桑椹（mulberry）俗称桑枣、桑果、桑子等，是桑树的果实。桑椹具有很高的营养健康价值，1993年被列入《按照传统既是食品又是中药材的物质目录》。据《本草纲目》、《中华人民共和国药典》、《中药大辞典》等描述，其味甘性寒，归心、肝、肾经，生津润燥、护肝益肾、乌发明目[1]。桑椹的健康价值高，多酚、花色苷、多糖、纤维素、微量元素硒等含量丰富[2-3]，因此表现出较高的抗氧化活性以及良好的降血糖效果[3-4]。每年桑椹5～6月成熟，采收期约2～3周，且采收期间环境温度达30 ℃左右。桑椹成熟后采收难度高，采收和储运过程中极易造成损伤，酵母菌、霉菌、醋酸菌等微生物利用糖度高、酸性低的桑椹汁快速生长繁殖[5]。桑椹果采收、储运等难度大，鲜果质量安全控制存在不确定性，原料的特殊性限制了其产业化加工，导致深加工产品较少。常见的粗加工产品桑椹冻果以及深加工产品如桑果汁、桑果干、桑果酱、桑椹酒等，总体产业技术水平有待提升。短时间内将桑椹原料大批量迅速加工的方式只有速冻加工、果汁加工和果酒酿造，而桑椹酒是利润高、保质期长的深加工产品。
工业化酿造桑椹酒历史较短，没有成熟的技术工艺标准，因此多借助既有的葡萄酒生产设备加工。桑椹酒酿造工艺研究以及产业化的关键问题集中于控制甲醇、杂醇油、挥发酸含量，突出桑椹酒的色泽、风味，以及提高桑椹酒的储藏稳定性等方面[6-8]。桑椹酒的酿造也面临新的挑战，如长江以南地区菌核病易发，为防治病害过量喷施农药等问题突出，农药残留也成为新的潜在安全问题[9-10]。桑椹酒酿造技术研究最重要是服务于产业需求，但很多研究基于科学问题，其提供的实验参数是在严格的试验条件下得出，无法很好地指导不确定性较强的生产实践活动。因此该文对现阶段桑椹酒酿造关键技术研究进行总结分析，同时结合多年桑椹酒产业化经验对桑椹酒产业化酿造对策开展讨论，为相关研究与应用提供参考。
果酒中挥发酸是低沸点酸的总称，主要是乙酸，挥发酸含量较高时影响桑椹酒的感官品质[11]。实践生产中桑椹酒挥发酸含量的限值通常参考红葡萄酒，桑果酒行业内大多数工厂规定≤1.2 g/L，有些工厂设定最高限量值是1.5 g/L。微生物生长繁殖是产生挥发酸的主要原因，通常是不可避免的但人们希望将其含量控制在较低水平。挥发酸积累不仅与桑椹酒酿造每个过程（从原料到原酒）有关，还与原酒储存条件相关。
原料新鲜程度和处理及时性影响桑椹酒挥发酸含量[11]。桑椹是一种聚合小浆果，没有类似于葡萄、蓝莓一样的外皮保护，极易受到微生物侵染，在成熟之前已经附着了大量的霉菌、野生酵母菌、醋酸菌等杂菌。30 ℃左右的环境温度下，采收、运输过程造成的损伤为微生物生长繁殖提供了适宜的条件，尽可能减少原料微生物繁殖非常重要。
以镇江地区桑椹酒酿造为例，通常初期采收的桑椹原料质量较好，后期采收的桑椹容易附着较多的杂菌。桑椹成熟后有一部分自然脱落，在田间发酵、腐烂通常有明显的“酒香味”和“酸味”，即由酒精发酵和醋酸发酵引起。地面杂菌快速生长繁殖，通过尘土、采收工具等侵染到树上以及已经采收的桑椹。长期观察发现干燥的天气对桑椹采收质量有显著的影响，潮湿闷热的天气诱导微生物在桑椹上生长繁殖，甚至肉眼可见霉菌菌丝。采收初期的桑椹用于桑椹酒酿造，挥发酸含量相对较低，干燥凉爽的天气有积极的影响。地面覆膜、及时清洗采收工具均是有效降低挥发酸含量的方法。采收后的鲜果及时压榨发酵非常关键，通常控制在4 h内，且对原料采取一定的控温措施不可堆叠和暴晒，防止温度过高。
