大豆（Glycine max（Linn.）Merr.）又称黄豆，是世界上最重要的豆类作物[1]，也是我国重要的粮食作物之一。我国已有数千年的大豆种植历史[2]，也是全球豆制品加工的主要国家之一[3]。大豆的蛋白质含量高，常被加工成豆腐、豆花、豆油等豆制品。豆渣作为豆制品加工的副产物，其产量巨大，鲜豆渣年产量可达千万吨[4]。豆渣含有丰富的蛋白质、膳食纤维、脂质、矿物质和维生素等营养成分[5]，其中膳食纤维可调节肠道益生菌[6]，可降低炎症的发生，并可在一定程度上预防心血管疾病、抑郁症、癌症等疾病的发生[7-9]。因此，豆渣具有巨大的开发潜力。然而，未处理的豆渣含有多种抗营养因子，而且存在口感差、豆腥味重、难储存等缺点[10]。豆渣的这些缺点阻碍了其深加工，既浪费资源，又污染环境[11]。
目前，豆渣的加工方法主要有物理法[12]、化学法、酶法、微生物发酵法[10]。与其他几种方法相比，微生物发酵法更加安全环保，且成本低，可以提高豆渣的可利用营养成分，改善其功能特性[13]，并产生良好的风味，使豆渣更适合于食品加工[14]。微生物发酵法有固态发酵与液态发酵两种方式。但是长期以来，固态发酵多依赖手工操作，其工艺操作繁琐、工作量大、生产周期长、劳动力需求大[15]，还达不到大规模工厂化生产的标准[16]。而液态发酵具有发酵周期短、节省原料、底物利用率高和产物杂质少等优点，目前已经发展成熟。与固态发酵相比，液态发酵更容易控制，且不易被污染，更适合大规模生产。
近年来，以霉菌、酵母菌、食用菌为主的真菌以及芽孢杆菌、乳酸菌等细菌[10，17]常被用于豆渣的发酵。研究表明，酵母因其具有强大的代谢活性，能够更好地改变豆渣残留气味。另外，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）能够增加豆渣的总酚类物质和抗氧化活性[18-19]。目前，有关豆渣发酵的研究大多以响应面法和正交试验法为主，但试验次数较多，而均匀设计法可对试验因素进行分类和排序，能大大减少试验次数，增加试验的可行性[20]。
本研究以豆渣为研究对象，利用酿酒酵母对豆渣进行液态发酵，通过均匀设计试验优化酿酒酵母液态发酵豆渣工艺，并测定发酵豆渣中的品质指标和挥发性风味成分，以期为豆渣的高值化利用提供参考，也为工业化大规模发酵豆渣提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：分离自安琪酵母股份有限公司的酿酒酵母，保藏于本实验室。
1.1.2 试剂
高温α-淀粉酶（40 000 U/g）、蛋白酶（200 000 U/g）、淀粉葡萄糖苷酶（100 000 U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司；三（羟甲基）氨基甲烷：北京索莱宝科技有限公司；吗啉乙磺酸：上海易恩化学技术有限公司；邻苯二甲酸氢钾、甲醛、冰醋酸（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；硫酸钾、五水合硫酸铜（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；K2HPO4（分析纯）：四川金地亚美科技有限公司；MgSO4（分析纯）：浙江一诺生物科技有限公司；琼脂粉（生化试剂）：上海博微生物科技有限公司。
1.1.3 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯浸粉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，氯霉素0.1 g/L，琼脂15～20 g/L，pH自然，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。马铃薯葡萄糖肉汤（potato dextrose broth，PDB）培养基中不添加琼脂。
1.2 仪器与设备
H1750R型医用离心机：长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；FA1204B型电子天平：上海越平科学仪器（苏州）制造有限公司；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；LS-75LJ型立式压力蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备有限公司；HYG-A型恒温振荡摇床：太仓市实验设备厂；SW-CJ-ID型超净工作台：上海苏净实业有限公司；SHZ-82A型气浴恒温振荡器：金坛市科析仪器有限公司；101-1A型电热鼓风干燥箱：天津天泰仪器有限公司；RO-DI型超纯水净化机：济南飞蓝水处理设备有限公司；6890A/5950C型气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）联用仪：美国安捷伦科技有限公司；SPX型恒温生化培养箱：上海科恒实业发展有限公司；SC21CL型真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；JM-L50型胶体磨：温州强忠机械科技有限公司；PHSJ-3F型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酿酒酵母的培养
