黄精、枸杞一直以来搭配使用，在古方里面被称作二精丸或二精方，见于《奇效良方卷之二十一·诸虚门》[1]。黄精（Polygonatum sibiricum）为百合科黄精属，是多年草本植物[2]，具有降低血压、血糖、血脂，预防动脉粥样硬化，延缓衰老，抗炎抗菌，增强免疫力，提高学习和记忆再现能力等作用，常被用作治疗脾胃虚弱，身体乏倦，口干舌燥，食欲不振，精血不足，肺虚燥咳，内热消渴等病症[3-4]。其根茎中所含黄精多糖、甾体皂苷类、三萜皂苷类、蒽醌类化合物、黄酮类化合物、生物碱、木脂素、微量元素及挥发油等化学成分，而其中以多糖与皂苷类含量为主，是黄精主要药用活性成分[5]。枸杞（Lycium barbarum）是茄科枸杞属落叶灌木植物的干燥成熟果[6]，又名枸杞子，主要分布于中国的西北部、欧洲的东南部、地中海的半干旱和干旱地带[7]，是珍贵的传统中药材。枸杞多糖是枸杞主要活性成分[8]，对肿瘤[9]、高血脂[10]、高血糖[11]和免疫性疾病[12]、眼睛保护[13]、抗骨质疏松[14]等具有疗效。
酸奶因其口感好且营养丰富，深受大众喜爱。在牛乳发酵过程中，能使营养成分逐渐多于牛乳本身，与此同时起到平衡肠道菌群、降低血脂和胆固醇、预防心血管疾病的效果[16-18]。近年来，随着大众对食品的功能性、安全性与营养性的要求日益提高，普通酸奶的口感口味和营养价值已然满足不了消费者的需求，使得人们对保健功能性食品的需求越来越大[15]。
本研究以鲜牛奶、黄精、枸杞浸提液为原材料，研制黄精-枸杞复合酸奶，通过单因素试验及响应面试验，对黄精-枸杞复合酸奶的发酵工艺条件进行优化，并对酸奶进行感官指标、理化指标及微生物指标分析，为多种药材组合开发出具有保健功能的酸奶制品提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）菌粉、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）菌粉：丹麦科汉森（中国）有限公司；黄精：重庆市綦江区翌雪农业有限公司；枸杞：中宁枸杞京东自营旗舰店；蔗糖（分析纯）：上海市糖业烟酒集团有限公司；鲜牛奶（每100 g含蛋白质3.2 g、脂肪3.9 g、碳水化合物4.7 g）：贵州好一多乳业股份有限公司。
MRS 琼脂培养基：北京陆桥技术股份有限公司。
1.2 仪器与设备
FA224电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；JJ-2型高速组织粉碎机：金坛市天竟实验仪器厂；UV2400紫外可见光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；PHS-3C精密酸度计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PHSJ-4A型pH计：上海盛磁仪器有限公司；SDTC-72C8 型气浴恒温培养箱：成都瑞昌仪器制造有限公司；R60DA立式自动压力蒸汽灭菌器：厦门致徽仪器有限公司；Z5-LZ198榨汁机：九阳京东自营旗舰店；Scientz-150高压均质机：上海圣科仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 黄精-枸杞复合酸奶加工工艺流程及操作要点
鲜牛乳、黄精、枸杞浸提液→调配→均质→封装→杀菌→冷却→接种→发酵→冷却→后熟→黄精-枸杞复合酸奶
操作要点：
黄精干粉和枸杞干粉的制备：将黄精和枸杞置于80 ℃烘箱干燥至恒质量，用高速粉碎机粉碎，过80目筛。
黄精浸提液的制备：根据王玉茜等[16]方法稍作修改。称取干燥黄精粉20.0 g，按照料液比1∶20（g∶mL）加入蒸馏水浸泡30 min后在电磁炉上煎煮至沸腾，后改微火继续微沸30min，冷却至常温，过滤、浓缩，得到黄精浸提液（0.2 g/mL），4 ℃冷藏保存。
枸杞浸提液的制备：根据成堃等[17]方法稍作修改。称取干燥枸杞干粉20.0 g，按照料液比1∶20（g∶mL）加入蒸馏水浸泡过夜，榨汁机打浆、白纱布过滤，得到枸杞浸提液，4 ℃冷藏保存。
调配：将黄精、枸杞浸提液按一定比例混合加入鲜牛奶中，加入蔗糖等进行调配。
杀菌：将黄精、枸杞浸提液与鲜牛奶在常温、45 MPa压力下进行均质，得到混合液，封盖后放入90 ℃条件下杀菌10 min，杀菌后快速冷却至43 ℃备用[18]。
接种：在无菌的环境中，按1∶1质量比，将保加利亚乳杆菌菌粉和嗜热链球菌菌粉均匀混合，按0.3%的接种量，接入混合料中。
发酵：将接种后的混合物放到43 ℃条件下发酵至凝乳，酸度＞70°T，结束发酵。
后熟：将发酵后的酸奶于4 ℃的环境中冷藏16 h，即得黄精-枸杞复合酸奶成品。
1.3.2 黄精-枸杞复合酸奶工艺条件优化
（1）单因素试验
