老面酵头，又称酸面团，是我国家庭自用和小作坊生产制作发酵面制品如馒头、包子的一种传统发酵剂，由谷物与水混合经微生物发酵后的一类多菌群组成的混菌发酵体系，其中优势菌群为酵母菌和乳酸菌[1]。老面酵头发酵主要采用传统自然发酵，其中的微生物来自于自然环境，在室温（20～30 ℃）长时间反复发酵，每次使用后留一部分（即发酵剂）重新接种至原料中用于下一次的发酵，这样的过程也称之为传代处理[2]。目前，我国发酵面制品的工业化生产主要采用活性干酵母粉发酵，具有快速、便捷和稳定等特点[3]。然而长期以来，以北方地区为代表的主食馒头，仍多沿用传统老面酵头发酵技术的作坊式加工方式，其主要原因在于老面酵头赋予馒头独特的质地和浓郁的风味，始终受到消费者们的青睐[4]。
风味物质主要由挥发性香气物质和非挥发性滋味物质构成[3]。目前，已有许多的研究运用代谢组学技术对食品、发酵制品及发酵过程中的风味物质进行定性定量分析[5-9]。关于酸面团馒头及面包等已成型面制品挥发性风味物质的研究也有较多报道[2，10]，但关于发酵面食品中非挥发滋味物质的研究相对较少[2，11]，尤其是对不同传代次数下非挥发滋味物质的变化及特征风味物质代谢形成机制研究更少。
基于此，本研究以老面酵头为研究对象，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UHPLC-QTOF-MS）非靶向代谢组学技术探讨老面酵头传代过程中（1代、2代和4代）风味物质的变化，通过主成分分析（principal component analysis，PCA）与正交偏最小二乘-判别分析（orthogonalpartialleastsquares-discriminantanalysis，OPLS-DA）等模式筛选差异代谢物，并分析相关的代谢通路，为老面酵头发酵生产中风味控制技术提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
老面酵头：实验室保存；中筋小麦粉：宁夏塞北雪面粉有限公司；甲醇、乙腈、氨水、水（均为色谱纯）：美国Fisher公司；醋酸铵（分析纯）：德国Sigma公司；2-氯苯丙氨酸（分析纯）：吉尔生化有限责任公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Acquity超高效液相色谱仪、ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）：美国Waters公司；QExactive高分辨质谱仪：美国ThermoFisherScientific公司；TGL-16K离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；JA 1003电子天平：上海力辰仪器科技有限公司；SCIENTZ-48研磨仪：上海净信科技有限公司；Integral 15纯水仪：德国Merck Millipore公司；SB25-12D超声仪：宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品采集
称取50.0 g实验室保存的老面酵头，加入105 mL蒸馏水室温下浸泡10 min，然后加入200 g小麦面粉，搅拌均匀；在温度为28～30 ℃、相对湿度为70%～75%的条件下发酵16 h，取样品，部分保存至-80 ℃冰箱；剩余部分重复上述操作，继续做传代处理，共传代4次，取第1代、第2代、第4代老面酵头，分别命名为G1、G2和G4。
1.3.2 样品预处理
将G1、G2和G4样品从-80 ℃冰箱中取出并在冰上解冻，取样品100 mg至2 mL EP管中，加入400 μL提取液（甲醇∶乙腈=1∶1，V/V）；涡旋振荡30 s，充分混匀，超声10 min，-20℃静置1h；将样本在4 ℃、13 000 r/min条件下离心15 min；取350 μL上清液于1.5 mL EP管中，在真空浓缩器中干燥提取物；向干燥后的代谢物加入150 μL提取液（乙腈∶水=1∶1，V/V）复溶，涡旋30 s，冰水浴超声10 min；将样本在4 ℃、13 000 r/min条件下离心15 min，取50 μL上清液于2 mL进样瓶进行检测分析。
1.3.3 UHPLC-QTOF-MS分析[12-13]
液相色谱条件：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相为A相（0.1%甲酸-水溶液）和B相（乙腈）；洗脱程序为95%A，0～1 min；5%A，1～13.5 min；95%A，13.5～16 min。
质谱条件：采用正负离子扫描模式。加热器温度300 ℃；鞘气流速45 arb；辅助气流速15 arb；尾气流速1 arb；电喷雾电压3.0 kv（正）和3.2 kv（负）；毛细管温度350 ℃；S-Lens RF Level为30%（正）和60%（负）；扫描模式为一级全扫描（70～1 050 m/z）与数据依赖性二级质谱扫描（dd-MS2，TopN=10）；分辨率70 000（一级质谱）和17 500（二级质谱）；碰撞模式为高能量碰撞解离。
