猕猴桃（Actinidia chinensis Planch.）又称奇异果，猕猴桃科猕猴桃属落叶藤本株，猕猴桃富含黄酮、酚类等多种营养物质成分，其维生素C含量较大部分水果高[1-2]。血橙全称为“塔罗科血橙”，原产于意大利，果实较大，目前在我国四川、重庆、湖南等地均有种植，其果面较光滑，色泽鲜艳带血红色、汁多为淡血红色、味浓[3]，果汁出汁率达69%左右，成熟果实含糖量一般为10%～14%，具备酿造果酒的优良条件。罗佳丽等[4]研究了两种酵母的发酵规律和血橙果酒的香气成分，并建立其酵母的发酵动力模型。付勋等[5-6]研究了血橙果酒发酵及调配工艺，主要研究了血橙果酒发酵工艺中酵母添加量、发酵温度、发酵时间等对果酒品质的影响，同时对果酒调配环节的含糖量、酸度及果汁添加量等进行优化。酵母在果酒发酵中的选择也是近年来研究的热点，如王玉霞等[7]为解决柑橘果酒香气滋味欠佳等不足，在柑橘分别添加不同用量苹果、猕猴桃果醪等，分析混合发酵果酒感官变化。谭玉岩等[8]研究了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）与非酿酒酵母混合发酵对果酒品质的影响。王家利等[9]以红树莓为原料，选取6种果酒酵母进行发酵，通过仪器测定和嗅闻感官综合判断，筛选出最佳的酵母品种。
主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析法（cluster analysis，CA）广泛应用于分析样品中的多个指标中起主要作用的指标，各指标的影响程度及正、负方向，样品分类等研究，彭邦远[10]等采用主成分分析法对刺梨汁的挥发性成分分析，得出刺梨汁中主要香气成分为酯类、烯烃类物质，同时聚类分析表明热处理样品其香气成分与原汁聚为一类；李明瑕等[11]利用主成分分析方法研究实验室制备黄桃果酒与多种醇和酯的相关性；李彩虹等[12]采用主成分分析法对宁夏贺兰山东麓不同品种，不同产区葡萄酒中矿物元素含量差异进行分析，实现葡萄酒的原产地判别。
本实验以猕猴桃、血橙为原料，添加8种商业果酒酵母发酵成果酒，通过顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术（headspace solid phase micro-extraction/gas chromatog raphy mass spectrometry，HS-SPME/GC-MS）检测发酵果酒中的风味物质，结合主成分与聚类分析，分析猕猴桃血橙果酒中主要风味物质及物质间相关性，不同酵母发酵果酒样品的差异性及相似度，以期为果酒样品的分类等提供一定理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
万州红心猕猴桃、血橙：重庆市万州区林发超市。
8种活性果酒干酵母（La-Ma、La-Ec、La-Ra、La-De、La-Ba、La-Fr、CR1、安琪果酒酵母）：烟台帝伯仕自酿有限公司；氯化钠（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；白砂糖（食品级）：佛山层层高食品有限公司；柠檬酸（分析纯）：天津市北辰方正试剂厂；果胶酶（30 000 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司。
1.2 仪器与设备
Thermo 1300气相色谱-质谱联用仪：美国Thermo Fisher公司；PAL System三合一进样器：瑞士CTC公司；75 μm CAR/PDMS/DVB萃取纤维头：美国SUPELCO公司；JSZZ-5L机器搅拌玻璃发酵罐系统：江苏中正生物工程设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 猕猴桃血橙果酒生产工艺流程及操作要点[5-6，13-15]
操作要点：
（1）前处理：血橙经破碎榨汁得到果汁，在果汁中添加焦亚硫酸钾试剂，使SO2含量为100 mg/L，再添加果胶酶（添加量0.09 g/L，31 ℃酶解120 min），经澄清处理得到澄清血橙果汁；猕猴桃经去皮打浆，在血橙汁中添加20 g/100 mL猕猴桃果浆，使用蔗糖调节初始发酵糖度至18.0%，柠檬酸调pH值至4.0。
（2）发酵：酵母（活性干酵母按照1∶10（g∶mL），加入5%的蔗糖水溶液，于30 ℃恒温活化30 min使用）按照0.12 g/L接种量接种发酵，各酵母发酵温度设置见表1，果酒在温控发酵罐中发酵至干性果酒（总糖含量＜5.0 g/L）。
