果酒是一种以新鲜水果为原料，经过打浆取汁、调节糖度、酸度等工艺，采用酵母菌为菌种发酵，制备的一种具有低酒精度、一定果香味及丰富营养物质的酒品[1]。将新鲜水果制成的果酒，富含人体所需的有机酸、酯类等成分，不仅保留了原有的营养物质，而且还能让水果中的营养物质更好地被人体吸收，果酒中丰富的多酚类物质可以强化人体血管壁、促进肠胃消化。同时果酒中的酒精含量比白酒等要低，能调节人体新陈代谢、改善心脑血管功能，控制体内胆固醇平衡等功能[2]。
龙眼（Dimocarpus longan Lour.），别名桂圆，是华南地区种植和加工的大宗水果之一，产量占全国总产量的60%～70%。其果肉为白色，含糖量可达18%以上，富含人体所需的膳食纤维、各类维生素（如维生素B1、维生素C等）、多糖等物质，同时具有清除自由基[3]、降低血糖[4]、调节免疫系统[5]、抗癌及促进智力发育等功效[6]，营养成分极高，味道香甜爽口，深受广大民众的喜爱。目前龙眼主要以鲜果销售，但龙眼产量大且采摘期集中，造成供大于求的市场局面。虽然有少部分龙眼被加工成龙眼干、龙眼膏、龙眼罐头等产品并销售，仍有部分龙眼无法得到合理利用，给果农造成很大的经济损失。若将龙眼加工成既有保健功效又能将龙眼果香最大限度保留的龙眼果酒，不但可以因减少龙眼产量大造成的销售压力，更能避免“果贱伤农”现象的出现，而且还能大幅度提高龙眼的附加值、完善龙眼产业结构、进而推动龙眼产业的发展。
目前有关龙眼果酒的加工工艺及抗氧化活性有一些研究报道。刘冬梅等[7-8]选取不同的发酵菌株进行单因素和正交试验，优化龙眼果酒的加工工艺，获得最佳制备工艺条件。罗汝锋等[9-10]等选取酒精度、总酚转化量等为评价指标，进行单因素和响应面试验优化酿造工艺，确定酿造工艺条件。罗汝锋等[9]在优化酿造工艺的基础上测定了果酒的总酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基清除能力，评定了果酒的抗氧化性。邱松山等[11]采用气质联用技术测定了龙眼果酒的香气成分及相对含量。这些研究为龙眼果酒的生产、品质评价、保健机制等方面提供了科学依据，但与浸泡龙眼果酒的对比研究较少，且未能形成产业化生产。
在前期研究的基础上，本试验以龙眼为原材料，通过接种酵母发酵制备龙眼果酒，以酒精度、感官评价为评价指标，分别探讨酵母接种量、初始糖度、初始pH、发酵温度等因素对龙眼果酒的品质影响，采用单因素试验及正交试验优化发酵工艺条件，并对龙眼果酒的感官、理化指标、抗氧化性成分、香气成分等指标进行分析检测，以期为龙眼果酒的产业化生产提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
龙眼（石硖龙眼）：产地广西北流；安琪葡萄酒用高活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；食用酒精：郑州鑫河阳酒精有限公司；维生素C：河南圣斯德实业有限公司；香草醛、偏磷酸：天津市光复精细化工研究所；没食子酸、壳聚糖：国药集团化学试剂有限公司；白砂糖：太古糖业有限公司；无水柠檬酸：山东潍坊英轩实业有限公司；碳酸钠：南京甘汁园糖业有限公司；DPPH：上海源叶生物科技有限公司；水杨酸、酒石酸钾钠：无锡市亚泰联合化工有限公司；邻苯三酚：河北陌槿生物科技有限公司；磷酸二氢钾、邻苯二甲酸氢钾：成都市科龙化工试剂厂；磷酸氢二钠：成都金裕生物科技有限公司；无水硫酸钠：西陇科学股份有限公司。试验所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
