黄酒又称米酒，是世界上最古老的酿造酒之一，是以谷物为主要原料，利用酒药、麦曲或米曲所含的多种微生物的共同作用酿造而成的发酵原酒[1-2]。黄酒性温，刺激性小，主要营养成分有糖、肽、氨基酸等低分子浸出物，还有B族维生素、矿物质和微量元素等易被人体消化吸收的营养物质，赋予黄酒独特的风味[3-6]。近些年来，随着人们健康意识的增强和低酒精度、营养、保健的饮酒理念的形成，对功能性营养型低度黄酒类产品的需求逐渐增加。功能性营养型低度黄酒是在传统黄酒生产工艺基础上添加适合的功能性原料酿造的一种黄酒。目前，关于功能性营养低度黄酒的研究逐渐增多，功能性营养低度黄酒的生产工艺及原料均有别于传统黄酒，根据添加原辅料的不同，此类黄酒大至可分为果蔬类、菌燕类、杂粮类和药食同源类营养低度黄酒。其中，药食同源类营养低度黄酒（如葛根黄酒、枸杞黄酒等），不仅可以赋予黄酒营养及风味，而且有助于丰富黄酒的种类，拓宽黄酒市场[7]。
山楂（Crataegus pinnatifida）果实富含氨基酸、蛋白质、糖类、矿物质、维生素，具备较高的营养以及降低血糖、预防胆固醇、消食健胃、行气散瘀、化浊降脂的功效[8-9]。山楂是卫健委公布的按照传统既是食品又是中药材物质，山楂作为传统的中药材，已被中、英、法等国家列为功能性食物[10]。其果实口感酸涩，不符合多数人的口感，鲜食量较小，对其进行深加工，提高山楂的附加值，提升果酒品质，推动山楂产业发展具有重要意义[11]。段元良[12]以山楂为原料，经破碎及浸提等工艺处理后接种酵母菌，进行无氧发酵，并采用理化降酸工艺得到了一种酒精饮品。李博艺[13]将山楂蒸煮后加入发酵，采用高酒度陈酿工艺，得到了总黄酮含量为63.97 mg/L的山楂黄酒。
起泡酒一般是指以水果为原料，经酵母发酵或调配而成的二氧化碳压力≥0.05 MPa的水果酒[14]，多集中在以水果为原料进行发酵酿造，目前，以葡萄为原料生产的起泡酒为主[15]。
本研究以山楂和糯米为主要原料，在闽西传统甜型黄酒酿造工艺基础上添加浓缩山楂汁酿制起泡山楂黄酒，并采用单因素试验及响应面试验对其酿造工艺条件进行优化。以期促进山楂的产业化应用，为黄酒生产中原料的选择及生产工艺的优化提供理论依据与技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
山楂汁浓缩原浆（100 g浓缩山楂汁含有果胶7～10 g、有机酸6～10 g、单宁0.8～1.6 g、碳水化合物35～40 g）：山东优雅食品有限公司；甜酒曲（根霉菌、酵母菌、米粉）：江西寿长微生物技术开发有限公司；糯米：龙岩嘉丰米业有限公司。
1.1.2 试剂
葡萄糖、盐酸、硫酸铜、亚甲蓝、酒石酸钾钠、氢氧化钠、亚铁氰化钾（均为分析纯）：龙岩市凯成实验仪器有限公司；芦丁标准品（纯度98%）：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
TY-6调温电炉：天津中环电炉股份有限公司；酒精计：沧州超越仪器仪表有限公司；MH-20起泡酒灌装机：山东明辉包装机械有限公司；DX-017不锈钢发酵罐：曲阜鸿越机械设备制造有限公司；DC-150型板框压滤机：海宁大成过滤设备有限公司；UV-5600分光光度计：西安禾普生物科技有限公司；PHS-3C酸度计：上海雷磁仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 起泡山楂黄酒生产工艺流程及操作要点[16]
操作要点：
糯米饭的制备：选取颗粒饱满、色泽清白透亮的糯米，将糯米清洗、在室温下用清水浸泡24～48 h至糯米能够用手指碾碎，将糯米置于蒸盘蒸煮30～40 min，至糯米无粘连、无白心、软硬适中[17]。
淋饭、冷却：将蒸制好的原料，用冷水喷淋至30 ℃。
拌曲：糯米温度降至30 ℃左右时按每10 kg糯米拌入200 g甜酒曲。
落缸、搭窝：拌曲均匀后，下酒缸，压平料面，在物料中心挖一个倒喇叭型口，然后在表面撒上少许甜酒曲，用湿布盖口，进入糖化阶段。
糖化：糖化至糯米表面有一层皮，而里面空心。
一次发酵：加入10%的浓缩山楂汁和1倍的水，进行发酵，发酵至总糖含量130 g/L（通过监测总糖含量确定二次发酵的初始糖度），酒精度3%vol左右，进行压榨过滤取酒液。
