苹果酒是以苹果或苹果汁为主要原料，发酵而成的富含氨基酸、有机酸、酚类物质、维生素等多种营养成分的低酒精度饮品[1-2]，近年来，凭借其良好的口感和较高的保健价值而深受消费者喜爱，是仅次于葡萄酒的世界第二大果酒[3]。
我国虽是苹果生产的第一大国，但苹果酒产业起步较晚，主要的推广品种大多为鲜食品种，其风味与英、法、美等欧洲国家的酿酒品种截然不同。近年来，为了提高苹果酒的品质，研究者们在苹果原料[4]、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的筛选[5-6]、酿酒工艺的优化[7-9]等方面进行了大量研究工作。其中，酿酒原料的种类和品质直接影响苹果酒的品质和质量。ZHENG H Z等[10]研究表明，苹果的品种特性、基本成分（硬度、糖度、酸度、多酚含量）和成熟度等因素都影响着最终苹果酒的品质。王玉莹等[11]研究发现，不同品种（系）苹果所酿酒的品质评价指标与果汁的组成成分密切相关。苹果酒的酒精度与原料苹果汁的含糖量呈正相关，苹果酒的单宁含量和色差值与原料苹果汁的单宁含量和色差值也呈正相关。用于苹果酒酿造苹果汁包括苹果鲜汁和苹果浓缩汁，但长期研究和生产实践证明，苹果鲜汁在发酵特性、发酵成品感官等方面存在明显优势，因此苹果酒的酿造以苹果鲜汁为宜[12]。国外苹果酒的酿造倾向于采用专用的酿酒苹果为原料，这些酿酒苹果大多果实较小，糖、酸含量较高，苹果香气浓郁，理想的酿酒苹果汁糖含量为15%、苹果酸含量为0.4%、单宁含量为0.2%。但我国缺乏酿酒专用苹果品种，只能在现有苹果品种的基础上选择成分和发酵特性接近酿酒专用苹果的品种进行苹果酒的酿造。李国薇[13]以陕西省的主栽鲜食品种‘金世纪’、‘富士’、‘秦冠’、‘乔纳金’、‘玉华早富’和‘红星’为材料酿造苹果酒，结果表明，‘富士’这一苹果品种的发酵特性相对较稳定，可得到感官较佳的苹果酒，但整体而言理化指标上与专用的酿酒品种存在一定的差距。因此，可采用精选优势品种进行混合的方法来弥补单一品种的不足。
‘金世纪’作为西北农林科技大学2009年选育的苹果新品种，肉质细脆、酸甜可口，风味浓郁，目前在陕西渭北地区大面积推广种植[14]。‘嘎啦’苹果原产新西兰，其肉质致密，细脆、汁多，味甜微酸，陕西渭北旱塬是符合其生态适宜指标的最佳区域[15]。‘澳洲青苹’原产澳大利亚，果肉绿白色，充分成熟后为白色，肉质中粗、致密、硬脆。汁液较多，味酸，是一种鲜食和加工兼用的优良苹果品种[16]。
本研究分别以产自陕西本地的‘金世纪’单一苹果品种和‘金世纪’、‘嘎啦’和‘澳洲青苹’三个混合苹果品种（1∶1∶1）为原料，利用葡萄汁有孢汉逊（Hanseniaspora uvarum）云-268酵母，采用传统工艺酿造苹果酒，通过对所获得的两种苹果酒的理化指标、酚类物质及香气成分进行测定，并进行感官品评，比较单一苹果品种和混和苹果品种酿造苹果酒的特点，旨在开拓苹果酒市场，促进苹果加工业的发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
‘嘎啦’苹果、‘金世纪’苹果、‘澳洲青苹’：陕西杨凌农贸市场；葡萄汁有孢汉逊（Hanseniaspora uvarum）云-268酵母、果胶酶（酶活8 600 U/g）：丹麦维诺酿公司；皂土：法国LAFFORT公司；多酚标准物（没食子酸、原花青素B1、原儿茶酸、绿原酸、儿茶素、原花青素B2、龙胆酸、表儿茶素、咖啡酸、反式对香豆酸、芦丁、虎杖苷、反式阿魏酸、槲皮素-3-D-β-葡萄皮糖苷、杨梅素、根皮苷、白藜芦醇、槲皮素、芹菜素、山奈酚）（均为色谱纯）：美国Sigma Aldrich公司。其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
