氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是一种在葡萄酒酿造过程中微生物的代谢副产物，也是酒精发酵饮料中比较常见的有毒污染物，可造成肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等疾病[1]。2007年世界卫生组织国际癌症机构将氨基甲酸乙酯归为2A类致癌物质[2-4]。1985年，加拿大首次规定了葡萄酒、白兰地和威士忌中的EC的限量值[5]。EC在葡萄酒基质中以痕量的形式存在，葡萄酒化学组分复杂，EC检测干扰较大，开发葡萄酒中氨基甲酸乙酯高灵活度检测方法势在必行。
在此之前，气相色谱法（gas chromatography，GC）[6-9]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[10-14]、气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[15-19]以及高效液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[20-21]等是测定EC的主要方法。早在2002年就有研究HPLC方法检测氨基甲酸乙酯的报道，通过柱前衍生化和荧光检测进行了葡萄酒中EC的检测[22]，其中高效液相色谱-荧光法（high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD）具有灵敏度高、重复性好、应用范围广泛，而且解决了葡萄酒样品处理过程中效率低和复杂的弊端。
薛锡佳等[23]对比了液相色谱串联质谱法与固相萃取法检测白酒中的EC含量的差异，研究表明液相色谱串联质谱法具有样品前处理简单，操作成本低等特点，但重现性低于高效液相色谱法。项东方[24]探讨了酒中氨基甲酸乙酯的检测方法，气相色谱-质谱法虽能避免物质干扰，但存在处理时间长的缺点。陈达玮等[25]采用HPLC对葡萄酒中EC含量进行了研究，结果表明，采用高效液相色谱-荧光法（HPLC-FLD）测定酒中EC时，具有简便快速，成本较低等特点，比较适合在企业中推广使用。该研究根据葡萄酒中EC浓度含量不尽相同的特点，拟结合固相萃取后衍生化反应，采用高效液相色谱-荧光法（HPLC-FLD）测定葡萄酒中EC的含量，通过对葡萄酒进行固相萃取前处理，达到减少不必要的干扰、降低污染色谱系统的概率和提高灵敏度检测的目的。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
赤霞珠葡萄酒；新疆张裕巴堡男酒庄；甲醇（纯度≥99.9%）、乙腈（纯度≥99.9%）（色谱纯）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；氨基甲酸乙酯（纯度99%）、9-羟基吨（纯度97%）、乙酸钠、甲苯、乙酸乙酯（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；正己烷、乙醚（均为分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；试验使用水为超纯水。
1.2 仪器与设备
Agilent 1100系列高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；NDK200-1氮吹仪：杭州米欧仪器有限公司；KQ-100DE型数控超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；SOP电子天平（精确到0.000 1 g）：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 试剂的配制
衍生试剂储备液：准确称取9-羟基吨0.198 0 g于50 mL容量瓶中，甲醇溶解至刻度，配制成0.02 mol/L的储备液，放进冰箱-4 ℃下进行保存。
EC标准储备液：准确称取EC 0.1 mg于100 mL容量瓶，甲醇进行溶解至刻度，配制成1 mg/L的标准储备液，放进冰箱-20 ℃进行保存。
1.3.2 试样净化浓缩[26]
