黄曲霉毒素（aflatoxin，AFT）主要是黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）在生长过程中产生的一类次级代谢产物[1-2]。AFT具有极强的致癌性、致畸性和致突变性，且广泛存在于谷物、坚果、果蔬、牛奶及肉中，1994年被国际癌症研究机构（international agency for research on cancer，IARC）列为ⅠA类致癌物[3-4]。其中黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的毒性最强，同时也是很强的诱变剂和致癌物[5-6]，是食品中最常检测到的污染化合物之一。目前AFB1的脱毒方法主要分为物理法、化学法和生物法，其中生物法因其条件温和、特异性好、脱毒效率高且不会对环境产生污染等优点，已成为国内外研究AFB1脱毒的热点，如酵母菌[7]、克雷伯氏菌[8]、芽孢杆菌[9-10]等。
嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）属乳酸菌，常见于鱼露和酱油中，革兰氏阳性菌，能从葡萄糖中产酸不产气[11-12]。研究表明，发酵产品中添加嗜盐四联球菌可以促进醇、酸、酯类物质的生成，并且与苯甲醛、乙酸甲酯、乳酸乙酯、香草醛等风味物质的生成有关，此外还能降低产品中亚硝酸盐的含量[13-15]。目前一些研究分析了乳酸菌对AFB1的脱毒情况[4，16-17]，但这些乳酸菌都不具有高盐耐受性，无法应用于高盐发酵食品的生产过程中。因此，为了确保发酵食品的安全性，研究耐高盐微生物对黄曲霉毒素B1的脱毒效果是十分必要的。
本研究探讨了嗜盐四联球菌不同组分对AFB1的降解效果，观察了嗜盐四联球菌在有无AFB1毒素环境中的生长情况和微观形态，以期为生物法降解黄曲霉毒素B1提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）：保藏于湖北工业大学湖北省食品发酵技术研究中心。
黄曲霉毒素B1标准品（纯度＞98%）：天津阿尔塔科技有限公司；甲醇（色谱纯）：美国Sigma-Aldrich有限公司；酵母提取物（生化试剂）：英国Oxoid公司；牛肉浸膏（生化试剂）：北京双旋微生物培养基制品厂；吐温-80、柠檬酸氢二铵、硫酸锰：上海麦克林生化科技有限公司；蛋白酶K、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）（均为分析纯）：德国BioFroxx公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
MRS液体培养基：蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、葡萄糖2%、乙酸钠0.3%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.058%、硫酸锰0.025%、牛肉膏1%、吐温-80 0.1%。
1.2 仪器与设备
YXQ-SG41-280-B高压蒸汽灭菌锅：上海医疗核子仪器厂；HPLC-1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：安捷伦科技（中国）有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：国华电器（试验）有限公司；AB-50电子分析天平：瑞士Mette公司；GNP-9160BS-Ⅲ恒温培养箱：上海新苗医疗器械制造公司；WFJ2000紫外可见分光光度计：上海龙尼柯仪器设备有限公司；JSM-6390LV扫描电子显微镜：日本电子株式会社；OMNI BeadRuptor24 Elite多功能样品均质器组织研磨器：美国OMNI Internatio-nal公司。
1.3 实验方法
1.3.1 嗜盐四联球菌的活化
将-80 ℃保藏的嗜盐四联球菌接种于MRS液体培养基中，于37 ℃、180 r/min活化24 h，传代两次后，备用。
1.3.2 嗜盐四联球菌接种量对AFB1降解率的影响
将嗜盐四联球菌按1%、3%、6%、9%（V/V）的接种量分别接种于含10 μg/mL AFB1的MRS液体培养基中，暗处分别培养0 h、12 h、24 h、48 h、72 h时取样，计算样品中AFB1的降解率。以含10 μg/mL AFB1的MRS液体培养基作为空白对照。
1.3.3 嗜盐四联球菌对不同浓度AFB1降解率的影响
将嗜盐四联球菌按1%（V/V）的接种量分别接种于含4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL AFB1的MRS液体培养基中，将其置于暗处培养，分别在0 h、12 h、24 h、48 h、72 h时取样，计算样品中AFB1的降解率。以含相同浓度AFB1的MRS液体培养基作为空白对照。
1.3.4 嗜盐四联球菌上清液、菌悬液和胞内液对AFB1降解率的测定
