窖泥对浓香型白酒的风味特征和品质有非常重要的影响[1]，但是不同性状的窖泥（新窖泥、老熟窖泥、老化窖泥）的理化特性存在显著差异[2-3]，这也导致了不同性状的窖泥中微生物群落组成结构上的明显差异[4]。窖泥微生物群落的代谢作用形成了大量的风味物质，这些风味物质决定着浓香型白酒的品质[5]，因此解析不同性状窖泥的微生物群落结构并预测微生物群落的代谢功能对揭示浓香型白酒品质差异的成因具有重要的意义。
早期探索窖泥微生物的方法主要是分离培养法[6]，但由于窖泥环境的密闭性、微生物厌氧生长的特殊性以及传统培养法的技术局限性，在现有实验室条件下大量窖泥微生物难以培养或不可培养[7]。随着分子生物技术的发展，一些免培养技术逐渐应用于白酒酿造微生物的研究中[8-10]，这些技术对全面解析窖泥微生物的群落结构起到了极大的促进作用。例如，有研究运用变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术发现窖泥中的细菌主要包括厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）等[11-12]，也有研究采用高通量测序法得到了类似的结论[13-14]，并发现窖泥中古菌主要是广古菌门（Euryarchaeota）[15-16]。但是，目前运用高通量测序法对窖泥性状与微生物群落结构和代谢功能之间的关系进行全面分析的研究鲜见报道。
本研究采用基于16S rRNA的窖泥细菌群落多样性分析法解析宜宾地区新窖泥、老熟窖泥和老化窖泥的细菌组成结构差异，并通过PICRUSt菌群代谢功能预测工具推测不同性状窖泥微生物的代谢功能差异，以期确定影响该地区窖泥性状和浓香型白酒风味的关键微生物和关键功能。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
窖泥：取自宜宾地区某白酒酿造企业，窖泥的性状（新窖泥、老熟窖泥、老化窖泥）由企业专业技术人员根据其感官性质判断。取样人员佩戴口罩、无菌无酶手套，取窖底泥500 g迅速混合均匀，并保存在液氮中运至实验室-80 ℃保存。
Fast脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）SPIN Kit for soil：美国Mpbio公司；RNase-free双蒸水（分子生物级）：生工生物工程（上海）股份有限公司；MiSeq Reagent Kit v3/NovaSeq Reagent Kits：美国Illumina公司；NEXTFLEX® Rapid DNA-Seq Kit：美国Bioo Scientific公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Eppendorf N13462C移液器、Eppendorf 5430 R小型离心机、Eppendorf5424R高速台式冷冻离心机：德国Eppendorf公司；NanoDrop2000超微量分光光度计：美国Thermo Fisher Scientific公司；DYY-6C电泳仪：北京市六一仪器厂；ABI GeneAmp®9700型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国ABI公司；QuantusTM微型荧光计：美国Promega公司；Illumina Miseq测序仪：美国Illumina公司。
1.3 实验方法
1.3.1 窖泥总DNA提取与检测
采用FastDNA SPIN Kit for soil试剂盒提取三种性状窖泥样品的总DNA，每个性状的窖泥都做三个平行。提取的总DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，电压5 V/cm，电泳时间20 min；完整性检测合格的DNA用NanoDrop2000超微量分光光度计检测其纯度和浓度。
1.3.2 窖泥细菌多样性文库构建与测序