表1 8种不同果酒酵母发酵特性
Table 1 Fermentation characteristics of 8 different fruit wine yeasts
（3）陈酿、澄清：主发酵结束后，分离上层果酒和酒泥，在果酒中添加藻土（添加量0.2 g/mL）使进一步澄清，陈酿、澄清阶段多次分离上层清酒直至得到澄清果酒。
1.3.2 风味物质的测定
HS-SPME条件：取混匀样品5 mL于20 mL顶空瓶中，加入饱和氯化钠，压盖，置于80 ℃水浴中平衡20 min，再将固相微萃取针扎进顶空瓶中，继续放入80 ℃水浴锅中水浴20 min，上机解吸5 min，进行GC-MS分析。
气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样量1 μL，载气流速1.0 mL/min，进样模式为不分流；程序升温条件为初始温度45 ℃保持4 min；以6 ℃/min升至130 ℃，保持6 min；再以10 ℃/min升至230 ℃，保持8 min；以15 ℃/min升至280 ℃，保持15 min。
质谱条件：电子电离源（electron ionization，EI），电子能量70 eV，传输线温度250 ℃，离子源温度230 ℃，四级杆温度180 ℃，溶剂切除时间2 min，质量扫描方式为全扫描，质量扫描范围30～500 m/z。
定性定量方法：根据全扫图中的母离子信息，利用Thermo美国国家标准技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）MS Search2.3本地数据库，进行物质鉴定，对样品中各组分进行定性分析；用峰面积归一化法分析各成分的相对含量。
1.3.3 数据处理与分析
采用SPSS 23.0 数据处理软件，对果酒风味物质进行主成分分析和样品聚类分析[19-25]。数据标准化后，以果酒中检测出的风味物质相对含量矩阵为数据，进行主成分分析，矩阵经旋转处理后，得到主成分的特征值和特征向量。以果酒风味物质累计贡献率达＞85%为标准，确定主成分个数以及各主成分中因子。根据主成分特征向量和方差贡献率得出果酒风味物质综合评价模型，计算出不同酵母发酵果酒所得果酒风味物质的综合评分；采用Origin Pro 2021软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 8种不同果酒酵母发酵猕猴桃血橙果酒中主要风味物质分析
将样品经过HS-SPME/GC-MS检测后，得到8种不同果酒酵母发酵猕猴桃血橙果酒样品的总离子流色谱图见图1。8种不同果酒酵母发酵猕猴桃血橙果酒的主要挥发性物质见表2。
图1 8种不同果酒酵母发酵猕猴桃血橙果酒风味物质GC-MS分析总离子流色谱图
Fig. 1 Total ion flow chromatogram of flavor compounds in kiwifruit and blood orange wine fermented by 8 different wine yeasts analyzed by GC-MS
由图1可知，本实验所采用的HS-SPME/GC-MS条件可以有效分离猕猴桃血橙果酒的挥发性成分。
由表2可知，8种不同果酒酵母发酵猕猴桃血橙果酒中共鉴定出34种主要风味物质，包括酯类、醇类、醛类、羧酸类及烯烃类风味物质。除乙醇外，其中相对含量较高的物质有正己酸乙酯（3.19%）、乙酸乙酯（0.87%）、2-甲基-1-丙醇（1.38%）、异戊醇（11.21%）、2-甲基-1-丁醇（3.06%）、辛酸（1.35%）等。果酒风味物质中，具有果香及芳香成分的物质主要有[26-33]乙酸乙酯（水果香味）、戊酸乙酯（苹果香气）、正己酸乙酯（强烈果香和酒香，苹果、香蕉、菠萝香气）、乙酸苯乙酯（玫瑰花香气）、3-苯丙酸乙酯（呈甜的水果和蜂蜜似花香香气）、棕榈酸乙酯（微弱蜡香、果爵和奶油香气）、3-羟基己酸乙酯（水果香气）、庚酸乙酯（酒香、白兰地样香气）、苯甲酸乙酯（稍有水果气味）、琥珀酸氢乙酯（有愉快气味）、辛酸乙酯（菠萝香味）、己酸2-苯乙酯（新鲜的水果菠萝样香气）、丙二酸二乙酯（微具芳香气味）、油酸乙酯（花果香气）、2,3-丁二醇（具有和谐、温和的玫瑰、蜂蜜样香气）、4-萜烯醇（暖的胡椒香、较淡的泥土香和陈腐的木材气息）、萜品醇（有清香似海桐花气息和紫丁香、铃兰的鲜幽香气）、正丙醇（有芳香气味）、广藿香醇（有较淡的广藿香香气）、苯丙醇（具有甜的花香香气和甜蜜饯香味，稀释后有清鲜愉快瓜果香）、乙缩醛（有芳香气味）、辛酸（略有不舒适的气味，稀释后呈水果香气）、己酸（有特殊臭气味）、（-）-柠檬烯（有类似柠檬或甜橙香味）。其中，戊酸乙酯、乙酸苯乙酯、琥珀酸氢乙酯、辛酸乙酯、异丙醇、4-萜烯醇、异植物醇、苯丙醇、乙缩醛、辛酸、（-）-柠檬烯等香气成分对果酒的风味贡献较大。
