酯呈正相关，PC2主要与正丁醇、月桂酸乙酯呈正相关。不同品种的葡萄蒸馏酒终止发酵的波特酒产生的香气存在差异，但不同品种的葡萄蒸馏酒与这些挥发性物质的关系有待进一步研究。
图2 3种黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒样中共有香气成分的主成分分析载荷图
Fig.2 Loading diagram of principal component analysis of common aroma components in 3 kinds of Aronia melanocarpa and Cabernet Sauvignon port wine samples
2.2.4 添加不同品种葡萄蒸馏酒的波特酒6类挥发性香气成分主成分分析
由于仅对共有的34种共有成分进行主成分分析得到的结果不够突出，将检测到的68种挥发性成分分为醇类、酯类、酸类、酮类、醛类、其他6个香气类型，对波特酒中各类挥发性香气化合物进行主成分分析，并参考了宋晶晶等[37]的主成分建模方法，计算波特酒的综合得分。将3款酒6个香气类型所占相对含量数据标准化后，用SPSS 19.0进行主成分分析，得到主成分特征值及特征向量，结果分别见表3、表4。
表3 3种黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒酒样中6类挥发性香气成分的特征值及方差贡献率
Table 3 Characteristics value and variance contribution rate of 6 types of volatile aroma components in 3 kinds of Aronia melanocarpa and Cabernet Sauvignon port wine samples
表4 主成分因子载荷矩阵与特征向量
Table 4 Loading matrix and feature vector of principal components factor
由表3和表4可知，其中PC1可以解释62.51%的方差，PC2可以解释37.49%的方差，二者累积方差贡献率为100%，表明这两个主成分可代表黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒挥发性风味的主要特征。
第1主成分与醇类、醛类呈正相关，与酯类物质呈负相关，代表以醇香、果香、玫瑰花、坚果的香气为主，主要源于葡萄蒸馏酒的香气[38]；第2主成分与酮类、酸类呈正相关，代表以发酵中产生的奶酪、奶油气味为主。PC1能反映大部分香气成分信息，影响其化合物并作为主要风味化合物，因此醇类和醛类是添加不同品种葡萄蒸馏酒的黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒香气差异化的主要影响因素，赋予了波特酒花香、水果、杏仁的香味。
根据表3、表4，将2个主成分代表原来的6种挥发性成分表达的信息，根据2个主成分的特征向量，利用Y1、Y2作为新的综合指标代替原有的6类挥发性成分建立不同波特酒风味品质评价模型，进行挥发性香气物质的综合评价，得出波特酒挥发性香气成分的线性关系式，式中ZX1～ZX6为3款波特酒的酯类物质、醇类物质、酸类物质、醛类物质、酮类物质、其他物质的相对含量在SPSS软件中进行标准化后的值，Y1、Y2表示2个主成分的得分分值，分值越大表示波特酒风味品质越好。得到WHB、XDL、CXZ波特酒的香气化合物线性关系方程式：
根据2个主成分的得分函数Y1、Y2以及表3中所对应的2个主成分各自的方差贡献率做内积可以计算出添加3款不同品种葡萄蒸馏的波特酒的综合风味品质的评价函数Y，并根据主成分1、主成分2的方差贡献率占比赋予权重，其表达式为：Y=0.625Y1+0.375Y2，结果见表5。
表5 3种黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒挥发性香气主成分综合得分
Table 5 Comprehensive scores of volatile aroma principal components of 3 kinds of Aronia melanocarpa and Cabernet Sauvignon port wine
由表5可知，第1主成分、第2主成分综合风味品质得分最高的均是CXZ波特酒。在香气成分评价模型中，CXZ波特酒得分最高为1.60，只有这款酒的综合得分＞0，说明这款酒的整体香气质量在3种波特酒的平均水平之上，相比之下，CXZ波特酒的香气品质更突出，其次为XDL波特酒、WHB波特酒。
3 结论
采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS对3种添加不同品种葡萄蒸馏酒的黑果腺肋花楸波特酒的挥发性香气成分进行检测，共得到68种挥发性成分，其中包括酯类25种、醇类21种、酸类7种、酮类6种、醛类4种、其他类5种。其中添加无核白、霞多丽、赤霞珠蒸馏酒的波特酒分别共检出50种、49种、51种香气成分。采用主成分分析法分别对3种添加不同品种葡萄蒸馏酒的波特酒共有的34种香气成分和6类香气化合物进行分析，并建立了香气成分质量评价模型。结果表明，醇类和醛类物质是影响添加不同品种葡萄蒸馏酒的黑果腺肋花楸波特酒的主要因素。经过模型计算，综合得分排序为添加赤霞珠蒸馏酒的波特酒＞添加霞多丽蒸馏酒的波特酒＞添加无核白蒸馏酒的波特酒。因此添加赤霞珠蒸馏酒的黑果腺肋花楸赤霞珠波特酒挥发性香气物质最丰富，品质最佳。
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