二次发酵、冷却排渣：将压榨过滤后的酒液添加皂土澄清剂（添加量为0.1 g/L）泵入DX-017不锈钢发酵罐密封发酵，发酵温度16 ℃，装液量为90%（V/V）。发酵至压力达到0.45 MPa，将酒液冷却至2 ℃，打开发酵罐下方阀门放掉固体沉淀酒泥，得到起泡酒。
等压灌装：将起泡酒等压（压力0.45 MPa）灌装于酒瓶，立即封口。
煎酒：将酒液进行巴氏杀菌，于70 ℃加热30 min，即得起泡山楂黄酒成品。
1.3.2 起泡山楂黄酒酿造工艺优化单因素试验
依照前述操作要点的基本工艺参数，在其他条件不变的情况下，研究浓缩山楂汁添加量（6%、8%、10%、12%、14%）、二次发酵初始糖度（70g/L、90g/L、110g/L、130g/L、150g/L）、二次发酵温度（14 ℃、16 ℃、18 ℃、20 ℃、22 ℃）3个因素对起泡山楂黄酒感官评分以及酒精度的影响。
1.3.3 起泡山楂黄酒酿造工艺条件优化响应面试验
在单因素试验的基础上，以感官评分为响应值（Y），以浓缩山楂汁添加量（A）、二次发酵初始糖度（B）、二次发酵温度（C）为自变量，进行响应面试验设计，优化起泡山楂黄酒酿造工艺条件，响应面试验因素与水平见表1。
表1 起泡山楂黄酒酿造工艺条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for brewing process conditions optimization of sparking hawthorn Huangjiu
1.3.4 起泡山楂黄酒的感官评价
参照姚萌萌等[18]的方法，选择10位经具备品评能力的人员（5男，5女）为评分员，分别从色泽和澄清度、气味、口感、典型性4个方面对起泡山楂黄酒进行感官评价，满分为100分，感官评价标准见表2。
表2 起泡山楂黄酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of sparkling hawthorn Huangjiu
续表
1.3.5 分析检测
pH值及氨基酸态氮、非糖固形物、总糖、总酸含量：按GB/T 13662—2018《黄酒》进行测定[19]；酒精度：按GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中第二法酒精计法进行测定[20]；总黄酮：按SN/T 4592—2016《出口食品中总黄酮的测定》[21]进行测定。
1.3.6 数据分析
以上每个试验重复3次，结果取平均值，以“平均值±标准差”表示。采用Graphpad Prism 9.0软件进行制图，应用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，利用Design Expert 10.0.8软件进行响应面设计及结果分析。
2 结果与分析
2.1 起泡山楂黄酒酿造工艺优化单因素试验结果
2.1.1 浓缩山楂汁添加量的确定
浓缩山楂汁添加量对起泡山楂黄酒酒精度及感官评分的影响见图1。由图1可知，随着浓缩山楂汁添加量在6%～10%范围内的增加，起泡山楂黄酒的感官评分逐渐升高；当浓缩山楂汁添加量为10%时，感官评分最高，为（92.2±0.7）分，当浓缩山楂汁添加量＞10%时，感官评分逐渐下降。酒精度则随着浓缩山楂汁添加量增加呈现减小的趋势，其原因是浓缩山楂汁的碳水化合物含量低于糯米，其比例越高则相应碳水化合物含量越低，此外，浓缩山楂汁对酵母的繁殖产生综合影响[22-23]。
图1 浓缩山楂汁添加量对起泡山楂黄酒发酵效果的影响
Fig.1 Effect of concentrated hawthorn juice percentage on fermentation of sparkling hawthorn Huangjiu
当浓缩山楂汁添加量为10%时，起泡山楂黄酒糖酸比适宜，口感良好，无涩味，颜色鲜艳，酒精度为（6.4±0.3）%vol。因此，选择浓缩山楂汁添加量8%、10%、12%3个水平作为后续试验参数。
2.1.2 二次发酵初始糖度的确定
