玛咖（Lepidium meyenii Walp.）是属于十字花科的秘鲁土著植物，主要生长在海拔高于4 000米的高原地区[1]。玛咖在20世纪90年代初引入我国，并于2011年获批为新资源食品[2]。玛咖传统上在秘鲁被当地人作为一种粮食作物种植，除了作为食品食用外，玛咖还被视为一种天然的壮阳药物[3]。除了秘鲁当地人食用玛咖，全世界对玛咖的需求都在增长，现阶段我国云南、西藏等高海拔地区均成功引种玛咖[4]，甘肃省天祝藏族自治县也于2017年引种成功。
玛咖中富含的维生素、矿物质、有机酸等有效成分，其中的玛咖生物碱能全面调理人体机能，平衡内分泌[5]，具有抗氧化、抗肿瘤[6]及提高动物成熟卵泡小体的数量和精子的质量，从而显著提高哺乳动物的生育能力[7]。研究表明玛咖具有调节性激素[8-10]、促进肠胃运动[11]、保肝[12-13]、改善记忆力[14]、抗抑郁[15]、镇痛[16]等功效，且细胞毒性[17]、急性毒性[18]和长期毒性[19]较低，安全性较高，因此以玛咖为原料的保健品日益受到人们的瞩目。现在市场上大多数产品为玛咖粗提物或粗粉，这种产品短期服用，人体不易吸收，服用效果不是很理想[20]。目前，对于玛咖酒的研究主要分为玛咖浸泡酒和玛咖发酵酒两个方向，浸泡酒一般为高度酒[21-22]（酒精度＞40%vol），发酵酒则需外加蔗糖[23]、糯米[24]等作为碳源且酒精度较低（10%vol左右）。
超高压技术是一种新型的食品加工技术，常用水作为压力传递介质，对在一定温度下包装密封于弹性容器中的食品，施加一定压力（100～1 000 MPa），从而改变食品的功能性质[25]。超高压能够最大程度保持食品的原始风味与营养物质，还能够降低加工能耗，提高能源利用效率，减少环境污染，符合绿色发展理念[26]。超高压技术在有效成分提取方面具有提取时间短、提取效率高、能耗低的优点[27]。酶具有催化效率高、作用专一的特性，通过应用酶技术可以提高产品深加工程度。果胶酶主要作用是处理破碎果实，加速过滤，促进澄清[28]，纤维素酶可促进植物细胞壁的溶解，使更多的植物细胞内容物溶解出来[29]。超高压可通过影响酶蛋白的三级结构来影响酶的催化活性，由于蛋白质的三级结构是形成酶活性中心的基础，超高压作用导致三级结构崩溃时，使酶活性中心的氨基酸组成发生改变或丧失活性中心，从而改变其酶的催化活性，而在较低压力下酶的活性开始上升则被认为是压力产生了酶活性中心的凝聚作用[30]。其次，在完整组织中的酶和基质经常被隔离，而较低的压力反而可以破坏这种隔离状态，使酶与基质相互接触，从而加速酶促反应活性[31]，因此，在超高压处理酶时就要注意压力和温度的结合。
玛咖纤维素含量高、韧度大[32]，为有效提取玛咖中的活性成分生物碱，本研究以玛咖为原料，采用超高压-酶解技术制备玛咖酒，以总生物碱提取率和感官评分为评价指标，采用单因素试验及响应面试验优化玛咖酒的制备工艺条件，旨在充分发挥甘肃玛咖资源优势，提高其经济附加值，为玛咖酒的产业化开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
玛咖（充分成熟，自然干燥，大小适中、结构紧密、颈部细小，有玛咖天然的辛辣味，外皮黄色，内部为一致的白色或淡黄色）：甘肃天祝藏族自治县、体积分数95%乙醇（分析纯）、果胶酶（50万U/g）、纤维素酶（50万U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
ZN-1000高速中药粉碎机：中南制药机械厂；超高压生物反应器：凯兰德科技实业有限公司；HH-4电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器公司；AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UH5300双光束紫外可见光分光光度计：日立高新技术公司。
1.3 方法
1.3.1 玛咖酒的制备工艺流程及操作要点
玛咖块根→粉碎→加酶、活化→常压酶解或超高压-酶解→加体积分数95%乙醇浸泡→过滤→包装→玛咖酒
操作要点：
将玛咖块根粉碎，过100目筛，称取玛咖粉末20 g，以料液比1∶30（g∶mL）加水，加果胶酶（添加量0.5‰）、纤维素酶（添加量0.2‰），60 ℃水浴活化30 min后，以常压酶解（酶解温度55 ℃、酶解pH 5、酶解时间2 h）为对照，进行超高压-酶解处理（压力90 MPa、酶解温度55 ℃、酶解pH 5、酶解时间2 h），酶解后放入棕色细口瓶中，加入体积分数95%乙醇的酒精调整酒精度至55%vol浸泡15 d后过滤，加盖密封即得玛咖酒成品，并避光贮存。
1.3.2 玛咖酒的超高压-酶解制备工艺优化