AUX320分析天平：日本岛津公司；UPLC1-Class超高效液相色谱仪：美国Waters公司；KH-500DE超声波清洗仪：昆山合创超声仪器有限公司；Gary-60紫外可见分光光度计：安捷伦科技（中国）有限公司；TRACE1310-ISQLT气相色谱质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；RHB手持折光仪：广州立辰科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 苹果酒酿造工艺及操作要点
操作要点：
选择成熟度好、无腐烂的苹果进行清洗和分选，切块后放入抗氧化剂（1.5%柠檬酸和0.05%异抗坏血酸混合溶液）中浸泡15 min进行护色处理，护色后捞出苹果块，快速控水并榨汁。获得的苹果汁和果浆液加入至发酵罐中并按照120 mg/L的质量浓度添加二氧化硫（偏重亚硫酸钾）防止氧化。果浆入罐后添加60 mg/L果胶酶并放置在-4 ℃冷库中静置24 h。静置后对果浆进行第二次压榨，把果渣和果汁分离，取上层清液发酵。每组酒样按照0.2 g/L酵母量添加酿酒酵母。整个发酵过程保证温度控制在18 ℃左右以获得更好的口感，每日监测比重值和含糖量并记录发酵液的颜色、香气和口感，当残糖降至45 g/L时终止发酵，此时比重在1.025～1.030之间。发酵结束后，添加二氧化硫和山梨酸钾以终止发酵，转罐后放入4 ℃冷库中，防止苹果酒因含糖量过高产生二次发酵。静置后加入皂土进行澄清处理后再次转罐，在4 ℃酒窖陈酿12个月，经过巴氏杀菌后无菌灌装，即得苹果酒。
1.3.2 试验设计
根据苹果品种的不同，共进行两组发酵试验。选用‘金世纪’单一品种苹果进行发酵；选用‘嘎啦’、‘金世纪’、‘澳洲青苹’三个苹果品种，以1∶1∶1的比例混合发酵，两组苹果酒的发酵工艺相同。
1.3.3 分析检测
苹果酒中的还原糖、酒精度、总酸参照王华[17]的方法进行测定；可溶性固形物采用手持折光仪进行测定，pH采用精密酸度计进行测定；酚类组成的测定参考曹铭等[18]的高效液相色谱法，香气物质的测定参考荆思思等[19]的GC-MS方法。
1.3.4 感官品评
由20位有果酒品鉴经验并受过相关培训的人员组成品鉴组，参照山东省苹果酒地方标准DB37/T 804—2007《苹果酒》[20]，按照评价表1感官评分标准，分别从色泽、澄清度、香气、风味平衡、回味和总体评价等六个方面进行打分，各项满分均为10分，总分60分。
表1 苹果酒感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of cider
1.3.5 数据处理
采用Microsoft Office Excel 2010和GraphPad Prism 7.0分别进行数据处理和作图；IBM SPSS Statistics 21.0进行显著性分析，不同字母表示存在显著性差异（P＜0.05）。
2 结果与分析
2.1 两种苹果酒基本理化指标的比较