将酿酒酵母菌粉在超净工作台用无菌水溶解活化，取1 mL活化液接入装有20 mL PDB培养基的三角瓶中，28 ℃、160 r/min条件下培养27 h。将菌液用生理盐水按10倍梯度稀释到10-6，将稀释度为10-6的稀释液涂布至PDA培养基上，28 ℃培养27 h，长出单菌落后，挑取单菌落，接种于PDB培养基中，28 ℃、160 r/min条件下培养27 h，得到种子液。
1.3.2 豆渣的液态发酵工艺
称取黄豆，用水浸泡12 h，泡好的黄豆按质量比1∶8加入水，采用胶体磨磨成浆[21]，纱布过滤之后得到含水量约为77%的湿豆渣。在湿豆渣中加入一定比例的白砂糖、K2HPO4、MgSO4，调整含水量，121 ℃条件下灭菌30 min，灭菌后置于超净台中冷却至室温，在豆渣中接种酿酒酵母菌种子液，在28 ℃、160 r/min条件下培养。
1.3.3 均匀设计试验优化酿酒酵母液态发酵豆渣工艺
根据均匀设计的原理，在酿酒酵母液态发酵豆渣的工艺基础上，优化辅料添加量和其他参数。以接种量（A）、白砂糖添加量（B）、K2HPO4添加量（C）、MgSO4添加量（D）、含水量（E）、发酵时间（F）为考察对象，以氨基酸态氮（Y1）、可溶性膳食纤维（Y2）、感官评分（Y3）为考察指标，进行6因素5水平的均匀设计优化试验，试验因素与水平见表1。
表1 酿酒酵母液态发酵豆渣工艺优化均匀设计试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of uniform design tests for process optimization of liquid-state fermentation of soybean residue by Saccharomyces cerevisiae
1.3.4 理化指标的测定方法
水分含量：参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》[22]。
氨基酸态氮含量：参照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》中酸度计法[23]。
膳食纤维含量：参照GB 5009.88—2014《食品中膳食纤维的测定》[24]测定样品中总膳食纤维、可溶性膳食纤维和不可溶膳食纤维。
蛋白质含量：参照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法[25]。
灰分：参照GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》[26]。
1.3.5 感官评价
由15名专业食品科研人员组成一支感官评价小组，从发酵豆渣的色泽（5分）、颜色均匀性（5分）、粗糙度（5分）、粘性（5分）、气味（5分）、滋味（5分）六个方面进行评分，满分30分，并取平均值，发酵豆渣的感官评价标准见表2[27]。
表2 发酵豆渣的感官评分标准
Table 2 Sensory scoring standards of fermented soybean residue
1.3.6 挥发性风味成分的分析
顶空固相微萃取：在22 mL顶空瓶中加入样品，迅速密封顶空瓶，于60 ℃下保持30 min，之后将已老化的DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶中并推出萃取纤维，60 ℃下萃取60 min，完成后拔出萃取头并插入GC进样口进行解吸，时间为10 min，温度为250 ℃。
GC条件：毛细管柱为Agilent 19091S-436 HP-5MS（250 μm×0.25 μm，60 m），载气为高纯度氦气（He），流速为1.0 mL/min，采用不分流模式。升温条件为50 ℃保持2 min，以3.5℃/min升温至180℃，以10℃/min升温至210℃，保持5min。
MS条件：电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，质量扫描范围为20～500 amu。
定性定量方法：将未知图谱与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）20质谱库和Wiley库进行匹配、鉴定，进行定性分析。采用峰面积归一化法，确定各挥发性成分的相对含量[28]。
1.3.7 数据统计与分析
试验数据采用Excel（2016）进行初步整理，使用SPSS 26.0软件进行统计分析，P＜0.05表示差异显著，利用Origin 2021作图。
2 结果与分析
2.1 均匀设计试验优化酿酒酵母液态发酵豆渣工艺
2.1.1 均匀设计试验结果
均匀设计试验优化酿酒酵母液态发酵豆渣工艺结果与分析见表3。
表3 酿酒酵母液态发酵豆渣工艺优化均匀设计试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of uniform design tests for process optimization of liquid-state fermentation of soybean residue by Saccharomyces cerevisiae