表2 8种不同果酒酵母发酵猕猴桃血橙果酒主要挥发性物质检测结果
Table 2 Determination results of main volatile compounds of kiwifruit and blood orange wine fermented by 8 different wine yeasts
续表
注：“-”表示未检出。
2.2 8种不同果酒酵母发酵猕猴桃血橙果酒中风味物质主成分分析
由表3可知，前7个主成分对应的特征值均＞1，累积方差贡献率为97.152%，故选取前7个主成分，可反映不同酵母发酵果酒中风味物质的大部分信息。
表3 8种不同果酒酵母发酵猕猴桃血橙果酒主成分方差贡献率
Table 3 Variance contribution rates of principal component of kiwifruit and blood orange wine fermented by 8 different wine yeasts
注：旋转方法为凯撒正态化最大方差法，旋转在13 次迭代后收敛。
由表4可知，第1主成分中载荷较高的果酒风味物质有戊酸乙酯、异丙醇、4-萜烯醇、乙缩醛、（-）-柠檬烯，载荷值均＞0.99，为高度正相关，即第1主成分大时，戊酸乙酯、异丙醇、4-萜烯醇、乙缩醛、（-）-柠檬烯含量越高，第1主成分公因子的方差贡献率最大为21.548%，说明第1主成分对果酒风味品质的影响最大；第2主成分中乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、辛酸的载荷值也均＞0.93，且有正向影响，第2主成分方差贡献率为19.510%；第3主成分中琥珀酸氢乙酯、异植物醇、苯丙醇含量的载荷值较大，呈正相关，载荷值分别为0.971、0.932、0.959，方差贡献率为16.790%；第4主成分中己酸2-苯乙酯、2,3-丁二醇、广藿香醇含量的载荷值也均＞0.9，呈正相关，方差贡献率为15.271%；第5主成分中只有正己酸乙酯含量的载荷值较高，载荷值为0.895，方差贡献率为10.729%；第6主成分中丙二酸二乙酯、油酸乙酯含量的载荷值较大，呈正相关，载荷值分别为0.958、0.958，方差贡献率为8.610%。
表4 8种不同果酒酵母发酵猕猴桃血橙果酒风味物质主成分旋转后载荷矩阵
Table 4 Principal component loading matrix after rotating of flavor compounds of kiwifruit and blood orange wine fermented by 8 different wine yeasts
由图2可知，不同果酒酵母发酵的猕猴桃血橙果酒样品区分效果较好，8种猕猴桃血橙果酒的数据点均位于95%置信区间内，且不同果酒样品位于不同区域。其中2#、3#、6#果酒样品分布于第1象限，2#、3#果酒样品在PC1上较接近，说明2#、3#果酒样品聚集较好，含有的风味物质组成和含量相近；7#、8#及4#果酒样品分别位于第3和4象限，而6#、7#、8#果酒样品在PC2上较接近，4#果酒样品PC2得分接近0，主要位于PC1负半轴，说明其分布特征主要受主成分2影响，因此6#、7#、8#果酒相对聚集较好，1#和5#果酒样品远离其他果酒样品分布在第2和3象限，说明其风味物质组成和含量差异较大。
图2 8种不同果酒酵母发酵猕猴桃血橙果酒的主成分分析得分
Fig. 2 Principal component analysis score of kiwifruit and blood orange wine fermented by 8 different wine yeasts
2.3 不同类型果酒风味物质的综合评判
从表3可知，当提取7个主成分时可解释的累计方差达到97.152%，因此选用前7个主成分已经足够描述果酒种风味物质的总体水平。以34种风味物质为初始自变量，经主成分分析，最终得出7个主成分因子的方程表达式如下：