用于酿造苹果酒的理想苹果汁，糖含量应为15%以上，滴定酸含量应在3～5 g/L之间[13]。由表2可知，两种苹果鲜汁中，总糖含量均在14%～15%之间，滴定酸分别为3.23 g/L和3.43 g/L，基本符合酿造苹果酒的要求。经过发酵，两款苹果酒的总糖含量显著降低（P＜0.05）：可溶性固形物含量降低至4.97%和4.57%，说明葡萄汁中的糖得到了充分的利用，被转化为酒精，酒精度分别为7.18%vol和7.42%vol；另外，在发酵过程中，产生大量有机酸，如乳酸、柠檬酸、乙酸、琥珀酸，使得滴定酸的含量显著升高[21]。总的来说，混合苹果果汁和金世纪苹果果汁及其所酿造的苹果酒均符合山东省苹果酒地方标准，二者的可溶性固形物、滴定酸、还原糖含量虽有差异，但差异均不显著（P＞0.05）。
表2 两种苹果酒的基本理化指标测定结果
Table 2 Determination results of basic physicochemical indexes of two kinds of ciders
注：同行不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
2.2 两种苹果酒酚类物质种类和含量的比较
不同苹果品种苹果果汁和果酒中酚类物质含量测定结果见表3。
表3 不同苹果品种苹果果汁和果酒中酚类物质含量测定结果
Table 3 Determination results of phenolic contents in apple juice and ciders of different apple varieties
由表3可知，苹果酒样中共检测出7种酚类物质，分别为酚酸类的没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸和黄酮类的儿茶素、原花青素B2和表儿茶素，与李国薇等[13]关于‘金世纪’苹果酒的研究结果相比，所检测出的酚类物质数量一致，但种类不完全一致，该研究表明，以‘金世纪’为原料的样品中主要多酚为表儿茶素、绿原酸和咖啡酸，而本研究中主要的多酚为绿原酸、表儿茶素和原花青素B2，这可能是由于酿酒酵母菌株不同，其在发酵过程中的代谢差异导致的。没食子酸含量在果汁中差异不显著（P＞0.05），但在混合苹果品种发酵苹果酒中的含量显著高于单一苹果品种发酵苹果酒（P＜0.05），推测在酵母菌和果胶酶的共同作用下，苹果酒中的没食子酰基酚被酶解而生成没食子酸，从而使混合苹果品种发酵释放出更多的没食子酸成分[22]；原儿茶酸、儿茶素、原花青素、表儿茶素和绿原酸五种多酚类物质在果汁和酒中均呈现显著差异，其中，没食子酸、儿茶素、原花青素和表儿茶素含量均显著高于单一苹果品种发酵苹果酒（P＜0.05），尤其是原花青素虽在‘金世纪’苹果果汁中未检测到，但在‘金世纪’苹果酒中其含量升至7.72 mg/L；咖啡酸与没食子酸类似，在果汁中未见显著差异，但在酒中呈现显著差异，另外，在果汁中，咖啡酸含量混合苹果品种发酵苹果汁、苹果酒中的含量低于‘金世纪’苹果单独发酵，而绿原酸正好相反，这与曹铭等[15]研究结果一致，可能是由于苹果酒发酵过程中，一部分绿原酸和其他一些缩酚酸被酶水解，转化为咖啡酸的结果[17]。从酚类物质含量来看，混合品种酿制的苹果酒更好，因其总酚含量高于单一品种酿制苹果酒，酚类物质具有较强的抗氧化功能，被证明具有抗炎症、调节肠道微生物菌群及抗衰老等多种功能[23-24]，因此混合品种酿制的苹果酒的营养保健功能更强。
2.3 两种苹果酒香气成分的比较
