近年来，随着人们生活水平的不断提高和物流业的高速发展，马肉也逐渐进入普通百姓的餐桌。马肉具有蛋白质含量高、脂肪含量低、胆固醇含量低等特点，含有较高的铁元素和水溶性维生素，营养极其丰富[1]。但是，由于马肉肉质较粗，口感略差，因此，为了改善马肉的加工特性和食品品质，通常会采用一些加工手段来改善其嫩度。目前，利用外源酶对肉进行嫩化的研究已经很多，而且大部分蛋白酶对肉都有较好的嫩化效果，可以显著改善肉的口感，但外源蛋白酶是否对肉的挥发性风味物质有影响的研究还不是很多。李文杰等[2]研究了酸性蛋白酶对酸肉发酵过程中菌群结构和风味品质的影响，发现酸性蛋白酶可以显著提高成熟酸肉中醇类、酸类、酯类、酮类和醛类物质的种类和含量。孔晓雪等[3]利用风味蛋白酶对腊肉进行处理后发现，添加适量的风味蛋白酶可以改善腊肉的风味，过量的蛋白酶则会降低腊肉的风味特征。杜慧颖等[4]分析了风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶酶解牡蛎肉的酶解产物的风味特征。发现酶解后醛类物质的相对含量降低。而甘春生等[5]研究了添加外源蛋白酶对金华火腿成熟指标以及香气成分的影响，发现添加外源蛋白酶对火腿的风味强度有轻微的削弱作用，但变化不大。罗珺等[6-7]分别研究了添加木瓜蛋白酶和胰蛋白酶对腊肉挥发性风味物质的影响，发现添加木瓜蛋白酶有利于腊肉中蛋白质的降解，可以促进腊肉风味的形成，但对腊肉香味的整体影响不大，添加胰蛋白酶也有利于肉中蛋白质的降解，游离氨基酸及挥发性风味物质的含量有所提高，会在一定程度上促进腊肉风味的形成。由此可见，外源蛋白酶对肉品风味的影响说法不一，有待做进一步的探索研究。
挥发性风味物质分析一般采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技术，二者互相结合可以实现复杂有机化合物的分离和定性，是分析挥发性物质的有效工具，具有操作简单、效率高、灵敏度高等特点，目前广泛应用于食品中挥发性物质的检测。因此，本试验中采用固相微萃取（solid-phase micro extraction，SPME）结合气相色谱-质谱联用法，结合相对气味活度值（relative odor activity values，ROAV）对马肉主体挥发性风味物质进行分析，研究在马肉中添加木瓜蛋白酶后对其挥发性风味物质的影响，为在马肉中合理利用外源蛋白酶提供一定的实验数据和理论依据，以期进一步提高马肉产业的健康发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
马肉（马后腿部半腱肌）：新疆昭苏县绿源食品有限责任公司；食品级木瓜蛋白酶（800 000 U/g）：南宁庞博生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
PL203电子分析天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；DZKW-S-6电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；DZ-260P台式真空包装机：上海青葩食品包装机械有限公司；GR-20真空滚揉机：诸城市美邦机械有限公司；HR2003搅拌机：珠海经济特区飞利浦家庭电器有限公司；Fiber 75 μm CAR/PDMS型萃取头、7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪：美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理
将分割好的马肉去除筋腱，分成等量多份，木瓜蛋白酶的添加量按照前期的优化实验结果（添加量15 U/g）进行添加[8]，采用注射法将木瓜蛋白酶液注入马肉中，空白组注入等量水，注射完成后置于滚揉机中滚揉30 min，然后用真空包装机真空包装并置于4 ℃冰箱，放置1 d后取出待测。
1.3.2 风味物质的测定
称取适量的待测肉样，加入6%的NaCl，混匀后置于打浆机将肉打碎，称取3 g打碎后的马肉放在15 mL顶空瓶中，快速用聚四氟乙烯隔垫封口。在60 ℃水浴中加热30 min，然后将固相微萃取头推出，顶空吸附15 min。萃取结束后将固相微萃取头插入气相色谱进样口解吸，解吸温度250 ℃，解吸时间5 min。
GC条件：TR-5MS毛细管色谱柱（30m×0.25mm，0.25μm），载气为氮气（N2），进样口温度250 ℃，流速0.9 mL/min；起始温度40℃，保持3min，以4℃/min升到120℃，最后以25℃/min升到250 ℃，保持10 min；进样方式为分流进样，分流比为5∶1。
