大麦（Hordeum vulgare L.）属于禾本科植物，是世界第四大谷类作物，其在农业和食品工业中占有重要的地位，是人类最早驯化的古老培育作物之一[1]。大麦营养成分丰富，除含有碳水化合物、蛋白质、膳食纤维外，还含有维生素、核黄素和胚芽维生素B，具有助消化、催乳、抗结肠炎、降血糖血脂等药理性作用[2-5]。大麦经过制麦后得到麦芽，麦芽作为啤酒工艺的主要原料，其品种属性对啤酒品质影响较大。
酚类化合物是植物体内重要的次生代谢物质，约占大麦干物质的0.1%～0.3%，主要存在于麦皮、糊粉层和胚乳中，其在植物体的生长发育、抗病和抗胁迫等方面起到重要的调节作用[6]。有研究表明，大麦中酚类物质含量与品种有关，也受生长条件的影响[7]。大麦酚类物质含量虽少，却对啤酒的色泽、泡沫、风味和非生物稳定性影响很大[8]。啤酒中约有70%～80%的多酚物质来自麦芽[9]，其内源性抗氧化力对啤酒的非生物稳定性起着重要作用，有研究认为酚类物质在啤酒加工过程中会对美拉德反应、脂质氧化反应或葡萄糖氧化反应所产生的自由基有抑制作用[10]，也有研究认为，啤酒的风味稳定性与多酚物质的抗氧化活性有关联，因此，酒体中存在适量的多酚能够提高酒体的风味稳定性[11-13]。
指纹图谱技术是一种综合的、可量化的鉴定手段，广泛应用于中药领域。它是建立在物质化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材、中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性以及食品评价、种子检测和鉴定，也常用于分析酒中挥发性成分特征，尤其在中药材品质控制及质量特征鉴定方面表现出了稳定性好、特征性强的优势而被广泛应用[14-17]。不同品种的大麦和酒花原料中的酚类化合物对啤酒的质量影响较大，与啤酒产品品质特点具有较强的相关性[18-19]，因此，人们对啤酒大麦中酚类化合物的关注度越来越高。而由于大麦麦芽多酚类物质与中药中的黄酮类物质在结构上具有一定的相似性，并对大麦、麦芽及啤酒品质的相关性较强[11，20-21]，本研究采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法研究不同品种啤酒大麦及麦芽样品中多酚类物质的组成，基于此，构建HPLC指纹图谱，并通过指纹图谱相似度分析、共有峰聚类分析（clustering analysis，CA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）研究各品种大麦、麦芽之间的品质差异，以期为大麦、麦芽及啤酒品质控制、生产过程质量监控提供新的思路和方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
10个进口和8个国产啤酒大麦品种及其相对应的麦芽样品信息详情见表1。
表1 大麦及麦芽样品信息
Table 1 Information of barley and malt samples
1.1.2 试剂
甲醇、乙腈（均为色谱纯）、无水乙醚、11%甲醇硫酸溶液、福林酚、无水碳酸钠（均为分析纯）：北京化工厂；没食子酸、儿茶素、香草酸、安息香酸、丁香酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、香豆素、槲皮素、山奈酚、芦丁、表儿茶素标准品（纯度均≥99%）：上海源叶生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
DLFU-W23050盘式粉碎机：德国Buhler universal公司；1260VWD高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；LR10高速冷冻离心机：北京雷勃尔医疗器械有限公司；KQ-100DE数控超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；UV1780紫外分光光度计：日本岛津公司；HH电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；HY-5型回旋式振荡器：常州荣华仪器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 混合标准品溶液的制备
精确称取没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、安息香酸、香草酸、咖啡酸、表儿茶素、丁香酸、阿魏酸、芥子酸、香豆素、槲皮素、山奈酚、芦丁各20 mg，用甲醇溶解并定容至200 mL；取1 mL混合标准品溶液，用甲醇定容至25 mL作为混合标准品溶液，贮存于-4 ℃冰箱内，待用。