1.3.4 数据处理与分析
将所得数据输入SIMCA软件包（version 14.0），利用主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）进行模式识别分析，筛选差异代谢物，作为老面酵头发酵的潜在特征物[14]。根据t检验的P值＜0.05，同时OPLS-DA模型第一主成分的变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）＞1，进行差异性代谢物的筛选[15]。通过差异代谢物对京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、PubChem等权威代谢物数据库进行映射，找到所有差异代谢物参与的通路；然后对差异代谢物所在通路综合分析，根据代谢通路富集分析的P值和通路综合重要性得分的Impact值，筛选出显著关键代谢通路，进行差异代谢物富集分析[16]。
2 结果与分析
2.1 多元变量分析
采用UHPLC-QTOF-MS分别对老面酵头样品G1、G2及G4的代谢物进行检测分析，并对检测数据进行PCA，PCA得分图见图1。
图1 基于UHPLC-QTOF-MS分析结果不同老面酵头样品的主成分分析得分图
Fig.1 Principal component analysis score plot of different sourdough samples based on UHPLC-QTOF-MS analysis results
由图1可知，样品在95%置信区间且组间分离程度良好，表明不同传代次数对老面酵头发酵过程有影响。
为验证模型的准确性，对UHPLC-QTOF-MS检测数据进行进一步OPLS-DA分析，OPLS-DA得分图见图2。由图2可知，老面酵头样品G1和G2、G2和G4均完全区分；但各组内样品呈现一定发散分布，说明老面酵头传代发酵过程中存在明显差异。G1和G2组与G2和G4组模型的可解释变量RX2分别为0.967和0.989，模型的可预测度Q2分别为0.962和0.966，说明该模型能很好地解释和预测两组样本之间的差异。
图2 基于UHPLC-QTOF-MS分析结果不同老面酵头样品的正交偏最小二乘－判别分析得分图
Fig.2 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis score plot of different sourdough samples based on UHPLC-QTOF-MS analysis results
采用置换检验通过随机多次改变分类变量Y的排列顺序次数（n=200）以获取随机模型的R2和Q2值进而验证模型的有效性[17]，结果见图3。
由图3可知，G1和G2组与G2和G4组的截距值R2分别为0.911和0.910，Q2分别为0.013和-0.232，表明建立的模型能够反映样本实际情况，说明基于UHPLC-QTOF-MS检测数据建立的OPLS-DA模型用于不同传代次数老面酵头间的区分是可信的。
图3 基于UHPLC-QTOF-MS分析结果不同老面酵头样品的响应排序检验图
Fig.3 Response ranking test chart of different sourdough samples based on UHPLC-QTOF-MS analysis results
2.2 差异代谢物的筛选和鉴定
基于OPLS-DA模型，以同时满足OPLS-DA模型第一主成分的VIP值＞1.0，t 检验的P值＜0.05为标准，筛选不同传代次数老面酵头样品间的差异代谢产物，计算代谢物在两组间表达量的差异倍数（fold change，FC）值，结果见表1。
表1 不同老面酵头样品间的差异代谢物
Table 1 Differential metabolites among different sourdough samples
续表
注：“-”表示不满足条件。
由表1可知，共筛选出7大类54种差异代谢物，差异代谢物的种类由多到少依次为氨基酸及肽类、糖类、酯类、有机酸类、其他类、胺类和醇类。
由表1可知，老面酵头样品G1和G2间的差异代谢产物数量明显多于样品G2和G4，可能是老面酵头传代过程中代谢产物种类更趋于稳定。对于差异代谢物的含量，样品G1和G2间的差异代谢物麦芽五糖、D-麦芽糖、α-D-葡萄糖、麦芽三糖、纤维二糖、D-阿洛糖、丝氨酸-赖氨酸-赖氨酸、丝氨酸-丝氨酸-精氨酸、丝氨酸-丝氨酸-精氨酸、1-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、三乙醇胺、鞘氨醇和和香兰素的相对含量均随传代次数的增加呈上升趋势（FC值＞1），尤其是丝氨酸-赖氨酸-赖氨酸、丝氨酸-丝氨酸-精氨酸、1-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、三乙醇胺、香兰素（FC值＞2），其余差异代谢物的相对含量呈下降趋势（FC值＜1），而样品G2和G4间的差异代谢物的相对含量均呈下降趋势（FC值＜1）。
