大曲是以小麦、大麦等谷物为原料，采用生料制曲、自然接种，在培养室内固态发酵而成，是白酒酿造所需的糖化发酵剂和生香剂[1-3]。高温大曲以小麦为主要原料，制曲过程中品温可达65 ℃左右，主要用于生产酱香型白酒[4-5]。高温大曲中丰富的风味物质赋予其浓郁的曲香，而曲香是高温大曲质量的重要指标[6-7]。因此，研究高温大曲风味物质含量和组成有助于大曲分类与质量评价。
大曲是固体状态，需要对大曲样品进行前处理，一种方法是可从样品的顶空气体提取，如顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）[8-9]，另一种方法是将固体样品转换为液体样品，再对液体样品进行提取，包括液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）、溶剂辅助风味蒸发法（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）、同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）、索氏提取（soxhlet extraction，SE）、搅拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）等[10]。大曲样品经过前处理后采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[11]、全二维气相色谱-飞行时间质谱（comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC-TOF/MS）[12]、液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）等手段进行分离检测。由于固相微萃取技术是集采样、萃取、浓缩和进样于一体的无溶剂样品微萃取技术[13]，目前在大曲风味物质分析应用较多[14-15]。但是固相微萃取方法多采用峰面积归一化法和内标法进行半定量分析[16-18]，未能实现大曲风味物质的准确定量。有学者采用内标法建立标准曲线定量分析大曲风味物质，然而酸类物质需要采用溴化苄衍生化方法进行定量[19]。此外，液液萃取（LLME）大曲风味分析中另一种前处理方法，具有操作简单、回收率高等优势，但缺点是样品和试剂使用量大[20]，并且大曲中富含油脂、色素、蛋白质以及糖类[21]，这些不挥发性物质严重影响气相色谱对挥发性风味化合物的检测。赵金松等[22]采用液液萃取法分析大曲风味物质时的有机溶剂乙醚用量为300 mL，之后需要加入无水硫酸钠除水和氮吹浓缩，该方法存在有机溶剂用量大、需要除水浓缩等问题。
本研究以高温大曲作为研究对象，采用液液微萃取（liquid-liquid microextraction，LLME）法提取高温大曲中风味物质，通过优化样品用量、提取溶剂、提取方式、萃取剂种类及用量、漩涡振荡萃取时间前处理条件，建立液液微萃取（LLME）结合气相色谱质谱（GC-MS）联用技术定量分析高温大曲风味物质的方法，并对该方法进行方法学评价，以期为高温大曲风味物质分析提供新的技术手段，对于研究高温大曲中风味物质含量和组成，以及对大曲中风味物质的评价具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
高温大曲（编号1、2、3、4、5）：来源贵州茅台酒股份有限公司制曲车间，其中试验优化选取高温大曲2号样品。
1.1.2 试剂
乙醚、戊烷、氯化钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；己烷（色谱纯）：美国Tedia公司；乙酸乙酯（色谱纯）：德国Merck公司；乙醇（99.9%）：美国ACS公司；乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、苯甲酸、苯乙酸、β-苯乙醇、苯甲醇、苯甲醛、2,3-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-吡咯甲醛、2-乙酰基吡咯、2,3-丁二醇、丙三醇、香茅醇、4-乙烯愈创木酚、3-羟基-2-丁酮、二甲基三硫（纯度均≥98%）：美国Sigma公司；戊酸、己酸（纯度均≥98%）：美国Chem service公司；香草醛（99%）：北京百灵威科技有限公司。
1.2 仪器与设备
7890A-5975C气质联用仪：美国安捷伦公司；PL3002电子天平：瑞士Mettler Toledo公司；KS260basic摇床：德国IKA公司；8510超声波清洗机：美国Branson公司；SI-T256可调速计时漩涡混合器：美国Scientific Industries公司；Sigma 2-16离心机：德国Sigma公司。
1.3 方法
1.3.1 液液微萃取前处理
称取10 g经粉碎后的大曲样品于50 mL离心管中，加入30 mL体积分数40%乙醇，以转速为450 r/min的摇床振摇15 min；4 000 r/min离心6 min，吸取10 mL上层清液于20 mL样品瓶中，加入3.6 g氯化钠，然后加入1 mL乙醚/戊烷为萃取剂，漩涡振荡2 min萃取；最后2 000 r/min离心2 min，吸取上层乙醚相用于GC-MS分析。