糖是酵母生长繁殖所需要的重要营养物质，酵母菌的无氧发酵是起泡山楂黄酒酒精以及二氧化碳的来源[22]，其决定了起泡山楂黄酒的酒精度、二氧化碳含量以及甜度。本研究设定了发酵终点产气量为0.45 MPa，即二次发酵消耗的糖量一定，二次发酵产酒精量一定，终产品酒精度主要由一次发酵程度决定。
二次发酵初始糖度对起泡山楂黄酒酒精度与感官评分的影响见图2。由图2可知，随着二次发酵初始糖度在70～150 g/L的增加，酒精度逐渐下降，其原因可能是，一次发酵程度较高，导致二次发酵初始糖度较低，酒精度较高；一次发酵程度较低，导致二次发酵初始糖度较高，酒精度较低。随着二次发酵初始糖度在70～110 g/L的增加，起泡山楂黄酒感官评分逐渐增加；当二次发酵初始糖度为110 g/L时，感官评分最高，为（92.5±3.8）分；当二次发酵初始糖度＞110 g/L时，感官评分呈下降的趋势。当二次发酵初始糖度为110 g/L时，起泡山楂黄酒杀口感适中，酸甜柔和，气泡细腻持久，酒精度为（6.2±0.6）%vol。因此，选择二次发酵初始糖度90 g/L、110 g/L、130 g/L 3个水平作为后续试验参数。
图2 二次发酵初始糖度对起泡山楂黄酒发酵效果的影响
Fig.2 Effect of initial sugar content of secondary fermentation on fermentation of sparkling hawthorn Huangjiu
2.1.3 二次发酵温度的确定
二次发酵温度对起泡山楂黄酒酒精度及感官评分的影响见图3。由图3可知，随着二次发酵温度在14～22 ℃范围内的升高，酒精度变化不明显。随着酒精度在14～16 ℃的升高，起泡山楂黄酒感官评分逐渐升高；当发酵温度在16 ℃时，感官评分最高，为（93.4±0.7）分；当二次发酵温度高于16 ℃，感官评分逐渐降低。当二次发酵温度为16 ℃时酒体醇香、柔和，杀口感较强，酒精度为（6.5±0.4）%vol。因此，选择二次发酵温度14 ℃、16 ℃、18 ℃3个水平作为后续试验参数。
图3 二次发酵温度对起泡山楂黄酒发酵效果的影响
Fig.3 Effect of secondary fermentation temperature on fermentation of sparkling hawthorn Huangjiu
二次发酵温度则必须较低，气泡才会细致[15]。发酵完成之后，死酵母会逐渐沉淀。随着发酵温度的升高，发酵速度加快，产生二氧化碳的速度较快，但是不容易溶解在酒体中，低温发酵有利于酒体饱和二氧化碳气体，使得气体均匀分布于酒中，但是过低的温度不利于酵母的起酵[24]。
2.2 起泡山楂黄酒酿造工艺条件优化响应面试验
2.2.1 响应面试验结果及方差分析
在单因素试验结果的基础上，以浓缩山楂汁添加量（A）、二次发酵初始糖度（B）、二次发酵温度（C）3个因素为自变量，以感官评分（Y）为响应值进行响应面试验优化，Box-Behnken试验设计及结果见表3，方差分析见表4。
表3 Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
利用Design Expert10.0.8对表3的试验结果进行二次多项回归拟合，获得起泡山楂黄酒的感官评分对浓缩山楂汁添加量（A）、二次发酵初始糖度（B）、二次发酵温度（C）的二次多项回归方程为：
由表4可知，回归模型极显著（P＜0.000 1），而失拟项不显著（P=0.399 4＞0.05），表明该模型拟合程度良好。该回归模型决定系数R2=0.995 8，调整决定系数R2Adj=0.990 3，表明回归方程可信度高，拟合度好。综上所述，该回归方程可用于优化起泡山楂黄酒酿造工艺条件。由P值可知，一次项A、B，二次项A2、B2、C2对感官评分影响极显著（P＜0.01），交互项BC对感官评分影响显著（P＜0.05），而其他项影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，影响起泡山楂黄酒感官评分的主次次序为浓缩山楂汁添加量（A）＞二次发酵初始糖度（B）＞二次发酵温度（C）。
2.2.2 响应面交互作用分析
浓缩山楂汁添加量、二次发酵初始糖度、二次发酵温度交互作用对起泡山楂黄酒感官评分影响的响应曲面和等高线见图4。
