随着人们生活水平的不断提升，对饮食的品质需求也越来越高，以酱油为代表的调味品对于增加食品的鲜美风味具有重要作用。近年来，人们对于酱油的风味和品类的需求也呈现越来越高的趋势，具有特殊风味的同时兼具一定功能的酱油成为酱油产业发展的一个重要方向[1]。
牡蛎，属于牡蛎科的一种软体动物，作为一种味道鲜美、营养丰富的功能保健海洋性食品，牡蛎含有丰富的牡蛎多肽、多糖、多不饱和脂肪酸、牛磺酸、维生素、矿物质等活性成分，是一种食用口感和营养价值俱佳的食物[2-4]。其独特的价值及产品开发也成为国内外的研究热点，牡蛎的水解加工是提升牡蛎产品价值和功能活性的重要加工方式[5-8]。MIAO J等[9]研究结果表明，牡蛎经过蛋白酶水解处理后，水解液中富含抗疲劳、抗氧化活性成分。UMAYAPARVATHI S等[10]从牡蛎水解物中分离出具有对人结肠的抗癌功效的抗氧化多肽，这为牡蛎水解物用于食品和营养保健品中提供了指导。将牡蛎应用于酱油酿造中，既可以充分发挥牡蛎原料的保健功能活性，又能丰富酱油的海鲜风味，具有较高的应用价值和研究意义。
目前国内的调味品市场上，海鲜酱油品种较少，国外则少有海鲜酱油的研究报道，海鲜调味品种类主要集中于鱼露、虾酱、虾油等[11-14]。已报道文献中使用牡蛎为原料的调味品主要是使用传统工艺生产的蚝油产品[15]，但蚝油产品的使用场景和风味与酱油又有着明显的不同，难以适用于使用酱油的烹饪场景。使用牡蛎为原料制作酱油的报道较少，孔繁东等[16]使用牡蛎、豆粕和麸皮为原料，通过试验优化制曲配料比和发酵条件，采用低盐固态发酵酿造出了海鲜风味浓郁，氨基酸态氮、牛磺酸含量丰富的牡蛎酱油，但该工艺为开放式高温发酵，对酱油风味和口感均有一定的影响。因此，为了提升牡蛎酱油的生产效率和风味品质，本研究首先对牡蛎进行蛋白酶酶解处理，后将其酶解液随豆粕、小麦等一起经过高盐稀态发酵，在较短的发酵时间内酿制出一种具有良好风味和丰富营养成分的牡蛎酱油。牡蛎酱油的开发对于牡蛎资源的开发利用与新型海鲜风味酱油的研制都具有重要意义，更为海洋生物资源在食品产业的开发和高值化利用提供有利的支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
米曲霉（Aspergillus oryzae）3.042：石家庄鼎新科技有限公司；复合酵母（鲁氏酵母（Sacharomyces rouxi）、球拟酵母（Torulopsis bombicola）约1∶1混合）：青岛灯塔味业有限公司。
太平洋牡蛎：青岛海泉崂山特色水产品公司；豆粕（一级，蛋白≥46%）：九三食品股份有限公司；小麦（四级，容重≥730）：青岛品品好食品发展有限公司；食盐：市售。
中性蛋白酶（酶活150 000 U/g）：庞博生物工程有限公司；牛磺酸等氨基酸标准品（纯度＞99.0%）：美国Sigma 公司；其他试剂均为国产分析纯。
种曲培养基：豆粕75 g，小麦粉25 g，水60 mL。121 ℃下灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
L18-Y915S破壁机：九阳股份有限公司；DK-S26水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；SPX-280恒温培养箱：宁波江南仪器厂；VC4-H2生物冰箱：海尔电器有限公司；5804R离心机：德国Eppendorf公司；pHS-3E型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；Kjeltec 2300凯氏定氮仪：福斯分析仪器有限公司；Waters Alliance 2695高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国沃特世科技有限公司；7980-5975c气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：安捷伦科技（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 种曲的制备
种曲的制备：种曲培养基灭菌冷却至室温后，按0.3%的接种量接入米曲霉，30 ℃条件下，制曲约42～48 h出曲（约22～24 h翻曲一次，曲料表面出现裂痕，便开始翻曲）。参照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》测定成曲的中性蛋白酶酶活[17]。所制得的种曲呈黄绿色，表面有孢子，中性蛋白酶活力为1 700 U/g。
1.3.2 牡蛎酶解液的制备
牡蛎按料液比1∶5（g∶mL）加水匀浆后，按1%添加量（以牡蛎湿质量计）加入蛋白酶，40 ℃下酶解8 h，可获得水解度为31.2%的牡蛎酶解液[16]。
1.3.3 牡蛎酱油的加工工艺流程及操作要点
操作要点：种曲制作完成后，加入低于4 ℃的饱和盐水（23%），进行低温发酵（发酵温度＜10 ℃）15 d。然后在第15～30天，缓慢进行升温，每天升温1 ℃。在第30～120天，发酵过程控温在25～28 ℃。期间在发酵第40～50天，按添加量2.5%加入复合酵母，在加入酵母发酵10 d左右后，便加入牡蛎酶解液（0%（对照）、15%、20%、25%、30%）进行共同发酵，直到发酵期满120 d。对照酱油的酿造除牡蛎酶解液用等量的饱和盐水代替外，其他工艺流程均与牡蛎酱油一致。