两种苹果酒的香气成分测定结果见表4。由表4可知，‘金世纪’苹果单独发酵苹果酒中共检测出香气成分48种，香气物质总含量为26.67 mg/L，包括酯类9种、醇类15种、酸类9种、萜烯类2种及其他类13种，其中含量较高的香气成分包括乙酸丙酯（5.16 mg/L）、异戊醇（78.85 mg/L）、2-苯乙醇（12.99 mg/L）、乙酸（27.24 mg/L）、异丁醇（19.17 mg/L）、1-丁醇（5.28 mg/L）等，与王洋洋等[25]的结果相吻合。混合苹果品种发酵苹果酒共检测出香气成分51种，香气总量为15.49 mg/L，包括酯类10种、醇类16种、酸类9种、萜烯类2种及其他类14种，其中相对含量较高的香气成分包括乙酸乙酯（61.45 mg/L）、乙酸丙酯（13.05 mg/L）、异戊醇（216.83 mg/L）、正己醇（8.16 mg/L）、2-苯乙醇（45.43 mg/L）、乙酸（149.44 mg/L）、（E）-3-己烯-1-醇（10.81 mg/L）、异丁醇（50.16 mg/L）等。结合已报道的感觉阈值和香气描述相关文献计算香气物质的香气值，据此确定样品的特征香气成分。香气活度值（ordor activity value，OAV）是香气物质浓度与其香气阈值之比。OAV＞1的香气物质可被认定为特征香气[26]。如表4所示，‘金世纪’单一品种所酿苹果酒的特征香气物质包括乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯、异戊醇、正己醇、2-甲基-3-丁烯-2-醇、1-辛烯3-醇、己酸、辛酸等，而混合品种所酿苹果酒的特征香气物质包括乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、异戊醇、正己醇、2-苯乙醇、乙酸、异丁酸、己酸、辛酸，二者共有的特征香气物质有乙酸乙酯、乙酸丙酯、异戊醇、正己醇、己酸、辛酸6种物质，其他物质赋予两款苹果酒以独特的风味，其中，乙酸丁酯、2-苯乙醇、异丁酸仅在混合品种酿制的苹果酒中OAV＞1，说明混合品种酿制苹果酒相比于‘金世纪’单一品种苹果酒具有更浓郁的香蕉、菠萝、草莓香、玫瑰花、蜂蜜香及奶酪味。另外，相对于‘金世纪’单一品种所酿苹果酒，混合品种苹果酒中检测到乳酸乙酯和糠醛，虽然其OAV＜1，但其同样能够增加酒体的香气和协调性，上述两种物质分别赋予混合品种苹果酒以奶油味和烘烤味。
表4 两种苹果酒的香气成分测定结果
Table 4 Determination results of aroma compounds in two kinds of ciders
续表
注：“ND”表示未检出，“Na”表示未查阅到该物质的香气阈值或香气描述，同一行不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
醇类香气是苹果酒中最丰富的风味物质，赋予酒体水果香味，主要来自于酒精发酵，是糖类和氨基酸由酵母菌代谢产生的物质[27-29]。两种苹果酒中共检出17种醇类物质，共有的醇类有13种，其中异戊醇、苯乙醇、异丁醇、正己醇、（E）-3-己烯-1-醇占主要部分，异戊醇是2种苹果酒中含量最高的醇类物质，这与王洋洋等[25]的结果一致。异戊醇在混合苹果品种发酵苹果酒中含量显著高于‘金世纪’苹果单独发酵苹果酒（P＜0.05），可能是三个品种叠加的结果，而且在两种酒中的含量均高于其嗅闻阈值（30 mg/L）[30]，赋予苹果酒白兰地香气和辛辣味[25]。另外，苯乙醇也是两种苹果酒中含量较高的醇类物质，它是莽草酸类的衍生物，在混合苹果品种发酵苹果酒中的含量也显著高于‘金世纪’单独发酵苹果酒（P＜0.05），且远高于其嗅闻阈值（14 mg/L）[31]，赋予苹果酒浓郁的玫瑰香味[32]。