在发酵温度为43 ℃，黄精、枸杞提取液总添加量20%条件下[19]，分别选择黄精、枸杞浸提液体积比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、蔗糖添加量（4%、5%、6%、7%、8%）、接种量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、发酵时间（6 h、7 h、8 h、9 h、10 h）4个主要因素，以感官评价和酸度为评价指标，考察上述各因素对复合酸奶品质的影响。
（2）响应面试验
在单因素试验的基础上，考察黄精、枸杞浸提液体积比（A）、蔗糖添加量（B）、接种量（C）、发酵时间（D）4个因素对成品酸奶感官评分（Y）的影响。采用Box-Behnken试验设计，确定最优的工艺条件，Box-Behnken试验因素及水平见表1。
表1 黄精-枸杞复合酸奶发酵工艺条件优化Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for fermentation technology conditions optimization of Polygonatum sibiricum-Lycium barbarum compound yoghurt
1.3.3 感官评价
按照国标GB 19302—2010《发酵乳》[20]要求及文献[21]，分别从色泽、滋味和气味、组织状态等方面对黄精-枸杞复合酸奶进行感官评价，黄精-枸杞复合酸奶感官评分标准见表2。
表2 黄精-枸杞复合酸奶感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Polygonatum sibiricum-Lycium barbarum compound yogurt
续表
1.3.4 理化指标的测定
酸度的测定[22]：根据国标GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的测定》；脂肪的测定[23]：根据国标GB5413.3—2010《婴幼儿食品和乳品中脂肪的测定》；非脂乳固体的测定[24]：根据国标GB 5413.39—2010《乳和乳制品中非脂乳固体的测定》；蛋白质含量的测定[25]：根据国标GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》。
持水性的测定[26]：将20g黄精-枸杞复合酸奶以5000r/min离心10 min，测定沉淀物的质量并计算持水性，其计算公式如下：
式中：y为持水性，%；m为样品的质量，g；m1为沉淀物的质量，g。
1.3.5 微生物指标
乳酸菌活菌数的测定[27]：参考国标GB 4789.35—2016《乳酸菌检验》；大肠杆菌的测定[28]：参考国标GB 4789.3—2010《大肠菌群计数》；金黄色葡萄球菌的测定[29]：参考国标GB 4789.10—2016《金黄色葡萄球菌检验》中第一法；沙门氏菌的测定[30]：参考国标GB 4789.4—2016《沙门氏菌检验》。
1.3.6 数据处理
采用Origin Pro 9.0软件绘图；采用Design-Expert 10.0.3设计软件进行响应面试验数据分析；每组试验做3组平行，数据结果用“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 黄精-枸杞复合酸奶发酵工艺条件优化单因素试验
2.1.1 黄精、枸杞浸提液体积比对复合酸奶品质的影响
固定黄精、枸杞提取液添加量20%，考察黄精、枸杞浸提液体积比对复合酸奶品质的影响，结果见图1。由图1可知，随着黄精、枸杞浸提液体积比的增大，酸度随之上升，酸奶风味评分随之降低；当黄精、枸杞浸提液体积比为3∶1时，感官评分最高，为79.00分。此条件下黄精-枸杞复合酸奶组织状态色泽清亮均一，细腻润滑无浓稠感，无乳清析出；黄精、枸杞气味协调，并与酸奶味道结合良好；口感丝滑爽口，无结块，无颗粒感；黄精枸杞的味道搭配合适，酸甜度俱佳。当黄精-枸杞浸提液体积比不断上升，感官评分随之逐渐降低，原因可能是随着枸杞量的增加，枸杞味过重，酸奶颜色呈现淡红色，掩盖了酸奶特有的乳香味，口感体验不佳。由图1亦可知，当黄精、枸杞浸提液体积比在3∶1～1∶1时，酸度变化较平缓，而黄精、枸杞浸提液体积比在1∶1～1∶2时，酸度明显上升。综上，选择最适黄精、枸杞浸提液体积比为2∶1。
图1 黄精、枸杞浸提液体积比对复合酸奶感官品质和酸度的影响
Fig. 1 Effect of Polygonatum sibiricum and Lycium barbarum extraction volume ratio on sensory quality and acidity of compound yogurt
2.1.2 蔗糖添加量对复合酸奶品质的影响
