枳椇（Hovenia acerba Lindl.）为鼠李科拐枣属落叶乔木[1]，始载于《唐本草》，别名拐枣、龙爪、鸡爪梨、万寿果、木蜜、木珊瑚、金钩子[1-2]等，兼具食用与药用价值，被国家卫计委列入食药两用中药名单。枳椇的果梗成熟后，具有浓郁的香甜味和枳椇独特的果香，口感柔和饱满，汁液浓厚甜蜜。枳椇成熟的肉质果梗中含有丰富的营养成分和生理活性物质，主要包括枳椇皂苷[3]、生物碱-黑麦草碱[4-5]、脂肪酸、葡萄糖、粗蛋白、维生素C、微量元素[6-8]及多种活性黄酮类物质[9-11]。枳椇具有多种药用功效，如解酒利尿[8]、防止酒精对肝脏的损伤[12-13]和抗肝纤维化[14]、抑制肿瘤细胞生长[15]、抗疲劳[16]、抑制食欲和减肥降脂[17-18]、治疗肾结石[19]等，同时花梗中充分的多糖与黄酮赋予其良好的抗氧化能力[20]。
目前对枳椇有一些研究报道。黎继烈等[21-22]分析了枳椇果梗的营养成分，并以其为原料酿制果酒，探讨了的果酒酿造工艺，分析了果酒品质及经济效益。市场上与枳椇有关的酒类产品主要是枳椇发酵酒、蒸馏酒、配制酒3个类型[23]，但对枳椇果酒的酿造工艺相关文献报道较少。本研究以枳椇为原料酿制枳椇果酒，通过跟踪监测发酵后酒精度、酸度、糖度、总黄酮含量和感官评价等指标来确定最佳发酵工艺参数，为枳椇果酒的产业化生产提供技术参考，为我国枳椇产业健康发展提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
枳椇（Hovenia acerba）：陕西秦岭；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W33、果胶酶（酶活为20 000 U）、酵母营养剂：法国LAFFORT公司；偏重亚硫酸钾（分析纯）：法国LAMOTHE-ABIET公司；蔗糖、皂土、硅藻土、壳聚糖（均为食用级）：郑州万博食品配料有限公司；芦丁（纯度＞98%）：合肥博美生化科技有限责任公司；无水乙醇、三氯化铝、醋酸钾（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
722N可见分光光度计、YP5001电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；DGX-9073B-2鼓风干燥机：上海福玛实验设备有限公司；DZKW-4电子恒温水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司；PHS-3CpH计：杭州齐威仪器有限公司；PAL-1手持糖度计：成都格纳丝商贸有限公司；PAL-36S酒精度计：杭州陆恒生物科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 枳椇果酒加工工艺流程及操作要点
枳椇→挑选、清洗→60 ℃烘干→粉碎、打浆→接种酵母→主发酵→酒渣分离→后发酵澄清→贮藏→成品
操作要点：
枳椇预处理：取果柄肥硕，无霉变损坏的成熟果实，多次清洗后60 ℃条件下干燥12 h。
粉碎打浆：将预处理后的枳椇进行粉碎，经40目筛过筛。取枳椇粉末50 g到锥形瓶中，按料液比1∶8（g∶mL）加入纯水。同时加入100 mg/L偏重亚硫酸钾，0.04%的果胶酶，18%的蔗糖，50 mg/L酵母营养剂，用柠檬酸调pH值为5.5。
接种酵母：取2 g酿酒酵母W33倒入20 mL含5%蔗糖的37 ℃温水中，充分搅拌后，活化20 min。添加0.20%的活化酵母液。
主发酵：主发酵时间为10 d，发酵温度为28 ℃，定时振荡摇匀与排气，待pH和糖度趋于稳定时，结束发酵。
酒渣分离：用100 目筛过滤。
后发酵澄清：向滤液中加入复合澄清剂：皂土6 g/L，硅藻土0.1 g/L，壳聚糖0.4 g/L，室温下澄清2 d。经100目的筛过滤后真空泵抽滤，在9 ℃静置2 d，取300 mL上清液。
贮藏：澄清后枳椇果酒于9 ℃条件下贮藏，得到枳椇果酒成品。
1.3.2 枳椇果酒的感官品评标准
枳椇果酒感官品评标准依据国家标准GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[24]，组织20人，其中20～30岁10人，30～40岁10人，男女各占一半，含两位国家一级品酒师。对枳椇果酒从色泽、香气、口感、澄清度4个方面进行综合感官评分，满分100分，感官评分取20人的平均值。