MS条件：电离方式为电子电离（electron ionization，EI），电子能量70 eV，灯丝发射电流200 μA，离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃，扫描范围30～450 m/z。质谱谱库为美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）05和Wiley质谱库。
定性定量：经检索出来的化合物与NIST 05谱库和Wiley谱库进行匹配。采用相似度＞80（最大值为100）的鉴定结果。图谱中出现少量的硅氧烷为杂质峰，这些峰是由萃取头带来的，所以在检索样品时需要扣除这些杂质峰。各化合物峰面积由软件系统计算，采用面积归一法计算各挥发性成分在马肉风味物质中的相对含量。
参考刘登勇等[9]的方法，计算各成分的ROAV，据此确定主体挥发性成分。一般认为ROAV≥1的组分为所分析样品的关键风味化合物，而0.1≤ROAV＜1的组分对样品的总体风味具有重要的修饰作用。ROAV计算公式如下：
式中：ROAVi为组分i的相对气味活度值；Ci为组分i的相对百分含量；Ti为组分i在水中的香味阈值；Cmax与Tmax为对样品总体风味贡献最大的组分的相对百分含量和香味阈值。
1.3.3 数据处理
采用Excel和SPSS 19软件中的单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）法对数据进行处理分析，结果以“平均值±标准差”表示，每个实验独立重复3次。
2 结果与分析
2.1 木瓜蛋白酶处理后马肉的GC-MS检测结果
采用SPME结合GC-MS测定马肉中的挥发性风味物质，结果见表1。由表1可知，在空白组马肉中共检出30种风味物质，包括醇类化合物11种、醛类化合物7种、酮类化合物4种、酯类化合物3种、碳氢化合物5种。在木瓜蛋白酶处理组中共检出25种风味物质，包括醇类化合物5种、醛类化合物10种、酮类化合物2种、酯类化合物3种、碳氢化合物5种。空白组和木瓜蛋白酶处理组中相对含量最高的均是醛类化合物，分别是47.75%和68.56%，空白组醇类化合物的种类和相对含量是木瓜蛋白酶处理组的2倍多，空白组酮类化合物的相对含量是木瓜蛋白酶处理组的4倍多。酯类化合物和碳氢化合物的种类和相对含量均相当。空白组中，相对含量较高的是己醛（37.10%）、3-羟基-2-丁酮（14.83%）和己醇（14.10%），木瓜蛋白酶处理组中相对含量较高的是己醛（29.75%）和戊醛（25.56%）。
表1 木瓜蛋白酶处理马肉挥发性风味成分GC-MS分析结果
Table 1 Volatile flavor components results of horse meat treated with papain analyzed by GC-MS
注：“-”表示未检出。气味描述来自http：//www.thegoodscentscompany.com/search2.html。
由此可见，马肉经过木瓜蛋白酶处理后，挥发性风味物质的种类有所减少，醛类物质的相对含量明显变大。木瓜蛋白酶作为一种巯基蛋白酶，水解蛋白质的能力很强，它可以将肌纤维蛋白和胶原蛋白等大分子物质水解成多肽和氨基酸等物质，这些物质在加热的过程中，可能会和马肉中的化合物发生反应，促进醛类化合物的生成，进而使醛类物质的种类和相对含量明显增加。醛类物质是肉的主要风味成分，气味阈值一般较低，醛类物质含量越高，肉香味就越浓，这也说明马肉经过木瓜蛋白酶处理后，马肉风味得到提高。
2.2 关键性风味物质的分析
风味成分相对含量的高低并不能决定其对风味贡献度的大小[10]，一般情况下，挥发性风味成分对风味的贡献是由该成分的气味阈值和相对含量共同决定的，有些物质虽然相对含量很低，但气味阈值也很低，所以，可能也会对整体风味起到重要的作用。因此，为进一步确定马肉的关键风味物质，采用ROAV法对检出的各个挥发性风味物质结合其气味阈值进行更深入的分析，进而确定关键性风味物质。一般认为，ROAV≥1的组分为所测样品的主体挥发性成分，0.1≤ROAV＜1的组分对所测样品的总体风味起重要修饰作用[11]。其中，饱和烷烃类物质由于其气味阈值很高[12]，几乎不会产生明显嗅感；对于含有16个碳原子以上的醇类、醛类和酯类等物质，在正常的食品浓度范围内也几乎没有气味[11]，因此，也不对该类物质做详细分析。各组关键性风味物质及对应ROAV见表2。
表2 各组关键性风味物质及对应相对气味活度值
Table 2 Key flavor substances in each group and corresponding relative odor
由表2可知，尽管在马肉中检出多种挥发性风味成分，但其实只有一小部分风味成分对马肉的风味具有较大贡献，大部分成分都为修饰性风味成分。空白组共检出己醛、辛醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、癸醛、庚醛、戊醛、3-羟基-2-丁酮8种关键性风味成分；木瓜蛋白酶组共检出己醛、辛醛、3-甲基丁醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、庚醛、戊醛、3-羟基-2-丁酮、癸醛9种关键性风味成分；其中，己醛、辛醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、庚醛、戊醛、癸醛为共有的关键性风味物质。