1.3.2 液液微萃取条件优化
在方法1.3.1的基础上对高温大曲进行前处理，在其他条件恒定的条件下分别考察大曲用量（2.5 g、5 g、10 g、15 g、20 g）、乙醇体积分数（10%、20%、30%、40%、50%）、提取方式（A：450 r/min振摇15 min；B：超声5 min；C：先450 r/min振摇10 min，再超声5 min；D：先450 r/min振摇15 min，再超声5min；E：先450r/min振摇20min，再超声5 min；F：先450 r/min振摇15 min，再超声10 min）、萃取剂种类（戊烷、己烷、乙醚、乙醚：戊烷（1∶1，V/V）、乙酸乙酯）、萃取剂用量（1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL）、漩涡振荡萃取时间（5 s、10 s、20 s、40 s、60 s、120 s）对萃取效果的影响。根据总峰数和总峰面积，对大曲液液微萃取前处理条件进行优化。
1.3.3 GC-MS分析条件
GC条件：DB-FFAP色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度230 ℃，载气为高纯氦气（He），流速1 mL/min，不分流进样，进样量1 μL；升温程序为初始温度60 ℃，保持1 min，然后以20 ℃/min升至100 ℃，再以6 ℃/min升至110 ℃，再3 ℃/min升至140 ℃，最后以5 ℃/min升至220 ℃，保持28 min。
质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量为70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，采用全扫描分析风味物质总峰数和总峰面积，采用选择离子扫描（single ion monitoring，SIM）对风味物质进行精确定量。
定性定量分析：通过美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）谱库检索、标准品比对定性25种大曲风味物质[23]。采用内标法进行定量分析，往样品瓶内加入3 μL 11 727 mg/L香茅醇内标到10 mL风味物质的标准溶液中，以风味物质与内标质量浓度的比值为横坐标（x）、以风味物质与内标峰面积的比值为纵坐标（y）绘制风味物质标准曲线，得到大曲风味物质标准曲线回归方程。通过安捷伦化学工作站（Agilent Chemstation）软件计算待测样品中风味物质含量。
2 结果与分析
2.1 液液微萃取条件优化
2.1.1 样品用量的选择
考察样品用量对风味物质总峰面积和总峰数的影响，结果见图1。由图1可知，大曲用量为2.5～20 g时，总峰面积逐渐增加。大曲用量为2.5～15 g时，总峰数随大曲用量增大而增大；大曲用量为15 g时，总峰数均达到最大值254个，总峰面积为7.7×108；大曲用量＞15 g时，总峰数下降，说明大曲中风味物质萃取不完全。综合考虑，选择样品用量为15g。
图1 大曲样品用量对萃取效果的影响
Fig. 1 Effect of Daqu sample dosage on extraction efficiency
2.1.2 提取溶剂的选择
高温大曲中含有大分子亲水蛋白质等表面活性物质，在液液微萃取过程中容易产生乳化现象[28]，不利于萃取的进行。实验中发现当提取溶剂的酒精度较高时，可有效减少乳化现象的产生，但酒精度过高时不利于大曲中风味物质的富集。考察了不同乙醇体积分数对总峰数和总峰面积的影响，结果见图2。由图2可知，随着乙醇体积分数在10%～40%范围内的增加，总峰数和总峰面积呈上升趋势；当乙醇体积分数为40%时，总峰数和总峰面积均达到最大值，分别为292个、16.1×108。当乙醇体积分数＞40%，总峰数和总峰面积均下降。故确定最优提取溶剂为乙醇体积分数40%。
图2 乙醇体积分数对萃取效果的影响
Fig. 2 Effect of ethanol volume fraction on extraction efficiency
2.1.3 提取方式的选择
振荡提取和超声提取是两种常见的风味物质提取方法，其中振荡提取主要通过加大溶剂流动性，将样品充分混匀提取其中风味物质；超声提取则是通过物理破碎对样品进行深度提取[24]。固定摇床转速为450 r/min，超声功率为120 W，考察不同提取方式对风味物质总峰数和总峰面积的影响，结果见图3。由图3可知，提取方式D（即先450 r/min振摇15 min，再超声5 min）的总峰数、总峰面积均达到最大值，分别为278个、10.2×108。考虑操作简便性，选择最优提取方式为D，即先450 r/min振摇15 min，再超声5 min。
图3 提取方式对萃取效果的影响
Fig. 3 Effect of extraction method on extraction efficiency
2.1.4 萃取剂种类的选择