窖泥细菌多样性测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。以提取的总DNA为模板，采用上游引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和下游引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对窖泥细菌的16S V3-V4区基因序列进行PCR扩增。PCR扩增体系：5×FastPfu Buffer 4 μL；FastPfu Polymerase 0.4 μL；2.5 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）2 μL；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）缓冲液0.2 μL；上游引物338F（5 μmol/L）0.8μL；下游引物（5 μmol/L）0.8 μL；DNA模板10 ng；加双蒸水（ddH2O）至20 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次；72 ℃再延伸10 min。使用2%的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测并回收，将检测合格的样品用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒按照其说明书对回收产物进行纯化，并用QuantusTM微型荧光计进行定量检测。按照测序量要求将PCR产物用NEXTFLEX® Rapid DNA-Seq Kit进行建库，再使用Illumina公司的Miseq PE300平台上机测序。
1.3.3 测序数据处理
运用fastp[17]（https：//github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0）软件对原始序列进行质控，再使用FLASH[18]（http：//www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7）软件进行原始序列的拼接。拼接序列采用UPARSE[19]（http：//drive5.com/uparse/，version 7.1）软件按照97%[19-20]的相似度进行操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类并剔除嵌合体。最后用RDP classifier[21]（http：//rdp.cme.msu.edu/，version2.2）软件比对Silva 16S rRNA数据库（v138）进行每条序列的物种分类注释，设置比对阈值为70%。通过PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）菌群代谢功能预测工具[22]，将样品的16S rRNA基因序列通过京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）数据库进行代谢功能预测。
2 结果与分析
2.1 OTU划分与分析
经质控后的测序序列按97%的序列相似度进行归并和OTU划分，并将丰度值低于全体样本测序总量0.001%的OTU去除，对每个OTU的代表序列进行比对后获得每个OTU所对应的分类学信息。根据新窖泥、老熟窖泥、老化窖泥的OTU划分结果，计算它们之间的共有OTU数量，并绘制不同性状窖泥OTU划分Venn图，结果见图1。
图1 老熟、老化和新窖泥样品的OTU韦恩图
Fig. 1 Venn diagram of OTU of aged,degenerated and new pit mud samples
由图1可知，三种性状窖泥的细菌群落结构存在显著差异，三种窖泥的独有OTU占比分别达到：新窖泥51.26%，老化窖泥40.1%，老熟窖泥34.68%，这也是三种性状窖泥所产浓香型白酒品质差异的重要原因。其中老熟窖泥与老化窖泥之间的共有OTU数量高于它们与新窖泥的共有OTU数量，表明它们之间的相似性更高，说明了建窖以后新窖泥中的细菌菌群结构都朝着老熟方向发展，但一旦工艺不当，窖泥可能会由老熟转向老化的方向发展。
2.2 Alpha多样性分析
在Alpha多样性分析中常用ACE指数和超1（Chao1）指数来显示窖泥中细菌群落的丰富度，用辛普森（Simpson）指数和香农（Shannon）指数来体现窖泥细菌群落的多样性，三种性状窖泥细菌群落结构的Alpha多样性分析结果见表1。
表1 老熟、老化和新窖泥样品中细菌群落的α多样性分析结果
Table 1 Analysis results of α diversity of bacterial community in aged,degenerated and new pit mud samples