通过响应面曲面的陡峭情况和等高线的形状及稀疏程度可反映各因素交互作用对感官评分的影响，响应面越陡峭、等高线越密集，对结果影响越显著。由图4可知，二次发酵初始糖度（B）及二次发酵温度（C）交互作用的响应曲面陡峭，等高线为椭圆形，对感官评分有极显著的影响，浓缩山楂汁添加量（A）及二次发酵初始糖度（B）、浓缩山楂汁添加量（A）及二次发酵温度（C）具有一定的交互作用，但是交互作用不显著，这与方差分析结果一致。
图4 各因素间交互作用对起泡山楂黄酒感官评分影响的响应曲面及等高线
Fig.4 Response surface plots and counter lines of effects of interaction between various factors on sensory score of sparkling hawthorn Huangjiu
通过Design Expert10.0.8软件得出起泡山楂黄酒的最优酿造工艺条件为：浓缩山楂汁添加量10.16%、二次发酵初始糖度112.27 g/L、二次发酵温度（C）16.09 ℃，在该条件下，起泡山楂黄酒感官评分预测值可达到93.4分。考虑试验的可操作性，将优化酿造工艺条件修正为：浓缩山楂汁添加量10%、二次发酵初始糖度110 g/L、二次发酵温度16 ℃。按照修正后的酿造工艺条件进行3次平行验证试验，得到起泡山楂黄酒的感官评分实际值为93.5分，与预测值接近。说明基于响应面分析法优化起泡山楂黄酒酿造工艺条件是可靠的。
2.3 起泡山楂黄酒的品质指标
2.3.1 理化指标
根据本研究产品的特征并参照GB 2758—2012《食品安全国家标准发酵酒及其配制酒》[25]制定企业标准Q/FJHD 0002S—2021《米酒》[26]作为执行标准，并经龙岩市卫生健康委审核备案，该标准规定了米酒的产品分类、技术要求、试验方法、检验规则、标签、标志、包装、运输和贮存要求。起泡山楂黄酒理化指标检测结果见表5。
表5 起泡山楂黄酒的理化指标
Table 5 Physical and chemical indexes of sparkling hawthorn Huangjiu
由表5可知，起泡山楂黄酒的酒精度为6.5%vol，氨基酸态氮含量为0.26 g/L，非糖固形物含量为16.8 g/L；总黄酮含量为16.64 mg/L，根据罗铝铿等[27]的研究，不同品牌的客家黄酒的总黄酮含量分别为珍珠红娘酒0.89 mg/L；梅州娘酒1.86 mg/L、月子酒1.61 mg/L，本研究的起泡山楂黄酒的总黄酮含量明显高于普通黄酒，其原因可能是山楂营养丰富，特别是有机酸、黄酮的含量较高。总酸（以乳酸计）含量及pH值分别为2.8、16.51%，其原因可能是山楂本身富含各种不饱和脂肪酸以及其他酸类物质[28]，其中游离酸和结合态酸均能导致总酸增大，而游离酸会降低pH。此外，起泡酒溶有大量的CO2也会增加酒的酸度。为保持气泡酒所特有的清爽感[29]，起泡酒要求的含酸量相对高一些。本标准的制定为企业提供了起泡山楂黄酒组织生产及产品检验标准，本研究生产的起泡山楂黄酒按上述企业标准的要求进行了产品质量检验，各项指标均满足。
2.3.2 感官指标
起泡山楂黄酒酒体协调，具有米酒和起泡酒的典型风格，鲜甜柔和、清爽、杀口感适中，有山楂香气及酒香，香味协调，无明显可见固形物的紫色透明液体。
2.3.3 卫生指标
起泡山楂黄酒铅含量（以Pb计）为0.06 mg/kg，致病菌（沙门氏菌、金黄色葡萄球菌）均未检出。符合制定的企业标准Q/FJHD 0002S—2021《米酒》[26]要求。
3 结论
本研究在闽西传统甜型黄酒酿造工艺基础上，添加浓缩山楂汁酿制起泡山楂黄酒。通过单因素试验及响应面试验确定其最佳酿造工艺条件为：浓缩山楂汁添加量10%、二次发酵初始糖度110 g/L、二次发酵温度16 ℃。在此优化工艺下，得到的起泡山楂黄酒酒精度为6.5%vol，感官评分为93.5分，起泡山楂黄酒酒体协调，具有米酒和起泡酒的典型风格，鲜甜柔和、清爽、杀口感适中，有山楂香气及酒香，香味协调，无明显可见固形物的紫色透明液体，卫生指标符合企业标准要求。
[1] 谢广发.黄酒酿造技术[M].北京：中国轻工业出版社，2016：1-9.