采收后的桑椹应及时加工，有条件的情况下降低原料田间热、采用冷藏运输方式能够有效地保证桑椹的新鲜度。采摘后的桑椹放置时间超过6 h很容易产生发酵风味，中心温度升高甚至有结块的现象。将桑椹冻结后保存于-18 ℃冷库，待采收季节结束后统一解冻加工，由于冻结和解冻时间较长且不均匀，易造成醋酸菌等杂菌生长繁殖，很难将桑椹酒挥发酸含量控制在1.0 g/L以内。
将加工前处理前移至田间地头有利于降低桑椹酒挥发酸含量。在田间搭建简易且卫生的场地，采收后的桑椹立即除渣取汁，按150 g/t加入焦亚硫酸钾，按200～250 g/t加入活化的安琪酵母（其中CECA与BV818质量比为1∶1），按750 g/t加入酒石酸。处理后的果汁（浆）2 h内运抵工厂调入果胶酶等辅料后（21±3）℃下发酵。按此方法发酵的桑椹酒主发酵结束后挥发酸含量为0.35 g/L，成品桑椹酒挥发酸含量为0.6 g/L。此方法处理的优点在于：避免了醋酸菌、霉菌等杂菌在运输过程中大量繁殖。采用焦亚硫酸钾和酒石酸及时控制杂菌的生长繁殖，且尽可能迅速地使酵母菌成为优势菌，桑椹酒的色泽品质也较好。
1.2.1 卫生管理和原料前处理
发酵所用的器具和管道均需要清洗、消毒，将可能存在的醋酸菌杀灭。使用焦亚硫酸钾水溶液配制总SO2质量浓度为0.3 g/L的消毒液浸泡清洗器具，操作中添加1.0～2.0 g/L柠檬酸降低pH有利于提高游离SO2含量从而提升杀菌效果。在采摘的桑椹原料上喷洒二氧化硫水溶液可起到一定程度的保鲜作用，但需要记录SO2使用量避免最终桑椹酒SO2含量超标。
1.2.2 酵母的选择与接种量的控制
挥发酸含量与酿酒酵母相关，选择发酵能力强、增殖迅速的酵母，适当增加酵母接种量均能够帮助酵母菌在尽可能短的时间内成为优势菌[12]，通过竞争性抑制控制醋酸菌等生长繁殖。
采用克鲁维酵母CVE-7发酵葡萄酒，研究发现发酵过程中可显著提升乳酸含量而降低发酵液的pH值，当克鲁维酵母与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）同时混合发酵时挥发酸含量为0.27 g/L，香气、色泽、干浸出物等指标均得到提升[13]。酸对果酒风格的形成具有重要的作用，非传统酿酒酵母的增酸技术可有效提升酒的品质[14]。腰果酒酿造时采用酿酒酵母与非酿酒酵母混合发酵，改善了腰果酒的风味品质，挥发酸含量最低0.2 g/L[15]。贝酵母抗逆性强、增殖迅速，是桑椹酒酿造较为合适的菌种。为了达到风味与发酵能力平衡，可以选择2种酵母混合使用，搭配比例则需要通过具体的试验选择。选择低产挥发酸的酵母酿造桑椹酒是值得尝试的新思路，常压室温等离子体诱变酿酒酵母NX4得到具有良好的遗传稳定性的低产挥发酸突变菌株T2-5，对糖耐受性更高且具有更低的酒精耐受性，在冰酒酿造试验中挥发酸含量降低了26.4%[16]。
桑椹酒发酵酵母接种量约0.20 g/L，为了让酵母菌迅速成为优势菌可适当将接种量提高到0.25 g/L。邢庆洋[17]筛选出适合桑椹酒酿造的Y1酵母菌，种子液接种量为8%，该酵母迟滞期较短，启动发酵迅速，桑椹酒的香气等感官指标较好。促进酵母生长代谢的措施能够降低挥发酸含量，如添加果胶酶、纤维素酶、糖化酶、Zn2+、Mg2+、K+，而添加复合酶时挥发酸含量降低至0.66 g/L[18-19]。
1.2.3 发酵温度及SO2浓度
桑椹酒发酵温度控制与葡萄酒不同，不能够有大的偏差，建议严格控制在18～25 ℃避开醋酸菌等细菌生长最适温度。在此发酵温度下，通过试验比较酵母的发酵特性选择合适的酵母。张晶等[20]对桑椹酒发酵糖度、温度、pH、接种量等参数进行优化，当温度为28 ℃时挥发酸含量为1.32 g/L，虽感官评分良好但挥发酸含量偏高。吴桂君[21]的研究表明，保持低温（5 ℃）、较低pH（3.7～3.8）和较高SO2残留量（60mg/L）可以有效控制枸杞酒中挥发酸的稳定性。张志兰等[22]采用1 g/L膨润土澄清处理后的桑椹汁16～19 ℃发酵，能够显著降低桑椹酒中挥发酸的含量，最低0.12 g/L。
