枸杞（Lycium barbarum）是驰名中外的药食同源物品，宁夏枸杞由于其优质品质，被选入中国药典。枸杞中含有糖类、蛋白质、多糖、黄酮等多种营养及活性成分，这些成分使枸杞具有预防肿瘤、抗氧化、降血脂等养生功效[1-3]。枸杞果实可以生食，最常见的加工产品是枸杞干，也可以加工为枸杞原浆、枸杞酒、枸杞饮料、枸杞茶、枸杞软糖等[4-5]。近年来，随着人们健康意识的增强，枸杞作为养生佳品，越来越受到人们的关注。
经发酵酿造而成的果醋饮料，富含多种有机酸、多酚和花青素等营养物质及生物活性成分[6-8]，具有抗氧化、助消化、降血脂等功效[9-11]。果醋由于其优质的营养保健价值被称为第四代饮料，受到当代消费者的青睐，具有广阔的市场和发展前景[12-14]。近年来，国家对宁夏现代枸杞全产业链的升级发展给予大力支持，推动枸杞产业多样化发展，促进枸杞深加工产品的研发，以提升枸杞深加工产品的品质和附加值。枸杞果醋作为主要的枸杞发酵深加工产品，目前研究主要集中在生产工艺的优化方面。齐海丽等[15]以黑枸杞干果为原料对黑枸杞果醋的发酵工艺条件进行优化，结果表明，在生产过程中，酒精发酵最佳工艺参数为初始糖度17%、发酵温度32 ℃、酵母接种量4%，醋酸发酵最佳工艺参数为发酵温度30 ℃、酵母接种量7%，制得酸度为3.76 g/100 mL的果醋具有独特的果香和醋香。林春燕[16]以枸杞汁和山楂汁为主要原料调配枸杞山楂醋饮料，结果在枸杞汁10%～30%、山楂汁10%～15%、萝卜汁5%～10%、白砂糖2%～8%、食醋0.8%～2.0%条件下，制得一款口感丰富的枸杞山楂醋饮料。有关枸杞果醋饮料的研究报道较少，而且主要以食醋与枸杞汁的直接勾兑，缺乏枸杞在酿造过程中带来的营养物质及口感。因此，需要对枸杞发酵果醋饮料的配方进行优化，促进枸杞深加工产品的多样化。
本研究以宁夏中宁新鲜枸杞为主要原料制备枸杞汁、枸杞醋，菊花提取液可以更好地提高枸杞果醋的风味、口感及功效，并添加白砂糖及菊花提取液制备枸杞果醋饮料，通过单因素和正交试验优化枸杞果醋饮料配方，并对枸杞果醋饮料的理化及微生物指标进行分析，以期为枸杞果醋饮料的产品研发提供实验室依据，提高枸杞深加工产品的品质和附加值，推动枸杞健康产业的可持续发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜枸杞：宁夏中宁杞源堂生物科技有限公司；干菊花（金丝皇菊）：黄山北盛茶业有限公司；活性干酵母：南通银琪生物科技有限公司；柠檬酸、白砂糖（均为食品级）：济南清海化工有限公司；氢氧化钠、酚酞（均为分析纯）：上海东淼化工科技有限公司；果胶酶（酶活4 000 U/g）：上海津颂实业有限公司；巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）AC-2005：本实验室保藏并提供。
醋酸发酵培养基：酵母膏2%、葡萄糖2%、蒸馏水500mL。121 ℃灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
FA1004B电子天平：青岛聚创环保集团有限公司；HH-8电热恒温水浴锅：常州天瑞仪器有限公司；PHT-6000 pH计（精确度为0.01）：上海玄天环保科技有限公司；WYA-2S手持折光仪：池州九华光学仪器有限公司；YG-1100高压灭菌锅：诸城市跃冠机械科技有限公司；LSRH-200均质器：上海华玺科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 枸杞果醋饮料调配工艺流程及操作要点
枸杞汁、枸杞醋、白砂糖、菊花提取液→调配→过滤→灌装→灭菌→枸杞果醋饮料成品
操作要点：
枸杞汁的制备：清洗无病害、无腐烂的新鲜枸杞，加水将清洗后的枸杞以料水比1∶5（g∶mL）加去离子水机械破碎成匀浆，加入0.2%～0.5%的果胶酶，50 ℃酶解2 h，然后加热至85 ℃灭酶10 min，再加入适量柠檬酸调整pH至4.5左右，加入适量白砂糖调整糖度至150～170 g/L，搅拌均匀，得枸杞汁。