表1 枳椇果酒感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of Hovenia acerba fruit wine
续表
1.3.3 分析检测
酒精度测定：酒精计；可溶性固形物：手持糖度计；pH值：pH计；酸度的测定：指示剂法[24]。
总黄酮含量的测定采用分光光度法[25]。芦丁标准曲线的绘制：称取芦丁对照品10.00 mg，加入体积分数为95%乙醇定容至100 mL，吸取20.00 mL于另一100 mL容量瓶中，加入体积分数95%乙醇稀释至刻度线，即得20 mg/L芦丁标准品溶液。取芦丁标准品溶液0 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL于50 mL玻璃比色管中，先后加入2.00 mL 2.50 g/100 mL三氯化铝溶液和2.00 mL 9.82 g/100 mL醋酸钾溶液，加20%乙醇溶液稀释至刻度线，摇匀，设置样品空白对照。在波长415 nm处测定其OD415nm值（吸光度值），平行测定3次，取平均值。以芦丁质量浓度（x）为横坐标、吸光度值（y）为纵坐标绘制芦丁标准曲线。按照标准曲线回归方程计算枳椇果酒中总黄酮含量。
1.3.4 枳椇果酒发酵工艺优化
单因素试验设计：以酒精度、感官评价为主要评价指标，总黄酮含量、酸度、糖度为辅助评价指标。分别考察主发酵温度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）；酵母添加量（0.08%、0.14%、0.20%、0.26%、0.32%）；蔗糖添加量（14%、16%、18%、20%、22%）；SO2添加量（30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L）对结果的影响。
正交试验设计：根据单因素试验结果，以感官评价、酒精度和总黄酮含量为评价指标，采用L9（33）正交试验设计，优化枳椇果酒发酵工艺。正交试验因素与水平见表2。
表2 枳椇果酒发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for Hovenia acerba fruit wine fermentation technology optimization
2 结果与分析
2.1 芦丁标准曲线的建立
以芦丁质量浓度（x）为横坐标、吸光度值（y）为纵坐标绘制芦丁标准曲线，结果见图1。由图1可知，标准曲线回归方程为y=0.011 9x+0.004 3，相关系数R2为0.999 3。结果表明，芦丁标准品质量浓度在0～20 mg/mL范围内与吸光度值呈现良好的线性关系。
图1 芦丁标准曲线
Fig. 1 Standard curve of rutin
2.2 发酵工艺优化单因素试验
2.2.1 主发酵温度对枳椇果酒品质的影响
不同主发酵温度对枳椇果酒感官品质的影响见表3。由表3可知，当发酵温度在24～28 ℃范围内的升高，感官评分随之增高；当主发酵温度为28 ℃时，感官评分最高为87.67分；当发酵温度高于28 ℃之后，感官评分随之下降。其原因可能是温度过高，酵母代谢旺盛，代谢产物生成过多，影响酒的质量[26]。
表3 不同主发酵温度对枳椇果酒感官品质的影响
Table 3 Effect of different main fermentation temperature on sensory quality of Hovenia acerba fruit wine
不同主发酵温度对枳椇果酒理化指标的影响见图2。由图2可知，随主发酵温度的升高，果酒的酒精度、酸度呈上升趋势，而糖度呈下降趋势，可能是酵母过量的生殖作用和代谢作用，消耗了糖，分解出酒精和酸类物质。当主发酵温度为32 ℃，酒精度最高为16.23%vol，酸度最高为4.83 g/L，糖度最低为6.50°Bx；随着主发酵温度的升高，果酒的总黄酮含量呈先上升后下降的趋势，当主发酵温度为28 ℃，总黄酮含量达到最大为998.27 μg/mL。
图2 不同主发酵温度对枳椇果酒理化指标的影响
Fig. 2 Effect of different main fermentation temperature on physicochemical indexes of Hovenia acerba fruit wine
综上，选择主发酵温度28 ℃为宜。
2.2.2 酵母添加量对枳椇果酒品质的影响