1.3.2 多酚类物质的提取
将干燥的大麦及麦芽样品机械粉碎，过60目筛，参考ZHAO H F等[22-23]的方法提取多酚类物质。
1.3.3 多酚类物质的检测
参照文献[23]中的HPLC法测定混合标准品溶液和大麦、麦芽样品中的多酚类物质种类及含量。
HPLC条件：C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相A：5%甲醇+0.1%甲酸水溶液，流动相B：5%乙腈+0.1%甲酸甲醇溶液；流速1 mL/min；进样量10 μL；柱温30 ℃；检测波长280 nm。梯度洗脱程序：0～15 min，74%A；15～30 min，60%A；30～50 min，35%A；50～60 min，20%A；60～66 min，100%A[22]。
定性、定量：根据保留时间定性，采用外标法进行定量。
1.3.4 共有峰的确认
将18个不同品种的大麦、麦芽的HPLC色谱图分别导入到2012版中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件中，设置某一样品图谱为参照图谱（S1），确定样品中共有的成分为共有峰，根据各个成分相对保留时间的一致性进行峰匹配，以多点校正消除各图谱的时间误差，自动匹配后得到共有峰，并以中位数法生成对照指纹图谱（R）。
1.3.5 相似度评价[24-25]
将所得的18个不同品种的大麦、麦芽样品的多酚色谱图谱分成大麦和麦芽两组，分别导入国家药典委员会2012版中药指纹图谱相似度评价系统软件，得到18个大麦样品的色谱叠加图和18个麦芽样品的色谱叠加图，并计算大麦、麦芽共有峰的相似度，以判断大麦、麦芽质量的稳定性和差异性。
1.3.6 数据处理
基于18个大麦、麦芽品种样品所有共有峰的样本数据，运用SPSS23.0统计软件进行主成分降维，得到相关矩阵的方差贡献率以及主成分的得分；再进行系统聚类，以得到其树状图。运用Origin12.0对主成分得分作三维散点图，来区分样品间的差异性；用2012版中药指纹图谱相似度评价系统软件计算样品间的相似性。
2 结果与分析
2.1 大麦及麦芽多酚类化合物含量
大麦及麦芽中多酚类化合物含量的测定结果分别见表2和表3。由表2和表3可知，混合标准品中的14种化合物在大麦、麦芽中均有检出，只是品种间含量和种类会有差异。在大麦样品中多酚类物质的含量在0～149.14 mg/kg之间，进口大麦的多酚类物质含量在0～149.14 mg/kg之间，国产大麦的多酚类物质含量在0～18.16 mg/kg之间，进口大麦的多酚类物质显著高于国产大麦，在18个大麦品种中，没食子酸、香草酸、安息香酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素、山奈酚、芦丁的含量相对较高。
表2 不同品种大麦多酚类物质含量测定结果
Table 2 Determination results of polyphenols contents of different varieties of barley mg/kg
注：“ND”表示未检出。同列肩小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
表3 不同品种麦芽多酚类物质含量测定结果
Table 3 Determination results of polyphenols contents of different varieties of malt mg/kg
大麦在发芽后多酚类物质的含量和种类显著增加，麦芽中多酚类物质的含量在0～570.45 mg/kg之间，其中进口麦芽的多酚类物质含量在0～570.45 mg/kg之间，国产麦芽的多酚类物质含量在0～153.62 mg/kg之间，进口麦芽的多酚类物质含量普遍高于国产麦芽。大麦发芽后一些品种增加了芥子酸、香豆素、表儿茶素。在18个不同品种的麦芽中，香草酸、安息香酸、丁香酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素、山奈酚、芦丁含量相对较高，且表儿茶素几乎只存在于国产大麦麦芽中。
2.2 指纹图谱的建立
2.2.1 大麦及麦芽样品多酚类物质指纹图谱的建立
混合标准品溶液的高效液相色谱图见图1，采用中位数法对各色谱峰进行多点校正并自动匹配生成对照指纹图谱（R）以及18种大麦、麦芽的HPLC叠加指纹图谱，结果见图2。
图1 混合标准品溶液的高效液相色谱图
Fig.1 High performance liquid chromatography of mixed standard solution