考察蔗糖添加量对复合酸奶品质的影响，结果见图2。由图2可知，随着蔗糖添加量在4%～8%范围内的增大，复合酸奶的感官评分呈升高趋势。当复合酸奶的蔗糖含量为8%时，复合酸奶感官评分最高，为83.18分。此时的酸奶色泽均一光亮，无乳清析出，质地细腻不粘稠，口感细滑，甜与酸的平衡恰到好处，与黄精、枸杞的味道搭配协调。蔗糖添加过少，酸奶不够甜，口味偏淡。当蔗糖添加量在4%～6%范围内增大，复合酸奶的酸度随之增加；当蔗糖添加量为6%时，复合酸奶的酸度最高，为83.1 °T；当蔗糖添加量＞6%之后，复合酸奶的酸度随之下降。综上，选择最适蔗糖添加量为8%。
图2 蔗糖添加量对复合酸奶感官品质和酸度的影响
Fig. 2 Effect of sugar addition on sensory quality and acidity of compound yogurt
2.1.3 接种量对复合酸奶品质的影响
考察接种量对复合酸奶品质的影响，结果见图3。由图3可知，随着接种量在0.1%～0.5%范围内的增多，复合酸奶酸度呈持续上升趋势，可能是因为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合在一定范围内产生3-甲基丁酸等酸性物质，使酸奶酸度出现了明显上升[31]。但由于产酸过多，会导致滋味不协调，感官评分呈持续下降趋势。当接种量为0.1%时感官评分最高（72.18分），酸奶色泽均一，口感细腻丝滑。综上，选择最适接种量为0.1%。
图3 接种量对复合酸奶感官品质和酸度的影响
Fig. 3 Effect of inoculum on sensory quality and acidity of compound yogurt
2.1.4 发酵时间对复合酸奶品质的影响
考察发酵时间对复合酸奶品质的影响，结果见图4。由图4可知，随着发酵时间在6～10 h范围内的增加，复合酸奶酸度呈持续上升趋势，而感官评分呈先上升后下降的趋势。发酵时间为8 h时，感官评分最高，为80.4分。随着发酵时间的增加，微生物菌群拥有更为充足的时间分解蛋白质，营造更好的口感。当发酵时间＞8 h 之后，由于菌群大量繁殖，代谢产物大量积聚，使酸奶过酸、产生异味等现象导致感官评分明显下降[32]。因此发酵时间的长短与酸奶品质联系紧密。综上，选择最佳发酵时间为8 h。
图4 发酵时间对复合酸奶感官品质和酸度的影响
Fig. 4 Effect of fermentation time on sensory quality and acidity of compound yogurt
2.2 黄精-枸杞复合酸奶发酵工艺条件优化响应面试验
2.2.1 响应面试验设计及结果
基于Box-Behnken试验设计，以黄精、枸杞浸提液体积比（A）、蔗糖添加量（B）、接种量（C）、发酵时间（D）为自变量，复合酸奶感官评分（Y）为响应值，进行响应面分析试验，Box-Behnken试验设计及结果见表3。
表3 黄精-枸杞复合酸奶发酵工艺条件优化Box-Behnken试验设计与结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation technology conditions optimization of Polygonatum sibiricum and Lycium barbarum compound yoghurt
利用Design-Expert 10.0.3软件对表3数据进行多元回归拟合分析，得到模型回归方程：Y=87.262+2.673 33A+3.44667B+0.2975C+2.0775D-0.7025AB+2.105AC+1.6375AD+0.955BC+1.362 5BD-1.147 5CD-6.884 33A2-4.409 33B2-4.173 08C 2-5.565 58D2。
2.2.2 响应面试验结果方差分析
方差分析结果见表4。由表4可知，模型的P＜0.001，证明模型高度显著；失拟项P=0.567 3＞0.05，表明无失拟因素存在，可用拟合的回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析；模型的决定系数R2=0.968 3，表明响应值与各因素之间的多元回归关系显著，方程对实验拟合较好；校正决定系数R2adj=0.953 9，说明试验数据有95.39%的变异性可用该模型解释；预测相关系数R2pred=0.924 4，说明模型与真实数据之间的拟合程度较好，可用该模型对感官评分的最佳工艺进行分析和预测。由P值可知，一次项A、B、D，交互项AC，二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），交互项AD、BD对结果影响显著（P＜0.05）。由F值可知，各变量对响应值影响程度的顺序为：B＞A＞D＞C，即蔗糖添加量＞黄精、枸杞浸提液体积比＞发酵时间＞接种量。
表4 回归模型的方差分析结果