桑椹酒中SO2的限量一般参考葡萄酒标准GB 15037—2006《葡萄酒》[23]，总SO2质量浓度≤150 mg/L。实践经验表明，使用SO2时在不影响风味的情况下可以按略低于最高限值浓度使用，在原料打浆时一次性加入，后续各工艺环节中SO2部分损失，终产品SO2含量符合限值要求。在桑椹酒批量发酵中，采用压榨汁18～24 ℃发酵5～6 d后压榨，压榨酒液18 ℃发酵2 d后采用0.8 g/L皂土下胶澄清，并将温度降低至5 ℃，下胶澄清1周后过滤，保持15 ℃以下存储3个月后测定挥发酸含量为0.6 g/L。
发酵结束后及时进行压榨，在压榨过程中混入空气，促进酒液在短时间内继续发酵消耗残糖。此时发酵较为缓和，罐顶预留一定的空间，发酵结束后可进行倒罐、丢弃罐底沉淀、满罐控温存储、陈酿。满罐存储排除了罐内空气，抑制醋酸菌繁殖，充入适当二氧化碳或氮气进一步排出空气对抑制挥发酸的升高更为有利。建立巡检制度尤为重要，检测原酒的温度、挥发酸含量等并进行感官评定。严格控制车间卫生管理，取样后的阀门均需要消毒（使用体积分数75%乙醇）以避免杂菌污染。
桑椹酒酿造过程中产生副产物甲醇，参考红葡萄酒标准，甲醇限量为400 mg/L。甲醇对人体有毒副作用，主要体现于麻醉中枢神经系统，甲醇及其代谢产物甲醛和甲酸对眼组织伤害较大，摄入甲醇5.0 g即可造成中毒，超过12.5 g可导致死亡[24-25]。控制桑椹酒中甲醇的含量提高桑椹酒饮用安全性具有重要的意义。桑椹酒中甲醇的产生与原料中果胶代谢、酵母菌生长代谢、甘氨酸代谢等有关[21]。
桑椹中果胶含量丰富，冷冻干燥后超声波辅助提取得到多糖即果胶，含量为51.29～124.45 mg/g[26]。桑椹压榨后的桑椹呈粘稠浆状，发酵一定时间或者加入果胶酶酶解后粘稠度显著下降即是果胶降解的原因。果胶主要存在于细胞壁和细胞内层，细胞破壁有利于胞内物质溶出。桑椹酒发酵过程中添加果胶酶酶解有助于提高出汁率，增强桑椹酒的风味和花色苷溶出，有利于主发酵后的压榨操作以及桑椹酒的澄清，酶解是有必要的。
工业上使用的果胶酶多由微生物发酵制得，是一类酶的混合物，包括果胶酯酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶3种类型。果胶在果胶酯酶的作用下生成聚半乳糖醛酸链和甲醇[24，27]。张惠玲[28]在红枣上选育果胶甲酯酶含量低的果胶酶产生菌，细胞融合技术获得产果胶甲酯酶低，产多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶高的优良的果胶酶产生菌Rh-12，处理枣汁发酵低甲醇含量枣酒。沈志毅等[29]研究表明，果胶含量与甲醇生成量呈正相关性，添加果胶酶使甲醇含量增加。桑椹发酵过程有必要添加果胶酶，但不同的商业化果胶酶酶解产生甲醇的含量有显著差异，这可能与酶活性以及酶的构成有关[30]。添加果胶酶的量不宜太高，以发酵结束后能够顺利压滤且甲醇含量在限量以内为准。
产业化实践中发现桑椹酒中甲醇的含量与采收的原料相关。采收前期的桑椹果胶含量较低，而随着时间推移气温升高，采收后期的桑椹变得软烂，压榨汁中果肉较多且粘稠度增加，需要提高果胶酶使用量。由于果胶含量高、果胶酶施用量高导致甲醇生成量增高。因此，利用采收前期桑椹的压榨汁发酵更适合桑椹酒的酿造。