[2] 高云超，宫晓波.广东河源客家黄酒氨基酸分析[J].食品安全质量检测学报，2020，11（24）：4-8.
[3] PORGAL E,BUYUKTUNCEL E.Determination of phenolic composition and antioxidant capacity of native red wines by high liquid and spectrophotometric methods[J].Food Res Int,2012,45(2):145-154.
[4] 廖婷，吴晓娟，杨小静，等.发酵型桂花米酒酿制工艺的研究[J].食品研究与开发，2019，40（11）：106-110.
[5] 刘茗铭，周阳子，袁乐梅，等.天门冬新型米酒的酿造及其品质分析[J].食品与发酵工业，2019，45（1）：137-144.
[6] 刘晓伟，郭芳，王静静，等.观赏海棠果米酒保健饮料研制[J].食品研究与开发，2018，39（17）：85-89.
[7] 陈箔.功能性营养型低度黄酒品种研究[J].现代农业科技，2012（4）：352-353.
[8] 张金宝，邓源喜，童晓曼，等.山楂的营养保健功能及其应用进展[J].安徽农学通报，2021，27（19）：116-117.
[9] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2020：33-34.
[10] LIU P Z,KALLIO H,LÜ D G,et al.Quantitative analysis of phenolic compounds in Chinese hawthorn(Crataegus spp.)fruits by high performance liquid chromatography electrospray ionisation mass spectrometry[J].Food Chem,2011,127(3):1370-1377.
[11] LIU T X,CAO Y N,ZHAO M M.Extraction optimization,purification and antioxidant activity of procyanidins from hawthorn (C.pinnatifida Bge.var.major)fruits[J].Food Chem,2010,119(4):1656-1662.
[12] 段元良.山楂酒的酿造及降酸工艺研究[D].济南：齐鲁工业大学，2016.
[13] 李博艺.山楂黄酒生产工艺研究[D].天津：天津科技大学，2018.
[14] 王超萍，李超，朱双全，等.石榴起泡酒二次发酵工艺优化[J].山东农业科学，2020，52（1）：154-157.
[15] 李超，司合芸，沈志毅，等.起泡酒发展概况及生产工艺分析[J].中外葡萄与葡萄酒，2015（4）：54-57.
[16] 文笑雨，杨萌，耿敬章.功能性黄酒质量安全研究进展[J].酿酒，2021，48（5）：19-20
[17] 张柳月，杨晓宽.板栗龙眼糯米黄酒发酵工艺优化[J].中国酿造，2022，41（2）：187-192.
[18] 姚萌萌，刘姗，康嘉伟，等.响应面法优化红枣起泡酒二次发酵工艺[J].中国酿造，2019，38（9）：113-115.
[19] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 13662—2018 黄酒[S].北京：中国标准出版社，2018.
[20] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB 5009.225—2016 食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[21] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.SN/T 4592—2016 出口食品中总黄酮的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[22] 王和才，李金生，钱菊根.中国酿酒小曲生产现状的调查与分析[J].中国酿造，2011，30（5）：13-15.
[23] 姚万春，唐玉明，任道群，等.酿酒用根霉若干菌株的培养特性研究[J].中国酿造，2006，25（10）：34-37.
[24] 许亮.枸杞果酒发酵过程中黄酮与多糖含量的变化动力学及其发酵条件优化[D].杨凌：西北农林科技大学，2011.
[25] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB 2758—2012食品安全国家标准发酵酒及其配制酒[S].北京：中国标准出版社，2012.
[26] 福建花丁酒业有限公司.Q/FJHD 0002S—2021米酒[S].福州：福建人民出版社，2021.
[27] 罗铝铿，邹浩元，杨宇辉，等.客家黄酒的抗氧化作用研究[J].中国酿造，2016，35（8）：61-65.
[28] 张金宝，邓源喜，童晓曼，等.山楂的营养保健功能及其应用进展[J].安徽农学通，2021，27（19）：116-118.
[29] 李艺凡.基于罐式混菌二次发酵复合型低度起泡酒的研发与评价[D].银川：宁夏大学，2018.