枸杞醋的制备：将干酵母按料水比1∶10（g∶mL）加水后置于37 ℃水浴锅中复水活化20 min，将活化的活性干酵母按料液比1∶50（g∶mL）（以酵母干质量计）接种到枸杞汁中，22 ℃酒精发酵5 d，糖度不再下降时终止发酵，过滤后得到枸杞果酒。取巴氏醋酸杆菌2环接入醋酸发酵培养基，装液量50 mL/250 mL，摇床转速180 r/min，30 ℃培养24 h，为醋酸菌活化液。在果酒中接入10%的醋酸菌活化液，在摇床转速为180 r/min、30 ℃条件下醋酸发酵5 d，得枸杞醋，总酸（以乙酸计）约为6.0 g/100 mL。
菊花提取液的制备：干菊花按照料液比1∶10（g∶mL）加入去离子水，90 ℃条件下提取60 min，过滤；滤渣加水，按照料液比1∶6（g∶mL）加去离子水，90 ℃条件下提取30 min，再过滤；合并提取液，62～65 ℃巴氏灭菌30 min，得到可溶性固形物含量＞2°Bx的菊花提取液。
调配：将枸杞汁、枸杞醋、白砂糖、菊花提取液按照一定比例进行混合调配，各自的添加量比由正交试验及感官评价确定。
过滤、灌装、灭菌：混合液用200目的滤布过滤；将过滤后的枸杞果醋饮料灌装后，63 ℃巴氏灭菌30 min，冷却至室温，即得枸杞果醋饮料成品。
1.3.2 枸杞果醋饮料配方优化单因素试验
选取枸杞醋、枸杞汁、白砂糖和菊花提取液为4个单因素，当枸杞醋为变量时，分别量取枸杞醋4%、6%、8%、10%、12%，然后添加枸杞汁15%、白砂糖6%、菊花提取液15%。其他3个单因素为变量时，枸杞汁添加量分别为5%、10%、15%、20%、25%，白砂糖添加量分别为2%、4%、6%、8%、10%，菊花提取液添加量分别为5%、10%、15%、20%、25%，其他不变条件为枸杞醋8%、枸杞汁15%、白砂糖6%、菊花提取液15%。然后参照农业部标准NY/T 2987—2016《绿色食品果醋饮料》，以感官评分为评价指标进行单因素试验。
1.3.3 枸杞果醋饮料配方优化正交试验
根据单因素试验结果，以枸杞醋（A）、枸杞汁（B）、白砂糖（C）、菊花提取液（D）为影响因素，以枸杞果醋饮料感官评分（Y）为评价指标，按照4因素3水平正交试验设计，确定枸杞果醋饮料的最佳配方。正交试验因素与水平见表1。
表1 枸杞果醋饮料配方优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for formulation optimization of Lycium barbarum vinegar beverage
1.3.4 分析检测
（1）理化指标的测定
pH值：参照国标GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》pH计法测定；总酸：参照国标GB/T 12456—2021《食品中总酸的测定》中的酸碱指示剂滴定法；不挥发酸：参照国标GB 10467—1989《水果和蔬菜产品中挥发性酸度的测定方法》；氨基酸态氮：参照国家标准GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》酸度计法；可溶性固形物：采用折光计法测定；总糖：采用硫酸-苯酚法[17]；脂肪：按照国标GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法；蛋白质：参照国标GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法。
（2）微生物指标的测定
细菌总数：参照国标GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》；大肠菌群：参照国家标准GB 4789.3—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》；致病菌：参照国家标准GB 29921—2013《食品中致病菌限量》。
（3）感官评价
邀请20名感官评价专业人员依次品尝各组饮品，并根据评分细则，对枸杞果醋饮料的色泽、口感、香气和组织状态进行感官评定，评分方法参照中华人民共和国农业行业标准NY/T2987—2016《绿色食品果醋饮料》中的感官指标要求，总分为100分，其中色泽占20%、口感占30%、香气占30%、组织状态占20%。枸杞果醋饮料的感官评价标准见表2。