由表1可知，老化窖泥和老熟窖泥的ACE指数和Chao1指数基本相等，而新窖泥则相对更低，说明老熟、老化窖泥中细菌群落丰富度高于新窖泥，物种种类更多，其原因可能是在窖泥的往复使用过程中，来源于糟醅和酿酒环境中的微生物物种逐渐富集所致。从Simpson指数和Shannon指数可以看出，其变化规律为新窖泥＞老熟窖泥＞老化窖泥，表明新窖泥的细菌群落多样性更高。多样性指数综合考虑了细菌群落的丰富度和均匀度，其中Shannon指数侧重于考查稀有OTU数，而Simpson指数侧重于考查优势OTU数[23-25]。由于新窖泥的丰富度较低，但其多样性更高，说明新窖泥中稀有物种更多，且优势物种更突出；随着窖泥的往复使用，其中的稀有物种可能会逐渐被淘汰，使窖泥中细菌群落更均匀，优势物种也不再明显，导致老熟窖泥和老化窖泥的Simpson指数和Shannon指数均低于新窖泥。
2.3 细菌菌群结构分析结果
经测序序列的物种分类注释，从不同性状窖泥的细菌微生物群落中共鉴定出34个细菌门和735个细菌属。从三种窖泥中根据显著性差异分析结果选取差异大小排前20的细菌属做柱状图，结果见图2。
由图2可知，三种性状窖泥的细菌微生物组成结构在“属”水平上存在显著差异，其差异主要体现在Caproiciproducens和乳酸杆菌（Lactobacillus）的相对丰度。其中Caproiciproducens在老熟和老化窖泥中的平均相对丰度更高，分别达到了38.04%和34.78%，显著高于新窖泥（5.47%）；乳酸杆菌（Lactobacillus）的平均相对丰度变化规律则相反，其在新窖泥中的相对丰度达到28.26%，在老熟窖泥和老化窖泥则只有19.40%和3.95%。由此说明，Caproiciproducens可能是该地区窖泥成熟的标志，在窖泥的往复使用过程中，Caproiciproducens可能更适应窖泥环境，使其逐渐在老熟窖泥中富集，该菌是产生己酸的功能菌，己酸是合成浓香型白酒中关键风味物质己酸乙酯的重要底物，因此，老熟窖泥中富集Caproiciproducens对浓香型白酒的风味和品质是有利的。目前，对Caproiciproducens的研究已有一定成果，表明该菌可通过链延长反应生成乳酸、乙酸、丁酸、己酸等有机酸[24]，这些有机酸对浓香型白酒的风味都有重要影响，并且它们还是产生浓香型白酒中有机酸乙酯的重要底物，同时Caproiciproducens还具有转化乳酸生成己酸的能力[25]，以达到“增己降乳”的目的。乳酸杆菌（Lactobacillus）在新窖泥中高于老熟和老化窖泥的原因可能是在制作新窖泥时原料和环境中的乳酸杆菌（Lactobacillus）丰度较高且易于繁殖所致，在窖泥的往复使用过程中，环境条件对乳酸杆菌（Lactobacillus）可能有抑制作用，且Caproiciproducens等其他微生物逐渐富集，引起乳酸杆菌（Lactobacillus）在窖泥成熟过程逐渐极少。这一变化规律与其他地区、其他酒厂已有的研究报告是一致的[26]。
图2 基于属水平老熟、老化和新窖泥样品中细菌群落组成差异分析结果
Fig. 2 Analysis results of bacterial community composition difference between aged,degenerated and new pit mud samples based on genus level
为进一步探讨不同性状窖泥在细菌分类学组成上的差异，对三种窖泥中相对丰度总量排名前50位的细菌属进行了聚类分析，结果见图3。
由图3可知，新窖泥的细菌群落结构与老熟和老化窖泥截然相反，这充分说明在窖泥的长期使用过程中菌群发生了显著变化，其原因可能是在周期性的往复发酵过程中糟醅、黄水等物质持续地影响窖泥理化条件，并反复地提供糖类、氨基酸等有机质以及来自大曲、酿造环境等介质中的细菌，使窖泥的细菌群落结构逐渐改变。老熟窖泥与老化窖泥之间的细菌群落结构也存在较大差异，这说明窖泥的退化过程也会导致细菌群落结构的逐渐变化。
图3 基于属水平老熟、老化和新窖泥样品中细菌群落聚类分析结果
Fig. 3 Results of cluster analysis of bacterial community in aged,degenerated and new pit mud samples based on genus level
图中的方块颜色越红表示该菌属的相对丰度越高，颜色越绿表示该菌属的相对丰度越低。
2.4 窖泥细菌群落代谢功能预测分析结果