不同酵母添加量对枳椇果酒感官品质的影响见表4。由表4可知，当酵母添加量在0.08%～0.20%范围内增加，感官评分随之增高；当酵母添加量为0.20%，感官评分最高为84.33分；当酵母添加量＞0.20%之后，感官评分随之下降，可能是发酵的代谢产物增加，覆盖枳椇原有的风味。
表4 不同酵母添加量对枳椇果酒感官品质的影响
Table 4 Effect of different yeast addition on sensory quality of Hovenia acerba fruit wine
不同酵母添加量对枳椇果酒理化指标的影响见图3。由图3可知，随酵母添加量的增加，果酒的酒精度呈缓慢上升趋势，酸度呈下降趋势，当酵母添加量为0.32%，酒精度最高为14.57%vol，酸度最低为5.43 g/L。随着酵母添加量的增加，果酒的总黄酮含量、糖度呈先上升后下降的趋势，当酵母添加量为0.26%，总黄酮含量达到最大为1 002.94 μg/mL；酵母添加量为0.20%，果酒的糖度最高为8.70°Bx。
图3 不同酵母添加量对枳椇果酒理化指标的影响
Fig. 3 Effect of different yeast addition on physicochemical indexes of Hovenia acerba fruit wine
综上，选择酵母添加量0.20%为宜。
2.2.3 蔗糖添加量对枳椇果酒品质的影响
不同蔗糖添加量对枳椇果酒感官品质的影响见表5。由表5可知，随蔗糖添加量在14%～18%范围内的增加，感官评分随之增加；当蔗糖添加量为18%时，感官评分最高为85.67分；当蔗糖添加量≥22%之后，其酒液甜度就会掩盖其酒味儿，色泽不够透亮。
表5 不同蔗糖添加量对枳椇果酒感官品质的影响
Table 5 Effect of different sucrose addition on sensory quality of Hovenia acerba fruit wine
不同蔗糖添加量对枳椇果酒理化指标的影响见图4。由图4可知，随蔗糖添加量的增加，果酒的酒精度、酸度、糖度呈上升趋势，当蔗糖添加量为22%，酒精度最高为17.07%vol，糖度最高为12.50°Bx，酸度最高为4.54 g/L，糖度最高为12.50°Bx。随着蔗糖添加量的增加，果酒的总黄酮含量呈先上升后下降的趋势，当蔗糖添加量为20%，总黄酮含量达到最大为896.50 μg/mL。
图4 不同蔗糖添加量对枳椇果酒理化指标的影响
Fig. 4 Effect of different sucrose addition on physicochemical indexes of Hovenia acerba fruit wine
综上，选择蔗糖添加量18%为宜。
2.2.4 SO2添加量对枳椇果酒品质的影响
不同SO2添加量对枳椇果酒感官品质的影响见表6。由表6可知，当SO2添加量在30～50 mg/L范围内的增加，感官评分随之增加；当SO2添加量50 mg/L时，枳椇果酒感官评分最高为84分；当SO2添加量＞50 mg/L之后，酒体会有酸味，协调性较差。
表6 不同SO2添加量对枳椇果酒感官品质的影响
Table 6 Effect of different SO2 addition on sensory quality of Hovenia acerba fruit wine
不同SO2添加量对枳椇果酒理化指标的影响见图5。由图5可知，随SO2添加量的增加，果酒的酒精度、酸度、糖度呈上升趋势，当SO2添加量为70 mg/L，酒精度最高为14.33%vol，酸度最高为4.12 g/L，糖度最高为10.77°Bx。随着SO2添加量的增加，果酒的总黄酮含量呈先上升后下降的趋势，当SO2添加量为50 mg/L时，总黄酮含量达到最大为916.11 μg/mL。SO2的主要作用在于抑制杂菌生长以及抗氧化[27]，但当铜含量、SO2含量较高的情况下容易发生铜破败。由于后发酵时期还会添加少量用于终止发酵，因此SO2用量不宜过高[28]。
图5 不同SO2添加量对枳椇果酒理化指标的影响
Fig. 5 Effect of different SO2 addition on physicochemical indexes of Hovenia acerba fruit wine
综上，选择SO2添加量50 mg/L为宜。
2.3 发酵工艺优化正交试验
根据单因素试验结果，固定SO2添加量为50 mg/L，以主发酵温度（A）、酵母添加量（B）、蔗糖添加量（C）为3个因素进行3因素3水平正交试验，正交试验结果与分析见表7，方差分析结果见表8～表10。