注：1-14分别代表没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、安息香酸、香草酸、咖啡酸、表儿茶素、丁香酸、阿魏酸、芥子酸、香豆素、芦丁、槲皮素、山奈酚。
图2 18种大麦（a）及麦芽（b）样品的HPLC叠加指纹图谱
Fig.2 HPLC overlay fingerprints of 18 kinds of barley (a) and malt (b) samples
2.2.2 大麦及麦芽样品多酚类物质指纹图谱共有峰的确认
（1）大麦样品多酚类物质指纹图谱共有峰的确认
从18种大麦样品中共检测出14种多酚类物质，对18种大麦样品的多酚类物质指纹图谱进行数据匹配，确认出9个共有峰，通过与混合标准品色谱图比对确定9个共有峰分别为没食子酸、香草酸、安息香酸、原儿茶酸、咖啡酸、槲皮素、山奈酚、芦丁、芥子酸。
（2）麦芽样品多酚类物质指纹图谱共有峰的确认
从18种麦芽样品中共检测出14种多酚类物质，对18种麦芽样品的多酚类物质指纹图谱进行数据匹配，确认出9个共有峰，通过与混合标准品色谱图比对确定9个共有峰分别为香草酸、安息香酸、丁香酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素、山奈酚、芦丁。
2.2.3 大麦及麦芽样品多酚类物质的相似度评价
对18种大麦样品多酚类物质图谱的9个共有峰与对照图谱（R）进行相似度计算，结果见表4。由表4可知，18种大麦样品共有的多酚类化合物图谱与对照图谱（R）的相似度在0.911～0.989之间，其中进口大麦B1、B2、B5、B7图谱与对照图谱（R）的相似度在0.938～0.946之间，其余进口大麦图谱与对照图谱（R）的的相似度＞0.96，而国产大麦的图谱与对照图谱（R）的相似度在0.911～0.937之间，普遍＜0.94，相似度均低于进口大麦。对18种麦芽样品多酚类物质图谱的9个共有峰与对照图谱（R）进行相似度计算，结果见表5。由表5可知，18种麦芽样品共有多酚类物质图谱与对照图谱（R）的相似度在0.892～0.981之间，其中进口麦芽图谱与对照图谱（R）的相似度在0.892～0.967之间，进口麦芽样品M1、M10图谱与对照图谱（R）的相似度＞0.96，国产麦芽图谱与对照图谱（R）的相似度普遍＞0.95，说明国产麦芽之间的相似性较高，且进口麦芽M1、M10与国产麦芽相似度较为接近。
表4 18种大麦样品的HPLC指纹图谱相似度计算结果
Table 4 Similarity calculation results of HPLC fingerprint of 18 barley samples
表5 18种麦芽样品的HPLC指纹图谱相似度计算结果
Table 5 Similarity calculation results of HPLC fingerprint of 18 malt samples
2.3 大麦及麦芽样品多酚类物质的聚类分析[26]
为了区别不同品种大麦或麦芽的差异，将18种大麦和18种麦芽样品中的14种多酚类物质的峰面积导入SPSS 23.0软件，采用组间连接法以欧氏平方距离为测度进行聚类分析，结果见图3。
图3 18种大麦（a）和麦芽（b）样品中多酚类物质的聚类分析结果
Fig.3 Cluster analysis results of polyphenols in 18 kinds of barley (a)and malt (b) samples
由图3a可知，当判别距离＜5时，18个大麦样品中，国产大麦样品（B11～B18）全部聚为一类，个别进口大麦样品（B2）与国产大麦样品也聚为一类，而其他的进口大麦品种B1和B10聚为一类，B3和B4聚为一类，B5～B9聚为一类，因此，通过聚类分析能将国产大麦与进口大麦进行有效区分。由图3b可知，当判别距离＜5时，18个麦芽样品中，国产大麦麦芽样品（M11～M18）聚为一类，但有3个进口大麦麦芽样品（M2～M4）与国产大麦麦芽样品聚为一类，而其他进口大麦麦芽样品则单独聚类，即M1和M10聚为一类，M5和M7聚为一类，M8、M6、M9均单独分离出来，因此，通过聚类分析方法能将部分国产大麦麦芽与进口大麦麦芽样品进行基本区分。
2.4 大麦及麦芽样品多酚类物质的主成分分析[27]
2.4.1 大麦样品多酚类物质主成分分析
对18种大麦样品中的14种多酚类物质的峰面积进行主成分分析，结果见表6。
由表6可知，前3个因子的特征根＞1，其累计方差贡献率达到81.689%，故选取这3个因子分别作为主成分1、2、3。各个原始变量在主成分上的载荷矩阵见表7。
表6 大麦样品中多酚类物质主成分分析结果
Table 6 Principal component analysis results of polyphenols in barley samples