2.3 讨论
肉类风味物质的前体物质一般为氨基酸、肽、核酸、糖类、脂质等，通过美拉德反应、脂质氧化、斯特勒克降解反应以及降解产物之间相互反应等产生各种呈香物质。肉的主要特征风味主要是醛类物质，比较具有代表性的醛类物质有戊醛、己醛、辛醛和壬醛等，具有脂肪香味。
在挥发性风味成分中，醇类物质一般是由脂质氧化形成的[15]，通常具有芳香、植物香和土气香。己醇及其羧酸酯具有特殊的果香味和糖果味，主要存在于柑橘类和浆果中，目前，茶叶、薰衣草叶油、香蕉、苹果、草莓、紫罗兰叶油中均含有己醇，在空白组中的相对含量很高（14.10%），但由于其味觉阈值较高，为250 μg/kg，所以它在空白组中只是起到了一定的修饰作用（ROAV为0.68）。1-辛烯-3-醇的气味阈值较低，为1 μg/kg，其是亚油酸或者其他多不饱和脂肪酸自动氧化的产物[16]，呈现蘑菇味、柑橘味、泥土味和玫瑰气味[17-18]，同时还可加强肉中的脂肪香味[11]。在两个处理组中均有检出，虽然相对含量较低，但由于其味觉阈值很低，ROAV分别为16.37和40.08，所以它对马肉风味的贡献很大。
低分子质量的醛类物质（C3～C4）一般具有强烈的刺激性气味，而相对分子质量较大的醛类化合物（C5～C9）一般具有清香、油香和酯香，分子质量更大的醛类物质则具有柑橘的香味[19-20]。醛类物质一般由不饱和脂肪酸在60 ℃氧化产生，其味觉阈值一般很低[21]，具有较强的挥发性，是一种比醇类物质更重要的化合物[22]。从表2中可以看出，己醛、辛醛、壬醛、庚醛等低碳原子直链饱和脂肪醛的ROAV均＞1，由此可看出它们在两个处理组的香气成分中起到了非常重要的作用。其中，己醛和庚醛主要由亚油酸和花生四烯酸的氧化产生[23]，而辛醛和壬醛是由油酸氧化产生[24]。由此也可推测出马肉中含有较多的油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸，因此具有较好的风味，而且营养价值很高。己醛的味觉阈值较低，为4 μg/kg，具有苹果香、果香味和脂肪味，能够赋予马肉清新的果香味[25]，从表2中可以看出，其在两组中ROAV都是最高的，因此，它对马肉的风味贡献最大。辛醛在各组的相对含量不高，但其味觉阈值仅为0.7 μg/kg，ROAV在两组中分别达到了51.81和65.26。壬醛具有玫瑰味、橘皮味和脂肪味，在各组中均有较高的相对含量，ROAV分别为25.96和50.07。癸醛的味觉阈值更低，仅为0.1 μg/kg，具有橘皮味和甜瓜味，在两组样品的ROAV分别是6.06和49.91。戊醛具有果香和面包香[26]，在两组的相对含量较高，其ROAV分别为1.82和32.22。因此，辛醛、壬醛、癸醛和戊醛对马肉的风味均有较大贡献。3-甲基丁醛具有巧克力味和坚果香味，在木瓜蛋白酶组的相对含量仅为1.23%，但由于其味觉阈值仅为0.2 μg/kg，所以其ROAV达到了93.03，因此，它对木瓜蛋白酶处理组的风味贡献很大。但在空白组中未检出该成分，原因可能是由于其相对含量过低，峰面积不明显，导致未检出该物质。苯甲醛具有轻微的苦杏仁味，在木瓜蛋白酶处理组起到了一定的修饰作用（ROAV为0.26）。通过以上分析也可看出，醛类物质对马肉风味的贡献率是最大的。
酮类挥发性风味物质一般是由脂肪氧化和美拉德反应生成的[27]。3-羟基-2-丁酮具有令人愉悦的奶香味[27]，从表2可以看出，3-羟基-2-丁酮对空白组和木瓜蛋白酶处理组的风味贡献均较大（ROAV≥1）。
此外，实验中还检出有一定量的酯类和碳氢化合物，但由于其味觉阈值较高，相对含量较低，因此，未做详细分析，此类物质可能对马肉特有风味的形成具有一定协调和平衡作用。
3 结论
本实验采用SPME结合GC-MS法，基于ROAV法对木瓜蛋白酶处理后的马肉挥发性成分进行测定。在空白组马肉中共检出30种风味物质，在木瓜蛋白酶处理组中共检出25种风味物质，己醛、辛醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、癸醛、庚醛、戊醛、3-羟基-2-丁酮为空白组马肉的关键性风味成分；己醛、辛醛、3-甲基丁醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、庚醛、戊醛、3-羟基-2-丁酮、癸醛为木瓜蛋白酶组的关键性风味成分；木瓜蛋白酶处理后马肉风味中的醇类物质种类明显减少，醛类物质种类增多。研究结果为木瓜蛋白酶在马肉中的应用及其风味制品的开发提供一定的理论依据。
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