准确量取葡萄酒样品2 mL，加到萃取柱上，静置并吸附10 min，用正己烷（10 mL）进行淋洗，并挤干小柱。然后用10 mL乙酸乙酯∶乙醚（5∶95，V/V）洗脱，汇集洗脱液到10 mL的具塞刻度试管中，在室温下用氮吹仪将洗脱液进行浓缩，最后用甲醇定容至1 mL，经过0.45 μm的微孔滤膜进行过滤，得到的滤液可直接进液相色谱仪进行测定。
1.3.3 液相色谱的检测条件
样品衍生：准确吸取100 μL 9-羟基吨衍生储备试剂于棕色进样瓶中（1.5 mL），吸取500 μL经过浓缩后的滤液，然后吸取50 μL的盐酸溶液（1.5 mol/L），振荡均匀后，放置暗处反应5 min，然后进样分析。
样品检测：液相色谱检测条件的设置参考陈达炜等[27]的方法。C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：乙酸钠溶液（0.02 mol/L，pH 7.2）；流动相B：色谱级乙腈；检测器为荧光检测器，其中入射光波长设置为233 nm，发射光波长设置为600 nm，进样量设置为20 μL，柱温为30 ℃。氨基甲酸乙酯分析梯度洗脱条件见表1。
表1 氨基甲酸乙酯分析洗脱程序
Table 1 Elution procedure of ethyl carbamate analysis
1.3.4 样品前处理条件和检测反应时间的优化[28]
采用固相萃取葡萄酒中的EC时，影响EC提取的因素主要包括：吸附时间、淋洗溶剂的种类以及洗脱溶剂的种类和比例。本试验通过向葡萄酒样品中添加EC（100 μg/L），根据回收率来确定样品的最佳前处理条件。
（1）吸附时间的优化
通过向固相萃取柱上样后，设置静置吸附时间为4 min、6 min、8 min、10 min、12 min时，通过回收率平均值以及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分析，确定最佳吸附时间。
（2）淋洗溶剂的选择
在葡萄酒样品经过吸附后，采用溶剂极性较弱的试剂进行淋洗，有效去除葡萄酒中的杂质如颜色、糖分等，而待分析物质EC在固相萃取柱上仍然保留。在此次实验中使用弱极性试剂正己烷、乙酸乙酯及甲苯，通过比较回收率平均值和RSD确定最合适的淋洗溶剂。
（3）洗脱溶剂的优化
根据EC的特性，选取乙酸乙酯、乙醚、乙酸乙酯∶乙醚（5∶95，V/V）3种溶剂作为洗脱溶剂，研究洗脱溶剂种类对洗脱效果的影响，通过比较回收率平均值和RSD确定最合适的洗脱溶剂。
（4）洗脱溶剂比例的优化
在确定固相萃取洗脱步骤中的最佳洗脱溶剂后，进而优化洗脱溶剂的比例，本试验选定的乙酸乙酯与乙醚的比例分别为5∶95、10∶90、20∶80、30∶70（V/V），通过比较回收率平均值和RSD，得到最优洗脱溶剂比例。
（5）反应时间的优化
葡萄酒样品进行检测时，将荧光反应时间设置为不同的时间范围，分别为5 min、15 min、30 min、45 min、60 min，通过比较回收率平均值和RSD，得到最佳反应时间。
1.3.5 方法学研究
（1）线性范围和线性方程
在最佳萃取及检测条件下，得到峰面积（Y）与EC含量（X）之间的关系曲线，进而得到线性方程和线性范围。
（2）精密度实验
对同一葡萄酒样品进行6次重复测定，测定精密度实验结果的RSD。
（3）加标回收率实验
检测葡萄酒样品中的EC含量，然后向葡萄酒中加入EC标品后，再次检测加标后的EC含量。分别吸取EC标准溶液（50 mg/L）0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL置于10 mL容量瓶中，并用葡萄酒样品定容，得到加标量为50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的葡萄酒样品，计算加标回收率。
1.3.6 数据分析
实验过程中每个样本设置3个平行，并计算重复样本的平均值和标准偏差。用SPSS 19.0进行差异显著性分析，采用Origin 2019b软件进行制图。
2 结果与分析
2.1 样品前处理条件的优化
2.1.1 吸附时间的优化
葡萄酒样品进行萃取时，研究不同吸附时间下EC的回收率，试验结果见表2。
表2 不同吸附时间对葡萄酒中氨基甲酸乙酯回收率的影响
Table 2 Effect of different adsorption time on ethyl carbamate in wine