单因素试验：以料液比1∶30（g∶mL）加水，设定酶解温度为45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃，酶解压力为90 MPa、100 MPa、110 MPa、120 MPa和常压，乙醇体积分数为45%、50%、55%、60%、65%进行单因素试验，考察各因素对玛咖酒总生物碱提取率和感官评分的影响。
响应面试验：根据单因素试验结果，选出对玛咖酒感官指标影响较大的3个因素酶解压力（A）、乙醇体积分数（B）、酶解温度（C）为自变量，以玛咖酒综合评价值（Y）为响应值，并根据中心复合试验设计原理，进行3因素3水平的响应面试验，其因素及水平见表1。
表1 制备工艺优化响应面试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for preparation process optimization
1.3.3 分析检测
（1）生物碱的测定
生物碱的测定采用分光光度法。
盐酸小檗碱标准曲线制作：参考文献[33-34]的方法，以盐酸小檗碱对照品浓度为横坐标（X），以吸光度值为纵坐标（Y），绘制盐酸小檗碱标准曲线，获得盐酸小檗碱的标准曲线回归方程为Y=20.765X+0.035，相关系数R2为0.998 1。
玛咖粉中生物碱测定[35]：玛咖粉甲醇浸提3次，合并提取液并浓缩为浸膏，2%HCl洗涤3次，合并酸液，5 000 r/min离心10 min，上清液用质量分数10%的NaOH调节pH至10，再用等体积氯仿萃取3次，合并萃取液后浓缩定容至10 mL，按标准曲线处理方法于波长414 nm处测吸光度值，代入盐酸小檗碱标准曲线回归方程计算玛咖粉中生物碱含量。
玛咖酒中生物碱测定[36]：玛咖酒10.0 mL，注入烘干的瓷蒸发皿内，置于沸水浴上蒸发至浸膏，2%HCl洗涤溶解3次，合并酸液，10 000 r/min 离心15 min。取酸溶液，用质量分数10%NaOH溶液调至pH 10，再用等体积氯仿萃取3次，合并萃取液并定容至10 mL，按标准曲线处理方法于波长414 nm处测定吸光度值，代入标准曲线回归方程计算玛咖酒中总生物碱的含量。
（2）生物碱提取率计算
生物碱的提取率计算公式如下：
式中：P为总生物碱提取率，%；C为提取液中生物碱质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；M为玛咖粉中生物碱含量，mg。
（3）综合评价值计算
综合评价值=总生物碱提取率得分×40%+感官评分×60%
总生物碱提取率得分以提取率达到70%为100分，其他按比例计算。
1.3.4 感官鉴评方法
参考曲云龙[37]的白酒感官评定方法，由8名专业人员组成感官评价小组，以外观、香气、色泽、滋味为评价指标，对样品进行评分，总分100分，玛咖酒感官评分标准见表2。
表2 玛咖酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Maca wine
1.3.5 数据处理
本实验采用Design-Expert 8.0.6软件分析处理数据，采用Excel2019软件绘图。
2 结果与分析
2.1 玛咖酒的超高压-酶解制备工艺优化单因素试验
2.1.1 酶解温度对玛咖酒品质的影响
在常见的纤维素酶产生菌中，如曲霉、青霉及木霉，产生的酶一般为酸性酶，酶的最适温度大多在45～65 ℃之间。酶解温度对玛咖酒总生物碱提取率及感官指标的影响见图1。
图1 酶解温度对玛咖酒总生物碱提取率及感官评分的影响
Fig.1 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate of total alkaloids and sensory scores of Maca wine
由图1可知，随着酶解温度在45～60 ℃范围内的升高，总生物碱提取率和感官评分均逐渐增加，当酶解温度为60 ℃时，总生物碱提取率、感官评分最高，分别为42.67%、88分，当酶解温度高于60 ℃，总生物碱提取率和感官评分下降。故确定最适酶解温度为60 ℃。
2.1.2 酶解压力对玛咖酒品质的影响
酶解压力对玛咖酒感官指标及总生物碱提取率的影响见图2。
由图2可知，随着酶解压力在90～110 MPa范围内的升高，总生物碱提取率与感官评分均逐渐增加，当酶解压力为110 MPa时，玛咖酒感官评分和总生物碱提取率均达到最高值，分别为93分、67%，当酶解压力＞110 MPa，感官评分及总生物碱提取率均下降而常压下酶解的玛咖酒总生物碱提取率远低于超高压酶解，故确定最适酶解压力为110 MPa。
图2 酶解压力对玛咖酒总生物碱提取率及感官评分的影响
Fig.2 Effects of enzymatic hydrolysis pressure on total alkaloid extraction rate and sensory scores of Maca wine