酸化是老面酵头发酵的重要特征，适量的有机酸能够提升发酵米面制品的整体风味[18]。除有机酸外，在面团发酵过程中，微生物的蛋白水解作用以及面粉中的蛋白酶能够将面粉中的蛋白质分解为氨基酸，氨基酸的产生也是影响产品风味的重要因素[4，19]。本研究也证实了这一点，样品G1和G2与样品G2和G4间的差异代谢物主要为氨基酸及肽类，但是其相对含量较低。有研究表明是老面酵头中的微生物如乳酸菌和酵母菌大量消耗氨基酸以供生长需要，进而导致面团中氨基酸的含量降低[20]。老面酵头发酵过程中，麦芽糖是一类含量较高的糖类，主要是因为面粉中含有丰富的淀粉酶，能够将淀粉水解为麦芽糖。由表1亦可知，糖类的相对含量呈现先增加后减少的趋势，这可能是因为在发酵过程中，面粉中的淀粉在其内在α-淀粉酶的作用下被分解为麦芽糖和葡萄糖，从而使麦芽糖和葡萄糖的含量增加[21]；但是老面酵头中的糖酵解途径会利用和消耗面团中的葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖等糖类产生CO2和乙醇，保持面包及馒头疏松多孔的结构，使面团中麦芽糖、葡萄糖等糖类含量均有所减少[4，22]。对于酯类，脂肪水解生成的游离脂肪酸是发酵食品中特定香气的主要来源，脂肪酸经过分解代谢生成的仲醇、甲基酮、酯类和等挥发性香气物质，是馒头和面包等发酵面食品中的重要香气组成成分[23]。
2.3 差异代谢物的聚类分析
为了直观观察老面酵头传代发酵过程中差异代谢物相对含量的变化，依据每个差异代谢物的相对含量绘制热图，结果见图4。由图4可知，老面酵头样品G1和G2的差异代谢物数量明显多于样品G4，并且主要的差异代谢物集中在氨基酸及肽类，其次为有机酸类、糖类、胺类、醇类和其他类。闫博文[3]研究发现，传统老面酵头发酵制得馒头样品中的特征性差异滋味物质主要为氨基酸、有机酸、糖和醇类化合物，它们是赋予馒头麦香、果香和甜香等滋味的重要来源，与本研究结果一致。样品G1中氨基酸及肽类数量明显多于样品G2和G4，样品G2的糖类数量明显多于样品G1，说明在传代到第2代时产生了更多的糖类、尤其是麦芽糖。丙氨酸-亮氨酸-精氨酸、丝氨酸-丝氨酸-精氨酸、丝氨酸-赖氨酸-赖氨酸在样品G2和G4中相对含量比较高。有研究表明，酸面团发酵过程中，酵母菌的自身代谢需要消耗大量游离氨基酸，同时体系环境的限制使蛋白酶对谷物蛋白的降解作用减弱，进而导致面团体系中游离氨基酸及多肽的含量相对较低[23]，这可能是造成氨基酸及肽类在传代过程中相对含量逐渐降低的主要原因。
图4 不同老面酵头样品间的差异代谢物的层次聚类分析热图
Fig.4 Hierarchical clustering analysis heat map of differential metabolites among different sourdough samples
图中的颜色表示代谢物的相对含量；红色或蓝色强度高低分别表示相对含量的高低。
2.4 差异代谢物的代谢通路分析
老面酵头的发酵过程受到多种因素的共同调控，并不能仅仅根据某一物质的含量变化进行整体判断，需进一步对其代谢通路进行分析，找到发酵过程中潜在的代谢途径。因此，对老面酵头传代发酵过程中差异代谢物的代谢途径进行分析，结果见表2。由表2可知，参与老面酵头发酵过程的关键代谢通路有15条，分别为细胞凋亡、坏死性凋亡、鞘脂信号通路、鞘脂代谢、近端小管碳酸氢盐回收、碳水化合物消化吸收、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、味觉转导、淀粉和蔗糖代谢、磷酸转移酶系统（phosphotransferase system，PTS）、三磷酸腺苷-结合盒（adenosine triphosphate-binding cassette，ABC）转运蛋白、胆碱代谢途径、胰岛素抵抗、乙醚脂质代谢、甘油磷脂代谢的相关代谢途径。
表2 老面酵头传代发酵过程中差异代谢物的代谢通路分析结果
Table 2 Metabolic pathway analysis results of differential metabolites of sourdough during generation fermentation