酯类香气作为两组苹果酒中的第二大香气成分，是由高级醇和脂肪酸在酶的催化作用下形成的，使苹果酒具有丰富的果香和花香。‘金世纪’单独发酵苹果酒中共检出10种酯类，混合苹果品种发酵苹果酒中共检出9种酯类。各组分含量呈现出差异，其中乙酸乙酯、乙酸丙酯、乳酸乙酯和乙酸己酯是主要的酯类物质，前三者在混合苹果品种发酵苹果酒中均显著高于‘金世纪’单独发酵苹果酒（P＜0.05），赋予其草莓、香蕉香味、苹果、梨子和树莓等果香味[33]，而乙酸己酯在‘金世纪’酒中含量显著高于复合果酒（P＜0.05）。
酸类物质通常赋予葡萄酒以奶酪气息，两组中均检测到10种酸类物质，主要是异丁酸、异戊酸、己酸和辛酸等，这些酸在混合苹果品种发酵苹果酒中的含量均显著高于‘金世纪’单独发酵苹果酒（P＜0.05），使得混合苹果品种发酵苹果酒的香气更加复杂。
萜烯类香气物质，作为植物的次生代谢物，其香气阈值较低，在浓度较低时对酒体香气的贡献也较大[34]。在本实验中的两种苹果酒中，共检测到香茅醇、芳樟醇两种萜烯类物质，香茅醇赋予苹果酒丁香花和蔷薇花香[28]。通过对香气物质的对比和分析，可以看出‘金世纪’单独发酵苹果酒由于是单品种发酵，其香气物质的种类和大多数香气物质的含量均少于混合苹果品种发酵苹果酒，并且其香气主要以果香为主，而混合苹果品种发酵苹果酒除了具有更加浓郁的果香、花香等，还富含酸类、酯类等物质，具有烘烤、奶油等发酵香气，表明混合苹果品种所酿苹果酒的香气复杂度更高。
2.4 苹果酒的感官品鉴结果
品鉴小组对两款苹果酒进行品评分析，结果见图1。由图1a可知，两款苹果酒各有特点，总体上酒液澄清，色泽饱满，口感为半甜型，酸度适中，较为清爽。混合苹果品种酿造的苹果酒在澄清度、回味、香气、风味平衡方面得分（分别为10.0分、8.6分、8.1分和8.2分）均高于‘金世纪’单独发酵苹果酒（分别为9.5分、8.1分、7.5分和7.8分），混合苹果品种发酵苹果酒总体评分（8.9分）高于‘金世纪’单独发酵苹果酒（7.7分）仅在色泽方面得分（8.2分）略低于‘金世纪’单一品种所酿苹果酒（8.6分）。由图1b可知，‘金世纪’单独发酵苹果酒的香气以热带水果和仁果香气比较突出，柑橘类和花香也较明显，而混合苹果品种发酵苹果酒的香气更复杂一些，比较突出的香味除了柑橘类、花香之外，还具有明显的烘烤类和植物类香气，这与上述对于香气的测定结果相一致。
图1 两种苹果酒感官评价（a）及香气特征（b）雷达图
Fig.1 Radar map of sensory evaluation (a) and aroma characteristics (b) of two kinds of ciders
3 结论
总体来说，混合苹果品种发酵苹果酒与‘金世纪’单独发酵苹果酒的基本理化指标均符合苹果酒的酿造质量标准，但二者差异不显著；两款苹果酒中均检测到7种酚类物质，7种物质在二者所酿苹果酒中均呈现显著差异。香气方面，混合苹果品种发酵苹果酒与‘金世纪’单独发酵苹果酒中分别检测出51种、48种香气物质，其中醇类和酯类物质最为丰富，大多数香气物质在前者中高于后者。混合苹果品种发酵苹果酒在澄清度、回味、香气、风味平衡方面得分均高于‘金世纪’单一品种所酿苹果酒，仅在色泽方面得分略低。结果表明，混合苹果品种更适合苹果酒酿造，但颜色方面，还需进一步改善，后期研究应着重探索不同苹果品种的发酵适性，根据各自特点，有针对性的对混合品种的种类、比例及发酵工艺进行优化，来酿出口感更好的苹果酒，增加其保健功能以及香气的浓郁度和复杂度。
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