2.1.3 乙醇体积分数对玛咖酒品质的影响
由图3可知，乙醇体积分数对总生物碱提取率影响不大，当乙醇体积分数为60%时，总生物碱提取率达到最大值，为34%；当乙醇体积分数在45%～60%时，玛咖酒感官评分逐渐增加，当乙醇体积分数为60%时，感官评分达到最大值，为90分，当乙醇体积分数＞60%，感官评分下降。故确定最适乙醇体积分数为60%。
图3 乙醇体积分数对玛咖酒总生物碱提取率及感官评分的影响
Fig.3 Effects of ethanol volume fraction on total alkaloid extraction rate and sensory scores of Maca wine
2.2 玛咖酒超高压酶解制备工艺优化响应面试验结果
2.2.1 响应面试验结果及方差分析
根据单因素试验结果，选出对玛咖酒感官指标影响较大的3个因素为自变量，即酶解压力（A），乙醇体积分数（B）及酶解温度（C），以玛咖酒综合评价值为响应值（Y），并根据中心复合试验设计原理，进行3因素3水平的响应面试验，响应面试验结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 制备工艺优化响应面试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of response surface experiments for preparation process optimization
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.05），“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
试验结果采用Design-Expert 8.0.6软件ANOVA程序，进行二次回归分析，得到玛咖酒综合评价值的变化对酶解压力、乙醇体积分数以及酶解温度的二次回归方程为：
由表3可知，回归模型P值＜0.000 1，说明所得回归方程极显著，失拟项P=0.170 2＞0.05，不显著，说明此回归模型拟合度良好，可信度较高。模型决定系数R2=0.999 0，调整决定系数R2adj=0.997 8，说明该模型拟合程度较好，由P值可知，一次项A、B、C，交互项AB对结果影响极显著（P＜0.01），其他因素对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，影响综合评价值的各因素顺序为乙醇体积分数（B）＞酶解压力（A）＞酶解温度（C）。
2.2.2 各因素交互作用响应面分析
由图4可知，当酶解压力、乙醇体积分数、酶解温度两两交互作用时，对玛咖酒综合评价值有影响，其中，A、B互交作用响应曲面较为陡峭，等高线椭圆程度较为明显，表明A与B之间具有良好的交互作用，对综合评价值影响显著（P＜0.05）。这与方差分析结果一致。
图4 各因素交互作用对玛咖酒综合评价值影响的响应曲面及等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on comprehensive evaluation value of Maca wine
2.2.3 酶解制备工艺优化验证试验
由Design-Expert 8.0.6软件对上述试验结果进行优化分析，获得玛咖酒最佳超高压-酶解制备工艺条件为：酶解压力110.02 MPa，乙醇体积分数59.89%，酶解温度60.01 ℃，在该条件下，综合评价预测值为96.04分。考虑到实际操作，将制备工艺条件修正为：酶解压力110 MPa，乙醇体积分数60%，酶解温度60 ℃，在此优化条件下，进行3次平行验证试验，得到玛咖酒综合评价实际值为96.1，与预测值接近。其中总生物碱提取率为67.28%，感官评分为96.06分。
3 结论
本研究选用甘肃玛咖为原料，采用超高压酶解技术制备玛咖酒。玛咖酒最佳超高压-酶解制备工艺条件为：酶解压力110 MPa，酶解温度60 ℃，乙醇体积分数60%，在该优化条件下，玛咖酒总生物碱提取率为67.28%，感官评分为96.06分，呈金黄色，具有玛咖的天然野草根气味，有玛咖的特殊辛辣味，酒质澄清，无杂质。且产品设计、生产及检验标准均符合国标GB 2757—2012《蒸馏酒及其配制酒》的要求。该研究充分利用甘肃新兴资源玛咖加工玛咖酒，采用该工艺缩短了玛咖酒生产工艺环节，提高了原料利用率，优化了玛咖酒的生产工艺，提高了产品中有效成分含量，节约了生产成本，开创了新的加工手段，为甘肃省开发利用玛咖资源提供了新的方向。
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