Z1～Z7分别代表第1～第7主成分的特征向量权重值。
7个表达式中，X1为乙酸乙酯、戊酸乙酯、正己酸乙酯、乙酸苯乙酯……醋酸、辛酸、己酸、（-）-柠檬烯风味物质的相对含量，由方差贡献率和主成分函数表达式可求综合评价函数得：F=0.215Z1+0.195Z2+0.168Z3+0.153Z4+0.107Z5+0.086Z6+0.047Z7。
根据主成分综合评价函数值可知，8种不同果酒酵母发酵猕猴桃血橙果酒的综合得分和排序结果见表5。由表5可知，综合得分排在第1、第2位的样品是CR1和La-Ba酵母发酵的猕猴桃血橙果酒。
表5 8种不同果酒酵母发酵猕猴桃血橙果酒主成分分析综合得分和排序
Table 5 Comprehensive scores and ranking of principal component analysis of kiwifruit and blood orange wine fermented by 8 different wine yeasts
2.4 8种不同果酒酵母发酵猕猴桃血橙果酒样品聚类分析
对8种不同果酒酵母发酵猕猴桃血橙果酒样品进行聚类分析，结果见图3。
图3 8种不同果酒酵母发酵猕猴桃血橙果酒风味物质聚类分析热图
Fig. 3 Heat map of cluster analysis of flavor compounds in kiwifruit and blood orange wine fermented by 8 different wine yeasts
由图3可知，1#果酒样品独立聚为第一类，第二类聚集了其余7个果酒样品，7个样品中，4#、6#、7#果酒样品先聚集为一类，再与2#、3#果酒样品聚类为一类，最后与5#果酒样品聚集为一大类。与主成分分析比较，1#和5#果酒样品远离其他6个果酒样品，2#和3#果酒样品接近，4#、6#和7#果酒样品较集中，因此，聚类结果与主成分分析结果基本一致。由图3亦可知，果酒风味物质主要聚集为四类，第一类聚集了乙酸乙酯、己酸2-苯乙酯、广藿香醇、2,3-丁二醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇和乙醛；第二类聚集了戊酸乙酯、异丙醇、（-）-柠檬烯、4-萜烯醇、乙缩醛、萜品醇、苯甲酸乙酯、琥珀酸氢乙酯、异植物醇、苯丙醇、醋酸、庚酸乙酯、乙醇、正己酸乙酯、正丙醇、己酸；第三类聚集了乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、甲氧乙酸、辛酸、丁二酸二乙酯、3-苯丙酸乙酯、3-羟基己酸乙酯；第四类聚集了棕榈酸乙酯、丙二酸二乙酯、油酸乙酯；这四大类各风味物质能先聚集在一起，说明他们之间具有较强相关性，其中广藿香醇、戊酸乙酯、异丙醇、（-）-柠檬烯、4-萜烯醇、乙缩醛、庚酸乙酯、己酸、辛酸、异植物醇、苯丙醇、油酸乙酯等风味物质是影响果酒的主要风味物质，该结果与主成分分析结果较一致。
3 结论
对8种果酒的风味物质检测分析，共检测出34种风味物质，包括酯类、醇类、羧酸等主要风味物质，其中主要风味物质为戊酸乙酯、乙酸苯乙酯、琥珀酸氢乙酯、辛酸乙酯、异丙醇、4-萜烯醇、异植物醇、苯丙醇、乙缩醛、辛酸、（-）-柠檬烯等。对8种果酒风味物质进行主成分分析，可分为7个主成分，第1主成分中戊酸乙酯、异丙醇、4-萜烯醇、乙缩醛、（-）-柠檬烯为高度正相关；第2主成分中乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、辛酸有较大正向影响；第3主成分中琥珀酸氢乙酯、异植物醇、苯丙醇含量的载荷值较大；第4主成分中己酸2-苯乙酯、2,3-丁二醇、广藿香醇含量呈正相关；第5主成分中只有正己酸乙酯含量的载荷值较高；第6主成分中丙二酸二乙酯、油酸乙酯呈正相关；第7个主成分中庚酸乙酯呈正相关。
对果酒样品进行聚类分析，La-Ma酵母发酵果酒独立聚为第一类，第二类聚集了La-Ec、La-Ra、La-De、La-Ba、La-Fr、CR1和安琪果酒酵母发酵的7个果酒样品，第二类中，La-Ec和La-Ra果酒样品较集中，La-De、La-Fr和CR1果酒样品较集中，该聚类结果与主成分分析样品分类结果基本一致。
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