参考RAO K R等[10]的方法稍作修改。将1.3.1活化后的菌转接培养48 h后，培养液于4 ℃、9 000 r/min离心20 min收集上清液，用无菌磷酸缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）（pH7.0）清洗菌体沉淀物3次后重新悬于无菌PBS中，制得菌悬液备用。取部分菌悬液进行细胞超声破碎，于4 ℃、9 000 r/min离心20 min，经0.22 μm无菌滤膜过滤，制得菌株胞内液备用。
将上述上清液、菌悬液和胞内液分别加入10 μg/mL的AFB1，避光培养72 h后，测定AFB1的降解率。以无菌PBS和MRS液体培养基中分别加入同质量浓度的AFB1为空白对照。
1.3.5 不同变性处理对嗜盐四联球菌上清液降解AFB1的影响
取无细胞上清液分别作如下处理：100 ℃沸水浴处理20 min；0.1 mol/L EDTA处理1 h；1 mg/mL蛋白酶K在50 ℃条件下处理1 h；1%SDS和1 mg/mL蛋白酶K在50 ℃条件下混合处理1 h。处理结束后，分别向每个处理组中加入10 μg/mL的AFB1，避光培养72 h。以含10 μg/mL AFB1的MRS液体培养基为空白对照。
1.3.6 金属离子对嗜盐四联球菌无细胞上清液降解AFB1的影响
在含10 μg/mLAFB1的无细胞上清液中，分别加入100 mmol/L的Li+（LiCl）、K+（KCl）、Ca2+（CaCl2）、Mg2+（MgCl2）、Zn2+（ZnCl2）、Cu2+（CuCl2）、Fe3+（FeCl3）、Al3+（AlCl3）、Ba2+（BaCl2）和Mn2+（MnCl2）混合均匀，以添加相同浓度的金属离子和AFB1的无菌MRS液体培养基为空白对照，避光培养72 h，测定其降解率。
1.3.7 形态学观察
嗜盐四联球菌按1%（V/V）的接种量接于含10 μg/mL AFB1的MRS液体培养基中，以不含AFB1的菌株接种量相同的菌株培养液作为空白对照，共培养72 h后，分别于4 ℃、9 000 r/min离心20min，弃去上清液，菌体用PBS（pH7.2）洗涤3次，取一滴菌体重悬液滴加在平整的锡箔纸上烘干，4 ℃条件下用2.5%的戊二醛溶液固定4 h以上，完成后吸出多余固定液，随后用梯度乙醇溶液（30%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）进行洗脱，15 min/次，洗脱完成后静置过夜，电镜扫描观察并拍摄。
1.3.8 测定方法
AFB1降解率的测定参考MAO J等[18]的方法并稍作修改，高效液相色谱法条件：色谱柱为YMC-Triart C18柱（5 μm，4.6 mm×15 cm）；流动相为甲醇∶水=70∶30（V/V）；流速0.7 mL/min；柱温30 ℃；进样量20 μL；检测器为紫外检测器；检测波长365 nm。AFB1降解率计算公式如下：
1.3.9 数据处理
试验结果采用Origin 9.6、SPSS 22.0软件对试验数据进行处理，每个处理组进行3次平行试验。
2 结果与分析
2.1 嗜盐四联球菌不同接种量对AFB1降解率的影响
由图1可知，嗜盐四联球菌接种量的变化对AFB1降解率有显著影响。当接种量为9%时，24 h后AFB1的降解率趋于稳定，72 h时达到了最大降解率81.65%，随着接种量的降低，AFB1的降解率明显降低；当接种量为1%时，菌株对AFB1仍具有较高的降解活性，72 h后AFB1降解率为70.11%。在浑浊红球菌PD630对AFB1的降解研究中，发现了类似的情况，随着接种量的增加，降解速率加快[19]。
图1 嗜盐四联球菌不同接种量对AFB1降解率的影响
Fig.1 Effect of different Tetragenococcus halophilus inoculum on AFB1 degradation rate
2.2 不同质量浓度AFB1对嗜盐四联球菌降解效果的影响
由图2可知，嗜盐四联球菌对不同质量浓度AFB1的降解率存在差异，但各组之间随时间变化的趋势基本一致。当AFB1质量浓度为4 μg/mL时，嗜盐四联球菌对AFB1降解率达到了最大值82.79%，随着AFB1质量浓度的升高降解率开始下降，当质量浓度增大至10 μg/mL时，降解率明显降低，其降解作用主要发生在24 h之后，最终（72 h）AFB1的降解率也随之降低至72.12%。说明在低质量浓度的AFB1中，降解作用是一个快速的过程，随着浓度的增加，降解过程明显变慢。在张铭[20]的研究中发现，短黄杆菌3J2MO对不同质量浓度的AFB1降解率存在明显差异，当AFB1质量浓度为1000ng/mL时，降解率明显降低。
图2 不同浓度AFB1对嗜盐四联球菌降解效果的影响
Fig.2 Effect of different concentrations of AFB1 on Tetraphylococcus halophila degradation rate
2.3 嗜盐四联球菌胞内液、菌悬液和上清液对黄曲霉毒素B1的降解率