由表7可知，主成分1主要体现了没食子酸、儿茶素、阿魏酸、芥子酸、香豆素、槲皮素和芦丁等特性指标，其中没食子酸、阿魏酸、香豆素和芦丁对主成分1起到了较高的正载荷，说明主成分1受这几种成分影响较大。主成分2主要体现了香草酸、原儿茶酸、咖啡酸等指标，且这几种化学物质均对主成分2有较高的正载荷，其中香草酸的载荷值最高，证明主成分2受香草酸的影响较为明显。主成分3主要体现了安息香酸和丁香酸的特性指标，且都对主成分3起到了较高的正载荷。不同大麦样品的各主成分得分值，结果见表8，大麦多酚类物质主成分得分图见图4。
图4 大麦样品中多酚类物质主成分得分图
Fig.4 Principal component scores plot of polyphenols in barley samples
表7 大麦样品多酚类物质主成分载荷矩阵
Table 7 Principal component load matrix of polyphenols in barley samples
表8 大麦样品中多酚类物质各主成分的得分
Table 8 Principal components scores of polyphenols in barley samples
续表
由图4可知，大麦样品B1和B10较为接近，大麦样品B3和B4较为接近，大麦样品B5～B9分布距离较近，大麦样品B2和B11～B18分布较为紧密，这与聚类分析的结果一致。
2.4.2 麦芽样品多酚类物质主成分分析
对18种麦芽样品中的14种多酚类物质的峰面积进行主成分分析，结果见表9。
表9 麦芽样品中多酚类物质主成分分析结果
Table 9 Principal component analysis results of polyphenols in malt samples
由表9可知，前3个因子的特征根＞1，其累计方差贡献率达到79.431%，故选取这3个因子分别作为主成分1、2、3。各个原始变量在主成分上的载荷矩阵见表10。
表10 麦芽样品中多酚类物质主成分载荷矩阵
Table 10 Principal component load matrix of polyphenols in malt samples
由表10可知，主成分1没食子酸、阿魏酸、香豆素、芦丁的载荷值较高，说明主成分1受这几种成分影响较大。主成分2香草酸、原儿茶酸、咖啡酸有较高的正载荷。主成分3主要体现了安息香酸、丁香酸的特性指标贡献率。不同大麦麦芽样品的各主成分得分值见表11，得分图见图5。
图5 麦芽样品中多酚类物质主成分得分图
Fig.5 Main principal component scores plot of polyphenols in malt samples
表11 麦芽样品中多酚类物质各主成分的得分
Table 11 Each main component scores of polyphenols in malt samples
由图5可知，麦芽样品M5与M7分布较为接近，麦芽样品M1与M10分布较为接近，麦芽样品M6、M8与M9分布距离较远，麦芽样品M2～M4与M11～M18分布较为密集，这与聚类分析的结果一致。
3 结论
本研究采用高效液相色谱法对国内外18个啤酒大麦及相对应的麦芽样品中的多酚类化合物进行检测，构建指纹图谱，相似度分析结果表明，进口大麦样品的相似度（0.938～0.989）高于国产大麦样品（0.911～0.937），而进口大麦麦芽的相似度（0.892～0.981）普遍低于国产大麦麦芽的相似度（0.956～0.967）；CA（判别距离＜5）结果和PCA结果一致，8个国产大麦和1个进口大麦样品B2聚为一类，8个国产麦芽和3个进口麦芽样品M2、M3、M4聚为一类，说明通过大麦、麦芽多酚类物质的HPLC指纹图谱技术能基本区分国产和进口大麦品质的差异。
[1]CHEN Y S,HUANG J Q,HU J,et al.Comparative study on the phytochemical profiles and cellular antioxidant activity of phenolics extracted from barley malts processed under different roasting temperatures[J].Food Funct,2019,116(4):26-35.
[2]MIKYŠKA A,DUŠEK M,CˇEJKA P.Influence of barley variety and growing locality on the profile of flavonoid polyphenols in malt[J].Kvasny Prumysl,2019,65(5):3-16.