表7 枳椇果酒发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 7 Results and analysis of orthogonal experiments for Hovenia acerba fruit wine fermentation technology optimization
表8 以酒精度为评价指标的正交试验结果方差分析
Table 8 Variance analysis of orthogonal experiments results using alcohol content as evaluation index
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。下同。
表9 以感官评价为评价指标的正交试验结果方差分析
Table 9 Variance analysis of orthogonal experiments results using sensory evaluation as evaluation index
表10 以总黄酮含量为评价指标的正交试验结果方差分析
Table 10 Variance analysis of orthogonal experiments results using total flavone content as evaluation index
由表7可知，以酒精度为评价指标，根据极差大小结果可知，各因素对枳椇果酒酒精度影响的次序为A（主发酵温度）＞C（蔗糖添加量）＞B（酵母添加量），最优发酵工艺组合是A3B1C3。此优化条件下，酒精度最高为16.80%vol。
以感官评分为评价指标，各因素对枳椇果酒感官评分影响的次序为A（主发酵温度）＞C（蔗糖添加量）＞B（酵母添加量），最优发酵工艺组合是A2B1C2。此优化条件下，感官评分最高为92分。
以总黄酮含量为评价指标，各因素对枳椇果酒黄酮含量影响的次序为A（主发酵温度）＞B（酵母添加量）＞C（酵母添加量），最优发酵工艺组合是A2B3C1。此优化条件下，总黄酮含量最高为1 123.39 μg/mL。
由表8可知，主发酵温度、蔗糖添加量对枳椇酒酒精度皆有显著影响（P＜0.05），而酵母添加量对枳椇酒酒精度的影响未达到显著水平（P＞0.05）。
由表9可知，主发酵温度、蔗糖添加量对枳椇酒酒精度皆有显著影响（P＜0.05），而酵母用量对枳椇酒酒精度的影响未达到显著水平（P＞0.05）。
由表10可知，主发酵温度、蔗糖添加量、酵母添加量对枳椇酒总黄酮含量的影响未达到显著水平（P＞0.05）。
根据方差分析可知，酒精度和感官评价中的主发酵温度和蔗糖用量对试验结果影响显著，且温度影响程度大于蔗糖用量。前期试验发现，酒精度较高的样品，其口感偏酸且感官评价偏低。综合考虑，选择最佳发酵工艺条件为感官评分最高的发酵工艺条件组合A2B1C2，即主发酵温度28 ℃，酵母添加量0.14%，蔗糖添加量18%。该优化条件下，枳椇果酒酒味协调，酒味醇厚，果香浓郁，酸甜适口。
3 结论
以酒精度、感官评价为主要评价指标，总黄酮含量、酸度、糖度为辅助评价指标，通过单因素试验和正交试验，得到了枳椇果酒发酵最佳工艺条件为：主发酵温度28 ℃、酵母添加量0.14%、蔗糖添加量18%。在此优化发酵工艺条件下，枳椇果酒酒精度为13.7%vol，感官评分为92分，总黄酮含量为0.85 mg/mL，酸度为3.4 g/L，糖度为8°Bx，枳椇果酒色泽透亮，呈琥珀色。通过对枳椇果酒发酵条件的探索与优化，为枳椇果酒的研究和生产提供一定的理论基础。
[1]王玲.枳椇子加工及功能特性研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2010.
[2]潘超美.中国民间生草药原色图谱[M].广州：广东科技出版社，2015：14.
[3]何荣军，孙江亭，吴石金，等.枳椇果实活性成分的研究进展[J].发酵科技通讯，2020，49（2）：100-105.
[4]HE Y,YAN H,CHEN D,et al.Optimization of total alkaloids extraction from the leaves of Hovenia acerba Lindl.by response surface methodology[J].J Biobased Mater Bioenerg,2016,10(4):296-301.