通过PICRUSt工具将老熟、老化、新窖泥的16S rRNA基因序列在KEGG数据库中进行菌群代谢功能预测。结果发现，在KEGG数据库6大类代谢通路（代谢（Metabolism）、遗传信息处理（Genetic Information Processing）、环境信息处理（EnvironmentalInformation Processing）、细胞过程（Cellular Processes）、生物系统（Organismal Systems）、人类疾病（Human Diseases））中，窖泥细菌群落在代谢（Metabolism）功能的相对丰度最高。为进一步分析窖泥细菌群落在代谢（Metabolism）大类上具体功能和不同性状窖泥之间的差异，进行代谢（Metabolism）大类第二级预测，结果见图4。
图4 PICRUSt预测的窖泥样品中细菌群落代谢功能第二级分布结果
Fig. 4 Second-order distribution of metabolic function of bacterial community in pit mud samples predicted by PICRUSt
由图4可知，窖泥中细菌群落在碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism）和氨基酸代谢（amino acid metabolism）方面的能力最强，其原因可能是浓香型白酒酿造过程中糟醅和黄水持续不断地为窖泥提供大量糖类、氨基酸类物质，窖泥中的细菌以此为底物可代谢产生醇、醛、酸、酯类风味物质，因此这两类代谢作用最强。从碳水化合物代谢能力的强弱排序来看，老熟窖泥＞老化窖泥＞新窖泥，而三类窖泥在氨基酸代谢能力方面的差异则不大，说明不同性质的窖泥中以糖类为底物代谢产生风味物质的差异可能会更大，因此在窖泥的质量改善或窖泥微生物强化时需要更多地关注碳水化合物代谢相关菌群。
通过KEGG直系同源基因簇（KEGG orthologous groups，KO）注释可以获得更详细的代谢功能信息，KO是KEGG数据中最小的分类，它对应代谢通路上各个具体的代谢反应。对老熟、老化和新窖泥中相对丰度总量排名前50的KO进行聚类分析并绘制相对丰度热图，结果见图5。由图5可知，老熟窖泥、老化窖泥、新窖泥的三个平行样本各自聚为一类，这同样证明了三种性状窖泥在代谢功能上存在显著差异。由图5亦可知，三种窖泥中相对丰度排名前50的KO呈现相似的变化规律，其相对丰度都表现为老熟窖泥＞老化窖泥＞新窖泥，这再次证实了老熟窖泥的代谢能力最强，其次是老化窖泥，新窖泥则最弱。注释到排名前50的KO多数是氨基酸代谢相关的酶（如K02035、K02030等）和糖代谢相关的酶（如K07024、K01834等），这也再次证实了窖泥细菌主要代谢碳水化合物和氨基酸的特征，而这两类代谢是浓香型白酒风味物质的主要来源，因此推测老熟窖泥的细菌群落结构对浓香型白酒风味物质的形成是最有利的。
图5 PICRUSt预测的窖泥细菌群落KEGG直系同源基因簇丰度热图
Fig. 5 Heat map of abundance of KEGG lineal homologous gene cluster of bacterial community in pit mud samples predicted by PICRUSt
图中的方块颜色越红表示该KO的相对丰度越高，颜色越绿表示该KO的相对丰度越低。
3 结论
从宜宾地区新窖泥、老熟窖泥和老化窖泥的细菌群落结构来看，三类窖泥存在显著差异，这可能是三类窖泥所产浓香型白酒品质和风味存在显著差异的重要原因。其中，老熟窖泥和老化窖泥的细菌群落结构更接近，它们的细菌群落丰富度高于新窖泥，新窖泥则表现为稀有物种更多，优势物种更突出。根据物种分类注释，Caproiciproducens的丰度变化规律为老熟窖泥＞老化窖泥＞新窖泥，说明Caproiciproducens可能是该地区窖泥老熟的标志，该菌对浓香型白酒的风味物质形成具有重要的作用。乳酸杆菌属（Lactobacillus）在新窖泥中高于老熟和老化窖泥，这可能是该地区新窖泥的标志。通过三种性状窖泥细菌群落的代谢功能预测，发现窖泥的代谢功能最强，其中碳水化合物代谢和氨基酸代谢的相对丰度最大，且同样呈现出老熟窖泥＞老化窖泥＞新窖泥的丰度变化规律，这两类代谢是浓香型白酒风味物质的主要来源，说明老熟窖泥的细菌群落结构对浓香型白酒风味物质的形成是最有利的。
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