表2 枸杞果醋饮料的感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Lycium barbarum vinegar beverage
1.3.5 数据处理与统计分析
采用GraphPad Prism 8.0.1进行数据处理和制图，SPSS 19.0软件进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 枸杞果醋饮料配方优化单因素试验
2.1.1 枸杞醋添加量对枸杞果醋饮料感官品质的影响
枸杞醋是枸杞果醋饮料中酸味的主要来源，其添加量的多少直接影响到饮料的口感及风味，适量的枸杞醋不仅可替代酸味添加剂，而且其中含有的多种有机酸、糖类，使得饮料口感更加柔和[18-19]。枸杞醋添加量对饮料感官品质的影响见图1。由图1可知，感官评分随着枸杞醋添加量在4%～12%范围内增加，呈先上升后下降的趋势。当枸杞醋添加量在4%～8%时，随着枸杞醋的添加，枸杞果醋饮料的果香和醋香越发明显，感官评分升高；枸杞醋添加量为8%时，感官评分最高，为90分；枸杞醋添加量＞8%之后，会导致饮料醋酸味较重，感官评分下降，同时，pH值降低会使蛋白质析出，增加了枸杞果醋饮料的不稳定性，出现分层及沉淀现象，影响饮料外观，因此，枸杞醋的最适添加量为8%。
图1 枸杞醋添加量对枸杞醋酸饮料感官品质的影响
Fig. 1 Effect of Lycium barbarum vinegar addition on sensory quality of Lycium barbarum vinegar beverage
2.1.2 枸杞汁添加量对枸杞果醋饮料感官品质的影响
枸杞汁能够为饮料增加独特的风味及色泽，同时枸杞汁原有的营养及活性成分融入果醋饮料中，使其兼备枸杞和果醋的保健功效[20-21]。枸杞汁添加量对枸杞果醋饮料感官品质的影响见图2。由图2可知，感官评分随着枸杞汁添加量在5%～25%范围内增加，呈先上升后下降的趋势。当枸杞汁添加量为5%～15%时，随着枸杞汁的添加，枸杞果醋饮料逐渐显出果香，甜味增加，感官评分升高；枸杞汁添加量为15%时，感官评分达到最高，为91分，色泽及口感最好；枸杞汁添加量＞15%之后，会导致枸杞风味逐渐掩盖原本的果醋风味，口感单一，感官评分下降。因此，枸杞汁的最适添加量为15%。
图2 枸杞汁添加量对枸杞果醋饮料感官品质的影响
Fig. 2 Effect of Lycium barbarum juice addition on sensory quality of Lycium barbarum vinegar beverage
2.1.3 白砂糖添加量对枸杞果醋饮料感官品质的影响
白砂糖是果醋饮料常用的甜味添加剂，其添加量的多少直接影响到果醋饮料的色泽、口感和香气，含量过高和过低都不利于饮料口感的提升[22-23]。白砂糖添加量对枸杞果醋饮料感官品质的影响见图3。由图3可知，感官评分随着白砂糖添加量在2%～10%范围内的增多，呈现先上升后下降趋势。当白砂糖添加量为2%～6%时，随着白砂糖增多，口感逐渐柔和，感官评分升高；白砂糖添加量达到6%时，枸杞果醋饮料的糖酸比适宜，感官评分达到最高，为92分；白砂糖添加量＞6%之后，会导致枸杞果醋饮料口感过于甜腻，从而掩盖枸杞果醋饮料独特的酸味，感官评分下降。因此，白砂糖的最适添加量为6%。
图3 白砂糖添加量对枸杞果醋饮料感官品质的影响
Fig. 3 Effect of sugar addition on sensory quality of Lycium barbarum vinegar beverage
2.1.4 菊花提取液添加量对枸杞果醋饮料感官品质的影响
菊花提取液可以赋予枸杞果醋饮料独特的菊花香味，且菊花中的黄酮、挥发油等生物活性成分使菊花具有清热解毒、清肝明目等功效[24-25]。因此，适量的菊花提取液不仅可以提高饮料口感，而且能够提升果醋饮料的保健价值。菊花提取液添加量对枸杞果醋饮料感官品质的影响见图4。由图4可知，枸杞果醋饮料的感官评分随着菊花提取液添加量在5%～25%范围内的增加，呈现先升高后下降的趋势。菊花的花瓣中有17种氨基酸，当菊花提取液添加量为5%～15%时，随着菊花提取液的添加，感官评分逐渐升高；菊花提取液添加量达到15%时，菊花中的苦味氨基酸与枸杞中的甜味物质相互中和，枸杞果醋饮料味道甘甜，清香可口，感官评分最高，为89分；菊花提取液添加量＞15%之后，会导致枸杞果醋饮料菊花香气过于浓郁，苦味较重，口感降低，感官评分下降。因此，菊花提取液的最适添加量为15%。