由表2可知，不同吸附时间下，其回收率和相对标准偏差大有不同，在吸附时间4 min时，氨基甲酸乙酯的平均回收率最低，且相对标准偏差较大。随着葡萄样品萃取吸附时间的增加，回收率平均值趋于先增大后降低的趋势，而相对标准偏差呈现相反的趋势，当吸附时间为10 min时，平均回收率为88.9%，接近100%，相对标准偏差为2.32%，该吸附时间下提取EC效果最好。
2.1.2 淋洗溶剂的优化
在葡萄酒样品被吸附后，使用极性溶剂进行淋洗，可以有效去除色素、糖分等杂质，而氨基甲酸乙酯还可以有效的留在固相萃取柱上，试验中通过正己烷、乙酸乙酯、甲苯作为淋洗剂，以此确定最佳淋洗溶剂，结果见表3。
表3 不同淋洗溶剂对葡萄酒中氨基甲酸乙酯回收率的影响
Table 3 Effect of different washing solvents on ethyl carbamate in wine
由表3可知，使用不同的溶剂进行淋洗时，其回收率和相对标准偏差也不同，当使用甲苯进行淋洗时，EC不能够很好的留在固相萃取柱上，故平均回收率最低，相对标准偏差为6.67%；使用乙酸乙酯淋洗时，其回收率平均值高于甲苯，为75.0%，且具有最大的相对标准偏差为11.07%；使用正己烷进行淋洗时，发现EC物质能够很好的保留在固相萃取柱上，此时平均回收率为89.5%，相对标准偏差为4.83%，正己烷提取EC效果最好。
2.1.3 洗脱溶剂的优化
（1）洗脱溶剂种类的选择
在确定淋洗溶剂后，根据EC的性质，选取乙酸乙酯、乙醚、乙酸乙酯∶乙醚（5∶95，V/V）3种溶剂作为洗脱溶剂，结果见表4。
表4 不同洗脱溶剂对葡萄酒中氨基甲酸乙酯回收率的影响
Table 4 Effect of different elution solvents on ethyl carbamate in wine
由表4可知，使用不同洗脱溶剂时对氨基甲酸乙酯的提取作用也不同，当洗脱溶剂为乙醚时，平均回收率仅为58.3%，相对标准偏差为4.29%，因此乙醚不适合作洗脱溶剂；使用乙酸乙酯时，其平均回收率为80.4%，相对标准偏差为3.38%；使用乙酸乙酯∶乙醚（5∶95）溶液时，该洗脱溶剂对洗脱效果的影响最好，此时氨基甲酸乙酯回收率达到95.1%。
（2）洗脱溶剂比例的优化
确定最优的洗脱溶剂后，进行洗脱比例的优化，结果见表5。
表5 洗脱溶剂比例对葡萄酒中氨基甲酸乙酯回收率的影响
Table 5 Effect of elution solvent ratio on ethyl carbamate in wine
由表5可知，确定最佳洗脱溶剂后，对不同洗脱溶剂比例进行研究，发现随着乙酸乙酯与乙醚的体积比逐渐增加时，其平均回收率和相对标准偏差波动较大，说明洗脱溶剂比例对氨基甲酸乙酯的提取具有较大的影响；当乙酸乙酯与乙醚的体积比达到30∶70时，平均回收率最低为72.5%，相对标准偏差为1.52%，然而当乙酸乙酯与乙醚的体积比为5∶95时，平均回收率为92.5%，相对标准偏差为2.24%，其提取效果较佳。
从上述试验可以确定，采用固相萃取柱提取葡萄酒中的EC时，最佳固相萃取前处理：吸附时间为10 min，淋洗的弱极性溶剂为正己烷，洗脱溶剂为乙酸乙酯∶乙醚（5∶95，V/V）。
2.2 样品测定过程中反应时间的优化
在使用高效液相色谱测定样品中氨基甲酸乙酯的变化时，对荧光反应的时间进行优化，将其时间设定为5 min、15 min、30 min、45 min、60 min进行对比实验，结果见表6。
表6 反应时间对葡萄酒中氨基甲酸乙酯回收率的影响
Table 6 Effect of reaction time on ethyl carbamate in wine
由表6可知，不同的荧光反应时间对葡萄酒中氨基甲酸乙酯的作用是不同的，随着反应时间的增加，葡萄酒样品中氨基甲酸乙酯的平均回收率波动较大，而相对标准偏差呈现先增加后减少的趋势，当反应时间为15 min时，其平均回收率最低为75.5%，相对标准偏差为5.9%；当反应时间为60 min时其平均回收率与5 min的平均回收率接近，为了考虑实用性，选择荧光反应时间为5 min。
2.3 标品及样品的色谱图研究
本实验流动相为乙腈-乙酸钠，最佳固相萃取前处理以及检测条件下得到的EC标准样品和葡萄酒样品的色谱图见图1。
图1 氨基甲酸乙酯标准品（A）和葡萄酒样品（B）的色谱图
Fig.1 Chromatogram of ethyl carbamate standard (A) and wine samples (B)