由表2亦可知，15条关键代谢途径中主要参与的差异代谢物有14个，分别为鞘氨醇、鞘磷脂、L-谷氨酸、α-D-葡萄糖、麦芽三糖、D-麦芽糖、N-乙酰-L-天冬氨酸、纤维二糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、D-阿洛糖、3-磷酸甘油、1-（9Z-十八烯酰基）-sn-甘油-3-磷酸胆碱、甘油磷酸胆碱、乙酰肉碱。其中D-麦芽糖（5条）、L-谷氨酸（4条）、鞘氨醇（4条）、鞘磷脂（3条）、纤维二糖（3条）、甘油磷酸胆碱（3条）均参与了3条以上的代谢途径，而同一代谢物若同时参与了多条代谢通路，说明该差异代谢物对通路具有较大的影响，可视为关键代谢产物。
D-麦芽糖、纤维二糖、麦芽三糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、D-阿洛糖、3-磷酸甘油均参与腺苷三磷酸结合盒（adenosine triphosphate-binding cassette，ABC）转运蛋白。ABC转运蛋白是一类跨膜蛋白，能够利用腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）水解产生的能量将底物如糖类、氨基酸、有机酸、多肽、蛋白质等无机物和有机物进行跨膜运输，进而参与营养摄入、脂质稳态、信号转导等重要的生理过程[24]。氨基酸、有机酸、糖类的代谢与合成增强对产品风味有重要影响。老面酵头在发酵过程中，酵母菌和乳酸菌均能够利用面团中的葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖等可发酵糖类进行糖类代谢。在麦芽糖磷酸化酶的作用下，麦芽糖优先被水解生成葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖-1-磷酸则进一步代谢生成乙酸、乳酸、乙醇、甘油等风味化合物，同时部分的可发酵糖类会转化成乙醇和二氧化碳使制品疏松多孔外，还能够将剩余的糖分解成酯类、醇和脂肪酸等风味化合物[19，25]。L-谷氨酸、N-乙酰-L-天冬氨酸主要参与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。杨浣漪[4]对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）与旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis）混合发酵引起的酿酒酵母表达明显变化的基因进行基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析发现，酿酒酵母的氨基酸（甘氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等）代谢与合成过程都有显著的差异，并且这些过程的改变对馒头的品质均会有一定的影响，这与本研究的谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸代谢是关键代谢产物的研究结果一致。1-（9Z-十八烯酰基）-sn-甘油-3-磷酸胆碱、甘油磷酸胆碱参与胆碱代谢、甘油磷脂代谢；甘油磷酸胆碱还参与乙醚脂质代谢。脂质的代谢对细胞、组织等生理功能的调控具有重要影响，如肥胖、肿瘤、冠心病、糖尿病等病症的产生主要是异常的脂质代谢存在于病理性紊乱中[26]；并且食品加工中的脂质变化如脂质水解、脂质氧化、脂质聚合及美拉德反应等均对食品质量有一定的影响[27]。磷酸胆碱可作为食品添加剂如润湿剂、乳化剂、酿造制品的品质改良剂等应用于乳制品、点心、饼干、蛋糕等制品中，进而提高制品的软绵性和酥松性[28]。鞘氨醇、鞘磷脂参与坏死性凋亡、鞘脂信号通路、鞘脂代谢途径。鞘磷脂由鞘氨醇、脂肪酸、磷酸与含氮碱基组成。在质膜上，鞘脂可以转化为鞘氨醇，再被鞘氨醇激酶催化生成鞘氨醇1-磷酸，而鞘氨醇1-磷酸也属于溶血磷脂，是重要的生物活性介质，参与多种信号转导途径，调节多种不同的细胞功能[29]。
3 结论
本研究采用UHPLC-QTOF-MS的非靶向代谢组学技术研究方法，通过KEGG数据库注释差异代谢物，从老面酵头传代发酵过程中共检测到54种非挥发性差异代谢物，主要的差异代谢物种类为氨基酸及肽类、有机酸类、糖类，随着传代次数的增加，差异代谢产物数量明显减少，代谢产物种类和数量更趋于稳定。氨基酸及肽类和有机酸类总体呈下降趋势，而糖类总体呈先上升后下降趋势。通过差异代谢物的聚类分析，老面酵头发酵1代和2代的差异代谢物数量明显多于4代。根据代谢通路富集分析的P值和通路综合重要性得分的Impact值，筛选出15条与代谢物差异相关性较高的关键通路和14种主要参与的差异代谢物。其中，D-麦芽糖、纤维二糖、L-谷氨酸、鞘氨醇、鞘磷脂、甘油磷酸胆碱均参与了3条以上的代谢途径，被视为关键代谢产物。本研究结果可为老面酵头发酵过程中风味控制技术提供一定的理论参考。
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