1.3.4 感官评价
使用定量描述分析对酱油的色泽、亮度、挂壁性、香气、咸度、甜度、鲜度、海鲜风味及整体评价9个方面进行评价。感官评价实验在室温（23±2）℃条件下进行，由12位经培训过的感官评定员（6男6女）对酱油样品进行0～10分的评分。0分代表特性最低值，10分代表特性最高值，具体评分标准见表1。
表1 牡蛎酱油的感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of oyster soy sauce
1.3.5 理化指标分析检测
NaCl含量的测定：参照国标GB 5009.42—2016《食盐指标的测定》；总酸（total acid，TA）含量的测定：参照国标GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》；氨基酸态氮（amino nitrogen，AN）含量、全氮（total nitrogen，TN）含量的测定：参照国标GB/T 18186—2000《酿造酱油》。水解度计算公式如下：
1.3.6 氨基酸含量测定
称取一定量的酱油样品于水解管中，加入15mL6mol/L HCl，样品溶解后，在110 ℃的恒温干燥箱中水解20～24 h，定容成水解液。取20 mL上述水解液进行真空干燥，样品衍生，再次进行干燥。将样品稀释液与干燥样品混合溶解，以8 000 r/min转速、4 ℃离心15 min，取上清液采用高效液相色谱法测定。
牛磺酸含量的测定：参照国标GB 5009.169—2016《食品中牛磺酸的测定》中的第一法。
1.3.7 挥发性风味物质成分含量的测定
酱油中挥发性风味物质成分测定采用气相色谱-质谱联用法。
前处理条件：称取样品10 mL，加入到20 mL顶空瓶中，拧紧瓶盖以防风味成分挥发。于60 ℃磁力搅拌5 min后，用固相微萃取针萃取30 min，立即插入气相色谱-质谱仪器的进样口，于进样口250 ℃解吸5 min。
气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度设置为250 ℃，升温程序为：初始温度为50 ℃，保持5 min，先按4 ℃/min升温至120 ℃，保持2 min，再按10 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min。选用不分流模式进样，载气为氦气（He），流速为1.0 mL/min。
质谱条件：采用电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度250 ℃，四级杆温度150 ℃，质量扫描范围为40～400 amu。
定性定量分析：质谱数据库为美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）08，选择匹配度＞80%的峰对酱油的挥发性风味物质进行定性分析。采用面积归一化法定量各挥发性成分的相对含量。
2 结果与分析
2.1 牡蛎酶解液在酱油中添加量优化
氨基态氮含量是酱油品质的一项关键性评价指标，由图1可知，牡蛎酶解液添加量为25%的牡蛎酱油氨基态氮含量最高，达1.2 g/100 mL。牡蛎酱油全氮含量为1.9 g/100 mL，比对照组提高了0.07 g/100 mL，比国标GB 18186—2000《酿造酱油》中特级酱油（1.5 g/100 mL）提高了0.4 g/100 mL。牡蛎酶解液添加量为25%的牡蛎酱油pH为5.6，NaCl含量达16.1 g/100 mL，总酸含量为1.45 g/100 mL，均符合国标GB 18186—2000《酿造酱油》特级酱油标准。故综合考虑原料成本、工艺操作性及产品品质等因素，确定最佳牡蛎酶解液添加量为25%。
图1 牡蛎酶解液添加量对酱油的全氮及氨基态氮含量的影响
Fig.1 Effect of oyster hydrolysate addition on total nitrogen and amino nitrogen content in soy sauce
同组小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
2.2 牡蛎酱油的感官评价
由图2可知，牡蛎酱油及对照酱油感官整体评分分别为8.8分、6.8分。在海鲜风味方面，牡蛎酱油得分8.5分，对照酱油得分5.0分，表明牡蛎酱油的海鲜风味相较对照酱油极为突出。此外，在鲜度及香气方面，牡蛎酱油得分为6.7分、7.8分，对照酱油得分为5.7分、4.7分，牡蛎酱油均表现出一定的优势。表明该牡蛎酱油具有香气浓郁、海鲜风味显著的特点。
图2 牡蛎酱油与对照酱油感官分析雷达图
Fig.2 Radar chart of sensory evaluation of oyster soy sauce and control soy sauce
2.3 牡蛎酱油的氨基酸含量分析