由图1可知，在表1洗脱程序的试验下，获得了良好的色谱峰，该洗脱程序对EC分离度高、峰对成性良好，样品中的一些杂质可以与EC分开，因此可以用于葡萄酒中EC的检测。
2.4 线性范围和线性方程
在最佳条件下建立峰面积（Y）与氨基甲酸乙酯含量（X）的关系曲线，得到其线性方程为Y=1 125.891 64X+7.292 33，相关系数R=0.999 1，线性范围：10～1 000 μg/L。表明线性关系良好。
2.5 方法的精密度和检出限
对同一葡萄酒样品进行6次的重复试验，测定其氨基甲酸乙酯含量并计算RSD，结果见表7。
表7 葡萄酒样品中氨基甲酸乙酯测定方法的精密度试验结果（n=6）
Table 7 Results of precision experiments of the determination method of ethy carbamate in wine samples (n=6)
由表7可知，6次重复测定结果之间存在差异，但差异较小，针对6次重复做平均值，发现葡萄酒样品中的EC平均含量为20.3 μg/L，相对标准偏差为2.9%，说明该检测方法的重现性良好。设置进样量为20 μL，以3倍信噪比（S/N=3）作检出限，得到检出限5 μg/L。
2.6 加标回收率试验
取相同的葡萄酒样品，分别吸取质量浓度为50 μg/L，100 μg/L，200 μg/L的氨基甲酸乙酯标品，按照上述方法进行测定，结果见表8。
表8 加标回收率实验结果
Table 8 Results of standard addition recovery rate experiments
通过在葡萄酒中添加三个水平的EC标准溶液，按上述方法进行回收率实验，结果表明，葡萄酒样品测定结果平均回收率为88.5%～92.8%，相对标准偏差为2.9%～6.9%，平均回收率较高且相对标准偏差较小，说明该检测方法可以用来进行葡萄酒中氨基甲酸乙酯的而检测。
3 结论
本研究优化葡萄酒中EC含量测定的高效液相-荧光检测法。采用优化后的方法，精密度实验结果的相对标准偏差为2.9%～6.9%（n=6），加标回收率在88.5%～92.8%，EC检测限达到5 μg/L，操作快捷、精密度和回收率良好，容易掌握和进一步推广，可以将其用到葡萄酒样品中EC的测定。
[1]LUO L,LEI H T,YANG J Y,et al.Development of an indirect ELISA for the determination of ethyl carbamate in Chinese rice wine[J].Anal Chim Acta,2017,950:162-169.
[2]陈丽叶.饮料酒中氨基甲酸乙酯的研究进展[J].食品工业，2020，41（8）：235-239.
[3]MILLER Y E,DWYER N,KEITH R L,et al.Induction of a high incidence of lung tumors in C57BL/6 mice with multiple ethyl carbamate injections[J].Cancer Lett,2003,198(2):139-144.
[4]MASASHI T,HIROSHI S,YASUYUKI O,et al.Mutation analysis of vinyl carbamate or urethane induced lung tumors in rasH2 transgenic mice[J].Toxicol Lett,2003,142(1):111-117.
[5]ZHOU K,LIU Y,LI W Q,et al.An improved HPLC-FLD for fast and simple detection of ethyl carbamate in soy sauce and prediction of precursors[J].Food Anal Method,2017,10(12):3856-3865.
[6]黄敏兴，高裕锋，甄振鹏，等.气相色谱-正化学源-串联三重四极杆质谱法测定面包中氨基甲酸乙酯[J].食品与发酵工业，2020，46（1）：269-273.
[7]王雅楠，郭欣然，王宗义，等.盐辅助分散液液微萃取-气相色谱-串联质谱法检测葡萄酒中的氨基甲酸乙酯[J].食品安全质量检测学报，2020，11（5）：1364-1368.