Table 4 Variance analysis results of regression model
续表
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01），“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
2.2.3 响应面因子交互作用分析
利用Design-Expert 10.0.3软件考察不同因素间交互作用对感官评分的影响，做出各因素之间交互作用的响应面及等高线见图5。
图5 各因素之间交互作用对复合酸奶感官品质影响的响应面及等高线
Fig. 5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on sensory quality of compound yogurt
由图5a可知，黄精、枸杞浸提液体积比（A）和蔗糖添加量（B）间交互作用对感官评分的影响趋势呈抛物曲面分布，感官评分随黄精、枸杞浸提液体积比和蔗糖添加量的增加均呈先增后减的变化趋势。由图5b可知，黄精、枸杞浸提液体积比（A）和接种量（C）交互曲面纵向跨度较大且等高线呈现椭圆形，表明二者的交互作用对感官评分影响极显著（P＜0.01）。由图5c可知，黄精、枸杞浸提液体积比（A）和发酵时间（D）交互作用中，感官评分随黄精-枸杞浸提液添加比例及发酵时间增加均呈现先增后减变化，二者交互作用对感官评分影响显著（P＜0.05）。由图5d可知，蔗糖添加量（B）和接种量（C）交互作用对感官评分的影响趋势呈抛物曲面分布，感官评分随蔗糖添加量和接种量的增加均呈先增后减的变化趋势。由图5e可知，蔗糖添加量（B）和发酵时间（D）的交互作用中，感官评分随蔗糖添加量和发酵时间的增加呈现先缓慢上升后缓慢下降变化趋势，二者交互作用对感官评分影响显著（P＜0.05）。由图5f可知，接种量（C）和发酵时间（D）交互作用对感官评分的影响趋势呈抛物曲面分布，感官评分随接种量和发酵时间的增加均呈先增后减的变化趋势。
2.2.4 最优工艺条件验证试验
根据Design-Expert 10.0.3软件预测，黄精-枸杞复合酸奶的最优工艺条件为：黄精、枸杞体积比2.2∶1.0、蔗糖添加量7.425%、接种量0.210%、发酵时间8.261 h。在此条件下，模型的感官评分预测值为88.573分。结合实际操作可行性，将最优工艺条件修正为：黄精、枸杞体积比2.0∶1.0、蔗糖添加量7.4%、接种量0.2%、发酵时间8.3 h。在此优化条件下进行3次平行验证试验，得平均感官评分实际值为89.33分，与模型预测结果接近，表明该模型有效可行。
2.3 黄精-枸杞复合酸奶品质指标
2.3.1 感官指标
黄精-枸杞复合酸奶的感官指标见表5。由表5可知，黄精-枸杞复合酸奶感官指标符合GB 19302—2010《发酵乳》中风味发酵乳标准。
表5 复合酸奶的感官指标
Table 5 Sensory indexes of compound yogurt
2.3.2 理化指标
由表6可知，黄精-枸杞复合酸奶酸度为82.3°T；脂肪含量为3.35 g/100 g；非脂乳固体含量为8.29 g/100 g；蛋白质含量为2.94 g/100 g；持水性为70.12%。结果表明，黄精-枸杞复合酸奶的理化指标符合GB 19302—2010《发酵乳》要求。
表6 复合酸奶的理化指标
Table 6 Physicochemical indexes of compound yogurt
2.3.3 微生物指标
由表7可知，黄精-枸杞复合酸奶的乳酸菌含量为1.184×107 CFU/mL，未检测出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌。结果表明，黄精-枸杞复合酸奶的微生物指标符合GB 19302—2010《发酵乳》中风味发酵乳标准。
表7 复合酸奶的微生物指标
Table 7 Microbiological indexes of compound yogurt
3 结论
本研究通过单因素试验和响应面试验对黄精-枸杞复合酸奶的工艺条件进行了研究，确定最优发酵工艺条件为：黄精、枸杞浸提液添加量20%（黄精、枸杞浸提液体积比2.0∶1.0），蔗糖添加量7.4%，接种量0.2%，发酵时间8.3 h。在此条件优化下，黄精-枸杞复合酸奶呈奶白色泽、均匀悦目、酸甜适宜、具有独特味道，感官评分为89.33分，脂肪含量为3.35 g/100 g，非脂乳固体含量为8.29 g/100 g，蛋白质含量为2.94 g/100 g，酸度为82.3°T；持水性为70.12%，乳酸菌活菌数为1.184×107CFU/mL。黄精-枸杞复合酸奶品质指标均符合GB 19302—2010《发酵乳》要求。
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