[5]兰光，裴颖，钟宝.枳椇果梗中总生物碱的提取工艺研究[J].东西南北，2019，536（12）：198-199.
[6]王彦平，袁贵英，陈月英，等.枳椇子营养成分和总黄酮含量分析及评价[J].食品研究与开发，2016，37（24）：21-24.
[7]陆石英，覃志高.药食两用枳椇的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2020，11（6）：1865-1870.
[8] HAN P,DENG Z,XUAN C,et al.Major chemical constituents and antioxidant activities of different extracts from the peduncles of Hovenia acerba Lindl[J].Int J Food Prop,2018,21(1):2135-2155.
[9]杨航，裴颖，孙莉佳，等.枳椇不同部位总黄酮含量比较及其总黄酮提取工艺研究[J].保鲜与加工，2017，17（4）：72-76.
[10]WANG M C,ZHU P L,JIANG C X,et al.Preliminary characterization,antioxidant activity in vitro and hepatoprotective effect on acute alcoholinduced liver injury in mice of polysaccharides from the peduncles of Hovenia dulcis[J].Food Chem Toxicol,2012,50(9):2964-2970.
[11]梁金强，陶施民，余庆涛，等.葛根枳椇子栀子提取物对大鼠酒精性脂肪肝的作用研究[J].药物评价研究，2018，41（11）：1981-1988.
[12]王楠，杜双奎，冯宪超，等.枳椇乳酸菌发酵饮料对小鼠酒精肝损伤的保护作用[J].现代食品科技，2016，32（8）：28-33，41.
[13]SONG S S,WEI H E,YUAN P F,et al.The protective effects of Hovenla acerba Lindl on ethanol-induced liver injury in mice[C]//Acta Pharmacologica Sinica (volume 34):Editorial Office of Acta Pharmacologica Sinica Nature Publishing Group,2013.
[14]宋娟，张洪，黄徐英.枳椇子对肝纤维化大鼠脂质过氧化的动态影响[J].山东医药，2006，46（14）：24-26.
[15]张奇，刘英，胡海峰，等.枳椇子乙酸乙酯部位抗肿瘤活性成分筛选[J].中国现代中药，2019，21（6）：782-785.
[16]郑悦，嵇扬.枳椇子提取物对大鼠抗疲劳作用的比较[J].解放军药学学报，2012，28（2）：141-144.
[17]嵇扬，王文俊，张癸荣，等.枳椇正丁醇提取物对大鼠食欲抑制作用的实验研究[J].中医药学刊，2003，21（11）：1896-1913.
[18]杜双奎，赵晓野，李志西.枳椇醋解酒护肝、减肥降脂作用研究[J].食品科学，2012，33（1）：235-238.
[19]任群利，林冰，周英，等.枳椇皮提取物对肾结石大鼠的治疗作用[J].中国现代医学杂志，2017，27（14）：24-27.
[20]向进乐，李志西，李欢，等.枳椇果梗不同极性多酚及抗氧化活性研究[J].食品科学，2011，32（15）：25-29.
[21]黎继烈，陈永安，易经纶.枳椇果梗酿制果酒的工艺研究[J].湖南林业科技，1996，23（1）：71-74.
[22]黎继烈.枳椇果梗酿制果酒的工艺研究[J].食品与发酵工业，2002，28（12）：71-73.
[23]马彬荣，李本娇，李松，等.拐枣酒制品开发现状及对策探讨[J].南方农业，2018，12（28）：128-130.
[24]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 15038—2006葡萄酒、果酒通用分析方法[S].北京：中国标准出版社，2006.
[25]白姗姗，张莹莹，赵强，等.啤酒花废弃枝叶多酚、黄酮含量与抗氧化活性的相关性分析[J].食品科学，2018，39（3）：41-48.
[26]叶倩雯，刘长海，廖堪义.青梅酒发酵工艺的研究[J].食品与发酵科技，2014，50（3）：60-65.
[27]祝霞，刘琦，赵丹丹，等.干白葡萄酒增香酿造工艺参数优化[J].农业工程学报，2019，35（18）：282-291.
[28]李东，左勇，祁峰，等.桑椹果酒稳定性研究[J].江苏农业科学，2015，43（3）：253-255.