[8]YE C W,ZHANG X N,HUANG J Y,et al.Multiple headspace solidphase microextraction of ethyl carbamate from different alcoholic beverages employing drying agent based matrix modification[J].J Chromatogr A,2011,1218(31):5063-5070.
[9]张万利，梁新红，冉军舰，等.SLE结合GC-MS法测定葡萄酒中氨基甲酸乙酯[J].中国酿造，2017，36（1）：176-179.
[10]谭文渊，袁东，付大友，等.HPLC测定白酒中的氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯[J].食品研究与开发，2013，34（5）：87-89.
[11]白丽真，张帆，刘洪银，等.两种液相方法用于检测白酒中的氨基甲酸乙酯[J].酿酒，2021，48（3）：38-41.
[12]章晴，陈士恒，史晓梅，等.气相色谱-质谱检测葡萄酒中氨基甲酸乙酯预处理方法的比较研究[J].食品安全质量检测学报，2015，6（4）：1137-1142.
[13]ZHANG J,LIU G,ZHANG Y,et al.Simultaneous determination of ethyl carbamate and urea in alcoholic beverages by high-performance liquid chromatography coupled with fluorescence detection[J]. J Agr Food Chem,2014,62(13):2797-2802.
[14]高年发，宝菊花，孙晓雯，等.HPLC测定白兰地中的氨基甲酸乙酯[J].中国酿造，2008，27（13）：84-87.
[15]董文静，何啸峰，沈洁，等.固相萃取-气相色谱串联质谱法测定梅州地区客家娘酒中的氨基甲酸乙酯及其食用风险评估[J].食品安全质量检测学报，2021，12（9）：3508-3513.
[16]WU P G,PAN X D,WANG L Y,et al.A survey of ethyl carbamate in fermented foods and beverages from Zhejiang,China[J].Food Control,2012,23(1):286-288.
[17]宋利军，杨竹，周银古，等.江西省产黄酒中氨基甲酸乙酯残留量的GC-MS分析[J].中国酿造，2014，33（3）：147-150.
[18]李刚，梁新红，葛晓虹.GC/MS内标法测定葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量[J].酿酒科技，2010（5）：98-101.
[19]孙骏飞，陈臣，崔海灏.气相色谱-质谱检测浓香型白酒氨基甲酸乙酯预处理方法的研究[J].酿酒，2019，46（2）：102-104.
[20]赵依芃，王宗义，李德美，等.稳定同位素稀释-液相色谱-串联质谱法直接测定酒类中氨基甲酸乙酯[J].食品科学，2015，36（8）：220-224.
[21]王丽娟，柯润辉，王冰.超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法直接测定黄酒和葡萄酒中氨基甲酸乙酯[J].色谱，2012，30（9）：903-907.
[22]HERBERT P,SANTOS L,BASTOS M,et al.New HPLC method to determine ethyl carbamate in alcoholic beverages using fluorescence detection[J].J Food Sci,2002,67(5):1616-1620.
[23]薛锡佳，杨牢记，吴宏萍，等.两种氨基甲酸乙酯检测方法的比较及阜阳市售瓶装白酒中氨基甲酸乙酯含量调查[J].酿酒，2016，43（5）：103-106.
[24]项东方.黄酒中氨基甲酸乙酯的形成、控制及检测方法[J].食品安全导刊，2016（30）：79.
[25]陈达炜，荫硕焱，高洁，等.高效液相色谱-荧光法测定葡萄酒中氨基甲酸乙酯的含量[J].卫生研究，2014，43（1）：121-124.
[26]刘楚楚，陈二芳，刘倩倩.基于GC-MS测定白酒中氨基甲酸乙酯的探讨[J].酿酒，2021，48（1）：120-123.
[27]陈达炜，苗虹，赵云峰，等.酒精度对高效液相色谱-荧光法分析白酒中氨基甲酸乙酯含量的影响[J].色谱，2013，31（12）：1206-1210.
[28]诸葛庆，李博斌，江涛，等.固相萃取-高效液相色谱法测定黄酒中氨基甲酸乙酯[J].酿酒科技，2012（1）：112-115.