图4 菊花提取液添加量对枸杞果醋饮料感官品质的影响
Fig. 4 Effect of chrysanthemum extract addition on sensory quality of Lycium barbarum vinegar beverage
2.2 枸杞果醋饮料配方优化正交试验
以单因素试验结果为基础，分别选取枸杞果醋添加量（A）、枸杞汁添加量（B）、白砂糖添加量（C）及菊花提取液添加量（D）为影响因素，以枸杞果醋饮料感官评分（Y）为评价指标，进行L9（34）正交试验，结果与分析见表3，方差分析见表4。
表3 枸杞果醋饮料配方优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for formulation optimization of Lycium barbarum vinegar beverage
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results
由表3可知，影响枸杞果醋饮料感官评分的主次因素由大到小依次为白砂糖添加量＞枸杞醋添加量＞菊花提取液添加量＞枸杞汁添加量。果醋饮料调配的最优组合为A2B2C2D2，即枸杞果醋添加量8%，枸杞汁添加量15%，白砂糖添加量6%，菊花提取液添加量15%。在此优化条件下，进行3次平行验证试验，枸杞果醋饮料感官评分平均值为95分，口感柔和、酸甜适中、无异味，外观澄清、呈均匀宝石红色。
由表4方差分析可知，枸杞果醋、枸杞汁、白砂糖、菊花提取液添加量对枸杞果醋饮料的感官评分均有极显著影响（P＜0.01），与极差分析结果一致，结果可信。
2.3 枸杞果醋饮料品质指标检测
2.3.1 理化指标
以优化配方条件下制得的枸杞果醋饮料为研究对象，测定样品的pH值、总酸、不挥发酸、氨基酸态氮、可溶性固形物及总糖、蛋白质、脂肪的含量结果见表5。由表5可知，枸杞果醋发酵饮料的pH值为4.10，总酸、不挥发酸及氨基酸态氮含量分别为0.66 g/100 mL、0.36 g/100 mL、0.07 g/100 mL；可溶性固形物含量为10.82g/100mL，总糖含量为9.62g/100mL，蛋白质含量为0.48 g/100 mL，脂肪含量为0.06 g/100 mL。结果表明，枸杞果醋饮料的各项理化指标均符合农业部标准NY/T 2987—2016《绿色食品果醋饮料》的要求。
表5 枸杞果醋发酵饮料的理化指标测定结果
Table 5 Determination results of physicochemical indexes of Lycium barbarum vinegar beverage
2.3.2 微生物指标
经检测，此枸杞果醋饮料的细菌总数＜100 CFU/mL，大肠菌数＜3 MPN/100 mL，致病菌未检出，符合国家农业部标准NY/T 2987—2016《绿色食品果醋饮料》要求。
3 结论
采用单因素试验和正交试验优化枸杞果醋饮料的配方为枸杞醋、枸杞汁、白砂糖及菊花提取液分别添加8%、15%、6%、15%。在此最佳条件下，枸杞果醋饮料感官评分为95.47分，呈宝石红色，口感柔和，酸甜适中，具有枸杞汁及菊花的混合香味。总酸、不挥发酸及氨基酸态氮含量分别为0.66 g/100 mL、0.36 g/100 mL、0.07 g/100 mL，总糖、蛋白质、脂肪的含量分别为9.62 g/100 mL、0.48 g/100 mL、0.06 g/100 mL，其理化及微生物指标均符合国家农业部标准NY/T 2987—2016《绿色食品果醋饮料》要求。结果显示枸杞果醋饮料是一种低脂营养饮品，有益机体健康。在本研究优化的枸杞果醋配方工艺条件下，得到的枸杞果醋饮料风味营养俱佳，该研究为推动枸杞深加工产品的开发与创新具有实际参考价值。
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