由表2可知，牡蛎酱油和对照酱油中均鉴定出17种氨基酸，其中必需氨基酸（essential amino acid，EAA）有7种，牡蛎酱油和对照酱油中的必需氨基酸分别占总氨基酸（total amino acid，TAA）的42.8%、41.9%，而必需氨基酸/非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）分别为74.9%、72.2%，接近世界卫生组织（world health organization，WHO）/联合国粮食及农业组织（food and agriculture organization，FAO）的推荐氨基酸模式（EAA/TAA在40%左右，EAA/NEAA在60%以上），氨基酸比例合理，是一种质量较佳的蛋白调味品。牡蛎酱油和对照酱油均富含6种鲜味氨基酸，其鲜味氨基酸含量分别占氨基酸总量的41.8%、40.5%。从几种鲜味氨基酸含量可看出，牡蛎酱油的各类鲜味氨基酸含量均略高于对照酱油，此结果与感官评价实验结果一致，可见该牡蛎酱油具有更为鲜美的风味。
表2 牡蛎酱油与对照酱油的氨基酸种类及含量测定结果
Table 2 Determination results of amino acids kinds and contents in oyster soy sauce and control soy sauce
注：“*”表示必需氨基酸；“△”表示鲜味氨基酸。
此外，在非蛋白质氨基酸的分析中可以看出，相较没有添加牡蛎酶解液的对照酱油，牡蛎酱油中牛磺酸的含量显著提高，其牛磺酸的含量高达36.7 mg/100 g，约为对照酱油中牛磺酸的含量（2.7 mg/100 g）的13.6倍。研究表明，牛磺酸对人体具有抗氧化、解毒、神经调节及稳定细胞膜等功能活性[18-20]，高含量的牛磺酸有可能为牡蛎酱油增加一定的功能活性。
2.4 牡蛎酱油的挥发性风味成分
通过GC-MS分别检测了牡蛎酱油和对照酱油中的挥发性风味物质，主要的挥发性成分及其相对含量（相对含量＞0.4%）、挥发性风味成分类别分别见表3和表4。
表3 牡蛎酱油与对照酱油中主要挥发性风味成分含量的测定结果
Table 3 Determination results of major volatile flavor components contents in oyster soy sauce and control soy sauce
注：“-”表示相对含量≤0.4%。
表4 牡蛎酱油与对照酱油挥发性风味成分类别
Table 4 Types of volatile flavor components in oyster soy sauce and control soy sauce
由表3和表4可知，牡蛎酱油和对照酱油在挥发性成分上大部分是相同的，但也各具独特性，尤其是在各类挥发性成分的相对含量上存在较大的差异。从挥发性物质的相对含量而言，两种酱油均以醇类物质居多，其他类物质的相对含量则存在较大的差异。醇类物质是在酱油酿造过程中经酵母发酵和氨基酸降解而形成的一种常见的香味成分。典型的乙醇具有令人愉悦的酒香味，而苯乙醇则具有一种花草及水果的香味[21]。郭梦瑶等[22]通过采用液液萃取与全二维气相色谱-嗅闻-质谱联用对5种市售高盐稀态酱油的挥发性成分化合物进行了探究，发现苯乙醇是酱油中的关键气味化合物之一。呋喃类物质在牡蛎酱油中占据第二，明显高于在对照酱油中的含量，这可能与牡蛎酱油的海鲜风味有较大的关联。呋喃类物质是海鲜的一种重要风味物质，尤其是在储存和热加工过程中容易形成[23-24]。NGUYENT H D等[25]的研究也表明，2-甲基呋喃是形成蚝油风味的最显着的挥发性化合物之一。此外，烯烃、醇类、醛类物质也是牡蛎风味形成的重要物质[26-27]。刘文等[28]对牡蛎体液种风味物质进行了GC-MS分析，发现新鲜牡蛎体液以清新的果香为主，略有肉香，主要挥发性成分是醛类和酯类。而经热处理后的牡蛎肉香和焦香味增强，主要挥发性成分是酮类和呋喃类。从具体的挥发性物质含量来看，牡蛎酱油中的挥发性风味物质主要以乙醇（47.1%）、2-庚基呋喃（12.4%）、戊基呋喃酮（8.3%）、苯乙醇（6.6%）为主，而对照酱油中主要以乙醇（24.1%）、4-乙基-2-甲氧基-苯酚（又名4-乙基愈创木酚）（15.2%）、苯乙醇（7.3%）、3-甲基-丁醇（5.3%）等为主。杨晓璇等[29]对不同品牌酱油分析研究也表明，醛酮类、醇类、杂环类等是多种酱油中均能鉴定出的挥发性化合物。除此之外，4-乙基愈创木酚、呋喃酮等物质也被认为是酱油的关键风味物质。因此这些具有不同风味的物质在酱油中的较大差异，是使得牡蛎酱油具有独特风味的关键。
3 结论
本研究采用高盐稀态工艺，通过添加牡蛎酶解液，成功酿造出一种新型牡蛎酱油，其pH、NaCl、氨基酸态氮、全氮、总酸含量等均符合食品安全国家标准GB 18186—2000《酿造酱油》要求。此外，牡蛎酱油富含牛磺酸，约为对照酱油的13.6倍，醇类、呋喃类等挥发性风味成分含量较高，具有浓郁的海鲜风味和良好的口感的同时，营养保健价值也十分突出，这为牡蛎酱油市场的开发提供了有利的支撑。
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