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由表3可知，氨基酸态氮含量在试验1条件下最高，即接种量2%、白砂糖添加量0.4%、K2HPO4添加量0.10%、MgSO4添加量0.07%、含水量91.23%、发酵时间28 h。可溶性膳食纤维在试验6条件下最高，即接种量2%、白砂糖添加量0.3%、K2HPO4添加量0.09%、MgSO4添加量0.05%、含水量93.75%、发酵时间28h。感官评分在试验7条件下最高，即接种量2.5%、白砂糖添加量0.5%、K2HPO4添加量0.12%、MgSO4添加量0.04%、含水量95%、发酵时间24 h。
2.1.2 均匀设计试验结果回归分析
（1）以氨基酸态氮含量为评价指标的回归分析
以氨基酸态氮含量为评价指标，对表3结果进行回归分析，得到豆渣发酵所得氨基酸态氮含量的回归方程为：
对回归方程进行方差分析，结果见表4。由表4可知，决定系数R2=0.926，调整决定系数R2Adj=0.893，回归模型显著（P＜0.05），说明该回归模型在整个回归区域拟合度很好，该方程能很好地拟合豆渣发酵过程。
表4 以氨基酸态氮含量为评价指标的方差分析
Table 4 Variance analysis with amino acid nitrogen content as the evaluation index
根据回归方程，采用Excel 2016软件对回归方程求解得到酿酒酵母液态发酵豆渣的最优工艺为：接种量2%、白砂糖添加量0.7%、K2HPO4添加量0.12%、MgSO4添加量0.07%、含水量90%、发酵时间12 h，在此条件下，得到最高氨基酸态氮含量理论值为0.179 9 g/100 g，接近于直观分析结果。
（2）以可溶性膳食纤维为评价指标的回归分析
以可溶性膳食纤维为评价指标，对表3结果进行回归分析，得到豆渣发酵所得可溶性膳食纤维含量的回归方程为：
对回归方程进行分析，结果见表5。由表5可知，决定系数R2=0.960，调整决定系数R2Adj=0.942，回归模型显著（P＜0.05），说明该方程能很好地拟合豆渣发酵过程。
表5 以可溶性膳食纤维含量为评价指标的方差分析
Table 5 Variance analysis with soluble dietary fiber content as the evaluation index
根据回归方程，采用Excel 2016软件对回归方程求解得到酿酒酵母液态发酵豆渣的最优工艺为：接种量2%、白砂糖添加量0.3%、K2HPO4添加量0.08%、MgSO4添加量0.03%、含水量95%、发酵时间28 h。在此条件下，得到最高可溶性膳食纤维含量为6.75%，接近于直观分析结果。
（3）以感官评分为评价指标的回归分析
以感官评分为评价指标，对表3结果进行回归分析，得到豆渣发酵所得感官评分的回归方程为：
对回归方程进行方差分析，结果见表6。由表6可知，决定系数R2=0.994，调整决定系数R2Adj=0.992，回归模型显著（P＜0.05），说明该方程能很好地拟合豆渣发酵过程。
表6 以感官评分为评价指标的方差分析
Table 6 Variance analysis with sensory scores as the evaluation index
根据回归方程，采用Excel 2016软件对回归方程求解得到酿酒酵母液态发酵豆渣的最优工艺为：接种量2%、白砂糖添加量0.7%、K2HPO4添加量0.12%、MgSO4添加量0.03%、含水量95%、发酵时间28 h。在此条件下，得到最高感官评分为28.81分，接近于直观分析结果。
2.1.3 酿酒酵母液态发酵豆渣最优工艺条件的确定
通过均匀设计试验，根据不同评价指标，得到不同的最佳发酵工艺，在3个最优发酵工艺条件下进行验证试验，测定氨基酸态氮含量、可溶性膳食纤维含量以及感官评分，结果见表7。
表7 豆渣发酵验证试验方案
Table 7 Validation test scheme of soybean residue fermentation
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由表7可知，试验组2号的氨基酸态氮与感官评分都明显更高（P＜0.05），而可溶性膳食纤维也较高，综合比较得出酿酒酵母液态的发酵豆渣的最优工艺为接种量2%、白砂糖添加量0.3%、K2HPO4添加量0.08%、MgSO4添加量0.03%、含水量95%、发酵时间28 h。最优发酵工艺所得发酵豆渣的氨基酸态氮含量、可溶性膳食纤维含量和感官评分分别为0.174 5 g/100 g、6.49 g/100 g、27.50分。
2.2 酿酒酵母发酵豆渣前后指标的检测结果
利用酿酒酵母发酵豆渣前后指标的检测结果见表8。由表8可知，在发酵过程中，豆渣的营养物质含量发生变化，发酵后，氨基酸态氮含量（0.174 5 g/100 g）增加51.08%，可能是微生物和酶共同作用的结果[29-30]。豆渣发酵后，可溶性膳食纤维含量（6.49 g/100 g）增加，而不可溶性膳食纤维含量（58.61 g/100 g）减少，分析原因可能是发酵过程中纤维素酶把豆渣中的膳食纤维微粒化，增加了豆渣中的可溶性膳食纤维含量，改善了豆渣的食用口感，提高了其感官品质，故发酵后豆渣感官评分（27.50分）也明显增加。