酵母代谢产生乙醇，在这个过程中甘氨酸在脱氨脱羧酶的作用直接生成甲醇，或者在甘氨酸裂解酶的作用下先生成甲胺，甲胺与亚硝酸反应产生甲醇[24]。桑椹中甘氨酸含量难以控制，但可以通过选择代谢产甲醇含量低的酵母发酵桑椹酒。现代分子生物学已经成功用于工程菌的改造，通过基因工程改变微生物某一步或者某些代谢路径，从而达到减少或者增加目标物质的积累[30]。熊志钦等[31]成功地敲除了参与甲醇生成的酵母基因GCV2，构建出工程酵母L5，使酿造酒中甲醇含量降低了31%。因此低产甲醇的发酵工程菌的研究具有重要的意义。
桑椹酒酿造常采用两种发酵工艺，一是全果破碎后带渣发酵，二是压榨过滤后果汁发酵。带渣发酵干浸出物含量高，风味复杂香气浓郁，但因为果胶含量较高，甲醇生成量也较高；而果汁发酵的桑椹酒产生甲醇含量较低。红葡萄酒带皮发酵与白葡萄酒清汁发酵工艺有较大的区别，因此红葡萄酒甲醇限量400 mg/L，而白葡萄酒甲醇限量250 mg/L[23]。带渣发酵的桑椹酒主发酵完成后及时进行渣汁分离有利于控制甲醇含量上升。采用桑椹汁18～21 ℃控温发酵，由于果胶含量低，最终产甲醇含量可控制在100 mg/L以内。
除了2.2中所述酵母种类对甲醇产生显著影响以外，酵母添加量、pH、发酵温度对甲醇含量也有影响[12，30]。发酵温度高甲醇含量高，可能是发酵温度高果胶酶解更为彻底，也可能是温度高影响酵母的甘氨酸代谢[12]。采用桑椹压榨浊汁在20～25 ℃下发酵，当残糖含量降至6 g/L时主发酵结束及时进行压榨，然后20～25 ℃发酵2～3 d，按此工艺加工的桑椹酒甲醇含量为150 mg/L，满足质量要求。当pH较低时果实的细胞壁发生溶解有利于果胶的溶出，pH 2.0时果胶桃果胶提取得率最高约2.1%[27]。王小东[30]研究表明，pH值与甲醇含量呈显著负相关，pH越高甲醇含量越低。桑椹酒的酸度与原料品种和成熟度相关，一般桑椹的酸度较低，pH 4.6左右，增酸发酵后pH约为4.0，在此条件下甲醇生成量可控。在存储过程中甲醇含量较为稳定，因此控制桑椹酒甲醇含量的措施应施加在酿造过程中[32]。
杂醇油是一类两个碳原子以上的低级醇的总称，主要有丙醇、丁醇、异丁醇、戊醇、异戊醇等[32-33]。杂醇油及其与乙酸等反应生成具有芳香味道的酯，对桑椹酒风味具有一定的贡献，含量过高不仅对风味产生不利的影响，也不利于健康[34]。杂醇油分子质量大，在体内代谢慢，过量摄入可以刺激神经，使人感到头痛、头晕等不适症状即常说的“上头”现象，控制桑椹酒杂醇油的含量在较低的水平尤为重要[35]。杂醇油的产生一般由氨基酸代谢引起，与氮源是否充足、氮源类型和酿造酵母及其生长条件相关[12，24]。
氨基酸在脱羧酶和脱氢酶等的作用下产生，通常有2种产生途径：一是氨基酸降解代谢路径即Ehrlich代谢机制，即氨基酸在转氨酶的作用下形成中间体α-酮酸；二是酵母以糖合成氨基酸的代谢路径即Harris代谢机制，形成中间体α-酮酸，然后在脱羧酶作用下生成杂醇油[24，36]。无机氮和有机氮均可被微生物利用，研究表明，有机氮源的代谢产生杂醇油含量较高，而添加铵态氮则能够降低杂醇油的含量，当发酵温度为14 ℃，酵母接种量为0.40 g/L，发酵液中（NH4）2HPO4添加量为0.5 g/L时黑莓白兰地原料酒中杂醇油含量最低为130.54 mg/L[12]。NH4HCO3添加量从0.05～0.15 g/L时，高级醇生成量逐渐降低[35]。添加无机氮源（NH4）2SO4后，酵母生长繁殖所需的氮源充足，减少了氨基酸等有机氮的代谢，因而降低杂醇油的生成量[36-37]。发酵时添加无机氮源如（NH4）2HPO4、（NH4）2SO4、（NH4）2CO3、NH4HCO3等有利于降低果酒、水果蒸馏酒中杂醇油的含量。