由图3可知，嗜盐四联球菌无细胞上清液对AFB1的降解率明显高于胞内液和菌悬液。上清液与AFB1共培72 h后降解率为62.59%，结果表明菌株对AFB1的脱毒机制是降解作用而非吸附作用，且参与AFB1降解作用的活性成分主要存在于上清液中。类似的，宋茂鹏等[21]从红树林泥土中分离的假单胞菌Pseudomonas putida HAI2对AFB1具有较高的降解能力，且HAI2的无细胞上清液与AFB1共培24 h后降解率为71.52%。
图3 嗜盐四联球菌无细胞胞内液、菌悬液和上清液对AFB1降解率的影响
Fig.3 Effect of intracellular fluid acellular supernatant,and bacterial suspension of Tetragenococcus halophilus on AFB1 degradation rate
2.4 嗜盐四联球菌无细胞上清液及不同处理条件对黄曲霉毒素B1降解率的影响
为了确认菌株无细胞上清液对AFB1的作用，实验比较了不同变性处理后的上清液对AFB1的降解效果。由表1可知，嗜盐四联球菌上清液经蛋白酶K或SDS+蛋白酶K处理后AFB1的降解率均有下降，类似的在嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）[22]、红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）[23]、黄曲霉ANSM068（M.fulvus ANSM068）[24]、铜绿色假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[25]的研究中也观察到相似的情况，结果表明上清液中存在蛋白质或酶活性成分参与了AFB1的降解。加入金属螯合剂EDTA后，AFB1降解活性降低，说明上清液中的活性成分需要某些金属离子的辅助。其次上清液经加热（100 ℃）处理后，对AFB1的降解作用仍然存在，推测该活性物质具有一定的耐热性。
表1 嗜盐四联球菌上清液不同处理条件对AFB1降解率的影响
Table 1 Effect of different treatment conditions of Tetragenococcus halophilus supernatant on AFB1 degradation rate
2.5 金属离子对嗜盐四联球菌无细胞上清液降解黄曲霉毒素B1的影响
从2.4中得出，金属螯合剂EDTA的加入，使得上清液对AFB1的降解率明显降低，因此为了进一步研究上清液对AFB1的降解作用，实验使用了10种不同金属离子探究了上清液对AFB1降解率的影响，结果见图4。
图4 金属离子对嗜盐四联球菌上清液降解AFB1的影响
Fig.4 Effect of metal ions on degradation of AFB1 in supernatant of Tetragenococcus halophilus
由图4可知，Al3+、Ba2+、Mn2+和Ca2+都会抑制AFB1的降解，尤其是Ca2+的抑制作用最为明显，降解率下降至40.32%，反而Zn2+的加入AFB1的降解率提高到72.52%，可能是Zn2+的加入影响了上清液中活性成分的构型，进而提高了降解率。有研究发现，铜绿色假单胞菌N17-1培养上清液对AFB1的降解中，Cu2+可提高降解率，而Mg2+、Zn2+的加入抑制了降解作用[25]。
2.6 形态学观察
为了探究嗜盐四联球菌在黄曲霉毒素B1降解过程中的变化，对其微观结构，进行了观察结果见图5。由图5可知，实验组（嗜盐四联球菌+AFB1）与空白组（嗜盐四联球菌）在×600放大倍数下，各微观结构无明显差异，当放大倍数的增加至×13 000时，实验组细胞壁表面的褶皱明显转好。出现这种现象的原因可能是：a.嗜盐四联球菌对黄曲霉毒素B1环境产生了一定的适应能力；b.黄曲霉毒素B1被降解，推测AFB1与菌株细胞壁发生了结合作用[26]。
图5 AFB1对嗜盐四联球菌形态的影响
Fig.5 Effect of AFB1 on Tetragenococcus halophilus morphology
3 结论
本实验主要研究了嗜盐四联球菌对黄曲霉毒素B1的降解特性，结果证实菌株对AFB1具有较好的脱毒效果，嗜盐四联球菌接种量为1%，发酵72 h时对AFB1的降解率即可达到70.11%，通过测定生长曲线发现AFB1对菌株的生长无影响，通过比较菌株各组分对AFB1的脱毒效果，发现降解作用主要发生在上清液中，经EDTA、蛋白酶K、蛋白酶K+SDS及加热（100 ℃）处理后，降解率降低，说明参与降解作用的可能是蛋白或活性酶类物质，并且该活性成分具有良好的耐热性。在金属离子实验中，Ca2+的加入会抑制AFB1的降解，而Zn2+的加入提高了AFB1的降解率。此外，还观察了嗜盐四联球菌在有无AFB1毒素环境下的微观结构，经72 h培养后，菌体表面的褶皱转好。综上，嗜盐四联球菌对AFB1具有较好的降解性，为生物法对AFB1的降解提供了参考。
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