[3]RICE-EVANS C A,MILLER N J,PAGAVGA G.Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids[J]. Free Radical Bio Med,1996,20(7):933-956.
[4]VAHER M,MATSO K,LEVANDI T,et al.Phenolic compounds and the antioxidant activity of the bran,flour and whole grain of different wheat varieties[J].Procedia Chem,2010,2(1):76-82.
[5]HAN Z G,ZHANG J J,CAI S G,et al.Association mapping for total polyphenol content,total flavonoid content and antioxidant activity in barley[J].BMC Genomics,2018,19(1):81.
[6]GANGOPADHYAY N,HARRISON S M,BRUNTON N P,et al.Bransof the roller-milled barley fractions rich in polyphenols and health-promoting lipophilic molecules[J].J Cereal Sci,2018,83:213-221.
[7]李苇舟，李福香，何晓琴，等.酿造啤酒大麦发芽前后多酚组分变化及抗氧化活性[J].食品科学，2019，40（18）：15-21.
[8]管敦仪.啤酒工业手册[M].修订版.北京：中国轻工业出版社，1998：19-20.
[9]韩龙.啤酒多酚的作用分析与控制[J].中外酒业·啤酒科技，2018（17）：52-54.
[10]蒋晓宇，贺婷，陈媛媛，等.多酚对啤酒非生物稳定性及有害物质的影响[J].食品工业，2019，40（2）：233-237.
[11]马德秀.香梨果酒发酵及白兰地蒸馏陈酿技术的研究[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2021.
[12]WU G,FAN G J,ZHOU J Z,et al.Structure and main polyphenols in the haze of blackberry wine[J].LWT-Food Sci Technol,2021,149(1):111821.
[13]刘素香，白雪，刘毅，等.马鞭草HPLC指纹图谱建立及指标性成分的测定[J].中草药，2016，47（12）：2069-2073.
[14]YANG T,DUAN C L,ZENG Y W,et al.High performance liquid chromatography fingerprinting of flavonoids between parents and generations in barley grain[J].J Biobased Mater Bio,2017,11(1):40-44.
[15]孙国祥，智雪枝，张春玲，等.中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统[J].中南药学，2007，5（6）：549-555.
[16]JIANG F Q,TAO Y D,YUN S.Fingerprinting quality control of Qianghuo by high-performance liquid chromatography-photodiode array detection[J].J Ethnopharmacol,2007,111(2):265-270.
[17]孙世琨.啤酒花中黄酮类物质的提取及纯化工艺探究[D].兰州：兰州大学，2017.
[18]关雪芹.酒花香味物质在啤酒酿造和储存过程中风味演变的研究[D].济南：齐鲁工业大学，2019.
[19]LEITAO C,MARCHHIONI E,BERGAENTZLÉ M,et al.Fate of polyphenols and antioxidant activity of barley throughout malting and brewing[J]. J Cereal Sci,2012,55(3):318-322.
[20]林琳.多酚物质对啤酒非生物稳定性影响的研究[D].青岛：青岛科技大学，2010.
[21]杜丽娟，薛洁，王异静.反相高效液相色谱法测定猕猴桃酒中的多酚物质[J].酿酒，2008，35（1）：72-74.
[22]ZHAO H F,DONG J J,LU J,et al.Effects of extraction solvent mixtures on antioxidant activity evaluation and their extraction capacity and selectivity for free phenolic compounds in barley(Hordeum vulgare L.)[J].J Agr Food Chem,2006,54(19):7277-7286.
[23]苏东晓.荔枝果肉多酚的分离鉴定及其调节脂质代谢作用机制[D].武汉：华中农业大学，2014.
[24]孙国祥，闫波，侯志飞，等.中药色谱指纹图谱评价方法研究进展[J].中南药学，2015，13（7）：673-681.
[25]李昕，王月茹，马利，等.中药色谱指纹图谱在中药质量评价中的应用[J].生物医学工程学杂志，2012，29（1）：192-196.
[26]李德新.聚类分析模型算法研究及其有效性评价[J].电脑知识与技术：学术版，2021，17（30）：26-27.
[27]明红梅，董瑞丽，许德富，等.主成分分析法在大曲质量评价体系中的应用[J].中国酿造，2010，29（8）：120-123.