表8 豆渣发酵前后各指标的检测结果
Table 8 Detection results of each index before and after soybean residue fermentation
注：同行不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
2.3 豆渣挥发性风味成分分析结果
采用GC-MS检测豆渣中的挥发性风味成分，酿酒酵母发酵后豆渣的挥发性风味成分见表9，豆渣中挥发性风味成分的种类及相对含量见图1。
由表9和图1可知，从未经发酵的豆渣中共鉴定出56种挥发性风味成分，而从发酵豆渣中共鉴定出72种挥发性风味成分，发酵前挥发性风味成分包括醇类（10种）、醛类（20种）、酮类（7种）、酯类（2种）、烷烯烃类（12种）、呋喃类（2种）、其他类（3种），发酵后豆渣中的挥发性风味成分包括醇类（16种）、醛类（4种）、酮类（5种）、酯类（18种）、烷烯烃类（19种）、呋喃类（3种）和其他类（7种）。发酵后豆渣中的挥发性成分中醇类和酯类物质的种类增加，且相对含量（63.58%、18.04%）分别为发酵前的4.89倍、13.17倍；而醛类物质的种类减少，且相对含量仅为1.15%；酮类、呋喃类相对含量（0.78%、10.19%）相较于发酵前均有所降低；烷烯烃类和其他类物质的相对含量（4.75%、1.50%）则有所增加。正是这些挥发性化合物互相融合，让发酵后的豆渣具有了醇酯香浓厚的独特风味。
图1 豆渣发酵前后各挥发性风味成分的种类及相对含量
Fig.1 Types and relative contents of each volatile flavor components before and after soybean residue fermentation
表9 酿酒酵母发酵豆渣中挥发性风味成分GC-MS分析结果
Table 9 Results of volatile flavor components of soybean residue fermented by Saccharomyces cerevisiae analyzed by GC-MS
续表
续表
注：“-”表示未检出。
醇类是酵母菌主要的代谢产物，普遍呈现花草香味[31]。发酵后的豆渣会大量产生具有微甜醇香的乙醇（18.71%）、具有玫瑰花味和蜂蜜气味的苯乙醇（13.77%）[32]、具有焦香麦芽味的异戊醇（13.10%）、具有植物清香和花香的正己醇（5.95%）[33]和具有独特的烤可可味2-甲基-1-丁醇（3.83%）[34]。其他醇类化合物量较少，对豆渣的整体风味影响较小。
脂肪氧化的醇和游离的脂肪酸作用可产生酯类[35]，其主要是酵母菌代谢的副产物。发酵后的豆渣醇类物质含量最多，酯类物质含量次之。酯类主要呈现芳香风味，含量较多的辛酸乙酯（6.06%）具有水果的清香，乙酸异戊酯（2.33%）具有香蕉风味[36]，乙酸己酯（1.88%）具有果香[37]，正己酸乙酯（1.33%）具有苹果皮香味，乙酸乙酯（1.15%）具有微带果香的酒香[38]，发酵后酯类相比发酵前（1.37%）含量大幅增加。
对比发现发酵后豆渣中的醛类物质相较于发酵前有所减少。豆渣呈现的豆腥味主要是因为存在己醛、反式-2,4-癸二烯醛、反，反-2,4-壬二烯醛、癸醛等醛类挥发性化合物[39]，发酵前豆渣中己醛相对含量为23.36%，反式-2,4-癸二烯醛含量为6.43%，反，反-2,4-壬二烯醛含量为0.89%，癸醛含量为0.67%，发酵后豆渣中均未检测出以上化合物，此结果与高天宇[39]提出的微生物发酵通过削减豆腥味化合物含量改良风味的结论一致。
发酵过程中氨基酸脱氨脱羧、醇类氧化等化学反应会生成酮类物质，此外发酵后豆渣中还检测出烷烯烃类、呋喃类、酚类等其他物质，主要由微生物代谢或美拉德反应产生[40-41]。2-正戊基呋喃具有芝麻香味[36]，一定程度上会呈现豆腥味，豆渣发酵前其相对含量为17.58%，发酵后其含量变为10.19%。
3 结论
通过均匀设计试验优化得到酿酒酵母液态发酵豆渣的最优工艺为：接种量2%、白砂糖添加量0.3%、K2HPO4添加量0.08%、MgSO4添加量0.03%、含水量95%、发酵时间28 h。在此条件下，发酵后豆渣的氨基酸态氮含量、可溶性膳食纤维含量及感官评分分别为0.174 5 g/100 g、6.49 g/100 g、27.50分，分别是发酵前的1.51倍、3.57倍、1.42倍。通过顶空固相微萃取气相色谱-质谱法从发酵豆渣中共检测到72种挥发性风味物质，包括醇类（16种）、醛类（4种）、酮类（5种）、酯类（18种）、烷烯烃类（19种）、呋喃类（3种）和其他（7种）。与未发酵豆渣相比，发酵后豆渣产生了大量有愉悦气味的醇类、酯类物质，而较多具有豆腥味的醛类物质在发酵后转化为其他物质，使发酵豆渣醇酯香浓郁，总体呈愉悦风味，削减了令人不快的豆腥味。本研究对于实现资源综合利用，提高豆渣附加值，增加其经济价值有着重要意义，为豆渣的高值化、工业化生产提供科学的数据参考。
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