发酵用酵母菌影响杂醇油生成，通过筛选低产杂醇油的酵母可降低桑椹酒中杂醇油含量[36]。发酵温度影响杂醇油的含量，温度较高时酵母菌生长代谢速度较快，此时氨基酸代谢旺盛，高级醇转化所需的酶活性较高，因此产生大量杂醇油，20 ℃以下杂醇油生成量较低，高于25 ℃时显著升高[12，35]。添加果胶酶有助于破壁溶出糖类，为酵母生长代谢提供有利条件，因此有利于控制杂醇油含量[36]。
温度、湿度高的地区桑椹极易被植物病原菌菌核病侵害[9]，在新疆、东北、内蒙等地由于气候干燥、气温相对较低，基本没有白果病病害发生，无需喷施农药进行防治。我国的桑树病害近200种，其中以真菌病害为主，桑椹菌核病是危害桑椹最为严重的一种真菌病害，主要包括3类：桑椹肥大性菌核病、桑椹缩小性菌核病和桑椹小粒性菌核病[38-39]。桑椹被菌核病侵染后在成熟前萎缩变白，俗称“白果病”，一旦果园爆发白果病甚至可造成桑椹颗粒无收，病原菌的生长繁殖也增加果园日后感染白果病的风险。桑树萌芽、开花、挂果的几个阶段喷洒多菌灵等农药可以有效控制白果病发生，受白果病害的基地需要在次年加大用药量才能防止白果病再次发生。农药过量使用和不科学的使用易造成桑椹农药残留处于较高水平，最终带入桑椹酒中，是潜在的健康危害[9-10]。按照农药消减的规律科学用药减少农药残留，提高病害防治技术减少农药喷施量。多菌灵、甲基硫菌灵、腐霉利、菌核净、咪鲜胺等均能够对肥大性菌核病起到较好的防治效果，混合使用农药且避免连续两年重复使用同一种化学药剂是降低农药残留的方法之一[10]。
在菌核病高发的地区，有些果桑品种抗病能力较强，对培育抗病品种具有重要的意义。郑章云等[9]对21个果桑品种进行菌核病抗性研究，初步鉴定筛选出抗病能力强的台湾长果桑品种1个，可作为抗病果桑品种的育种材料。采用生物拮抗作用防治桑椹菌核病也是人们研究的热点。芽孢杆菌能产生酶类、活性蛋白类、多肽类、酚类等多种类型的抑真菌物质，此外他们自身的生长繁殖对真菌造成营养和空间上竞争性抑制[40]。
据长期从事果桑育苗、种植的中国农业科学院蚕业研究所季春忠介绍，加大行距和株距，每亩种植不高于50棵果桑，使田间通风、透气、透光，在地面覆膜均是有效控制白果病的种植管理方法。保持通风透光且桑椹采收后进行剪伐，抑制了菌核病原菌生长繁殖，地面覆膜减少了菌核病菌寄生土壤的暴露，这些措施均能减少病害发生的概率。
控制桑椹酒中挥发酸、甲醇、杂醇油含量以及降低农药残留十分关键。在此基础上防止桑椹酒过度氧化，保持桑椹酒香气（果香、发酵香）、色泽、澄清度、酒体结构等品质指标才更有意义。酿造原料的新鲜度（采收前期的桑椹、降低田间热）以及加工及时性（4 h内加工）、发酵控制（温度18～24 ℃、适当增加酵母接种量、选择增殖快发酵能力强的酵母菌种）与原酒存储管理（控温不高于30 ℃、定期质量巡检、卫生管理）均影响挥发酸的含量。而通过原料采收管理、去渣发酵、酵母菌筛选、添加无机氮源发酵、发酵温度控制、主发酵结束及时分离压榨等措施控制甲醇和杂醇油的含量。通过基因工程改造酵母菌使之低产甲醇和杂醇油将是有意义而又实用的研究。桑椹菌核病害防治带来了高农药残留的潜在风险，合理使用农药是目前采取的普遍措施，但抗病果桑品种培育、生物法防治是未来的发展方向。桑椹酒的酿造是一项系统工程，需要具备系统思维的意识，将品质管理转移到各环节关键点的控制。
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