戊烷、己烷、乙醚、乙酸乙酯是常见的萃取剂[25-26]，具有沸点低、易除去等优点，由于极性、水溶性等的差异，不同萃取剂对风味物质具有不同的选择性和萃取效果。分别选用1 mL戊烷、己烷、乙醚、乙醚∶戊烷（1∶1，V/V）、乙酸乙酯为萃取剂，考察不同萃取剂对总峰数和总峰面积的影响，结果见图4。由图4可知，萃取剂为乙醚时，总峰数和总峰面积均达到最大值，分别为288个、11.0×108。故选用乙醚作为萃取剂。
图4 萃取剂对萃取效果的影响
Fig. 4 Effect of extraction solvent on extraction efficiency
2.1.5 萃取剂乙醚用量的选择
萃取剂用量的增加有利于更多风味物质的萃取，但用量过大会导致稀释效应大于提取效率[27]，影响低浓度物质的分析。考察萃取剂乙醚用量对总峰数和总峰面积的影响，结果见图5。由图5可知，当萃取剂乙醚用量为2 mL时，总峰数和总峰面积均达到最大值，分别为290个、16.0×108。故确定萃取剂乙醚用量为2 mL。
图5 乙醚用量对萃取效果的影响
Fig. 5 Effect of ether dosage on extraction efficiency
2.1.6 漩涡振荡萃取时间的选择
考察漩涡振荡萃取时间对萃取效果的影响，结果见图6。由图6可知，随着漩涡振荡时间在5～40 s范围内增加，总峰数和总峰面积呈上升趋势；当漩涡振荡时间为40 s时，总峰数和总峰面积分别为292个、16.2×108，之后总峰数和总峰面积均无明显变化。故确定漩涡振荡时间为40 s。
图6 漩涡振荡时间对萃取效果的影响
Fig. 6 Effect of vortex oscillating time on extraction efficiency
综上，液液萃取的前处理条件如下：大曲样品用量为15 g，提取溶剂为体积分数40%乙醇，提取方式为先450 r/min振摇15 min，再超声5 min，萃取剂为乙醚，用量为2 mL，漩涡振荡时间为40 s。
2.2 方法学评价
液液微萃取结合气相色谱质谱分析高温大曲中风味物质的方法学评价结果见表1。
表1 液液微萃取结合气相色谱质谱分析高温大曲中风味物质的方法学评价
Table 1 Methodological evaluation of liquid-liquid microextraction combined with GC-MS for analyzing flavor compounds in high-temperature Daqu
由表1可知，所定量的大曲样品中的25种风味物质在各自质量浓度范围内线性关系良好，相关系数R2均≥0.99。通过计算5次平行样的相对标准偏差（relative standard de viation，RSD）考察方法的精密度，按信噪比（signal to noise ratio，S/N）≥3确定其检出限，按信噪比S/N≥10确定其定量限。该方法测定25种大曲风味物质的RSD均≤7.26%，方法的加标回收率为80.25%～119.26%，方法的检出限为0.13～50.17 μg/kg，方法的定量限为0.44～167.22 μg/kg，说明方法的重现性好，准确度及精密度高，可满足准确定量分析要求。
2.3 高温大曲风味物质的测定
采用优化确定的前处理条件，对高温大曲样品中风味物质进行分析，其风味物质GC-MS总离子流色谱图见图7，高温大曲风味物质含量测定结果见表2。由图7和表2可知，大曲样品中的25种风味物质均可检出，但所分析的高温大曲中各风味物质含量差异较大，醇类和酸类化合物含量较高，其中含量最高的前3个风味物质分别为丙三醇、2,3-丁二醇、乙酸。
图7 高温大曲样品风味物质GC-MS总离子流色谱图
Fig. 7 Total ion chromatography of the flavor compounds in hightemperature Daqu samples analyzed by GC-MS
编号1～25代表的风味物质如表2所示。
表2 高温大曲样品风味物质GC-MS分析测定结果
Table 2 Determination results of flavor compounds in high-temperature Daqu samples analysis by GC-MS mg/kg
3 结论
本试验建立液液微萃取结合气质联用仪分析高温大曲中风味物质，优化样品前处理条件，并采用内标法定量分析了25种风味物质，包括7种酸类化合物、6种芳香族化合物、5种吡嗪类化合物、2种杂环类化合物、2种醇类化合物、1种酚类化合物、1种酮类化合物和1种含硫化合物。所建方法的大曲风味物质在各自线性范围内标准曲线线性良好，相关系数R2均≥0.99，精密度试验相对标准偏差（RSD）≤7.26%，方法的加标回收率为80.25%～119.26%，检出限为0.13～50.17 μg/kg，定量限为0.44～167.22 μg/kg，可满足准确定量分析要求。该方法具有简便、快速、成本低等优点，可用于高温大曲的风味物质分析，并为其他大曲以及其他固体样品的风味物质解析提供了一种新思路。
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