ATY224EXP型电子分析天平：日本SHIMADZU公司；STARTER 2100/3C Pro-FpH计：宁波衡欣科技股份有限公司；JYL-C19V型打浆机：九阳股份有限公司；LH-32型手持糖度计：杭州陆恒生物科技有限公司；DA-130N手持酒精计：内蒙古曼德拉生物科技有限公司；Cary5000紫外光谱仪、7000D气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）：安捷伦科技（中国）有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；KQ-500DE超声清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；WYA-2S自动阿贝折光仪：上海仪电物理光学仪器有限公司；ZNCL-5D型多点磁力搅拌器：河南爱博特科技发展有限公司；722sp型可见分光光度计：上海光学仪器五厂。
1.3 方法
1.3.1 发酵型龙眼果酒加工工艺流程及操作要点[12]
新鲜龙眼→清洗、剥壳→打浆取汁→过滤→调整糖度、pH→添加酵母→发酵→过滤→陈酿→过滤→装瓶→成品
操作要点：龙眼果实用自来水冲洗干净；用榨汁机将龙眼肉打碎取汁，并用200目滤网过滤果汁，调整果汁糖度、pH；向果汁中接种0.25 g/L已活化（5 g干酵母加入100 mL 38 ℃龙眼果汁中，搅拌溶解，保温20 min后冷却至室温25 ℃）的安琪葡萄酒用高活性干酵母；发酵期用煮沸的蒸馏水液封发酵罐口，设置发酵温度，发酵时间为7 d；发酵完成时（发酵液中糖度和酒精度基本保持不变），通过500目的滤网过滤得到龙眼果酒原酒，将原酒转移到特制的瓶子中，并将龙眼果原酒进行陈酿（5 ℃、30 d），陈酿结束后用两层500目的滤网过滤、沉淀，得到发酵型龙眼果酒成品。
1.3.2 浸泡型龙眼果酒工艺流程及操作要点[13]
新鲜龙眼→挑选、除杂→清洗→剥壳去核→浸泡→过滤→成品
操作要点：将龙眼洗净、剥壳、去核后，把龙眼果肉加入酒基中进行浸泡，浸泡龙眼酒选用乙醇体积分数为95%的食用酒精。将食用酒精用纯净水稀释至35%左右，把龙眼和食用酒精（乙醇体积分数35%）按照料液比1∶5（g∶mL）混合，放进干净的容器，用保鲜膜封紧盖上盖，把容器放入阴凉处避光（25 ℃）密封保存7 d，得到浸泡型龙眼果酒成品。
1.3.3 龙眼果酒发酵工艺优化
（1）单因素试验
分别考察初始糖度（20%、22%、24%、26%、28%）、初始pH值（5.0、5.8、6.6、7.4、8.0）、酵母接种量（0.15 g/L、0.20 g/L、0.25 g/L、0.27 g/L、0.30 g/L）、发酵温度（21 ℃、23 ℃、25 ℃、27 ℃、30 ℃）等因素对龙眼果酒发酵酒精度和感官评价的影响。
（2）正交试验
在单因素试验基础上，以酒精度和感官评价为评价指标，以初始糖度（A）、酵母接种量（B）、初始pH值（C）、发酵温度（D）等4个因素，安排L9（34）正交试验设计，优化发酵型龙眼果酒发酵工艺条件，正交试验设计因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization
1.3.4 分析检测
酒精度、总糖、总酸含量测定：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；维生素C含量测定：紫外分光光度法[14]；多酚含量测定：紫外可见分光光度法[15]；超氧阴离子自由基、羟基自由基及DPPH自由基清除率测定：参照苏龙等[16]的方法。
1.3.5 香气成分测定方法
龙眼果酒香气成分测定参考文献[17]的方法进行。
风味物质提取：取20 mL龙眼果酒于100 mL具塞锥形瓶中，加40 mL二氯甲烷混匀，加盖密封。用磁力搅拌器以500 r/min的转速搅拌1 h，25 ℃条件下超声15 min，用梨形分液漏斗分离有机层和水层，并收集有机相。称量5 g无水Na2SO4加入有机相干燥、抽滤，用旋转蒸发仪浓缩滤液至2 mL，样品于4 ℃冷藏供GC-MS上机分析。样品平行处理3次，做重复性试验。
GC条件：DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 μm×0.25 mm），进样口温度为240 ℃，载气为高纯氦气（He），流速为1.83 mL/min，检测器温度为35 ℃。柱温采用程序升温方式：35 ℃保持3 min，以10 ℃/min升至115 ℃，保持3 min，然后以5℃/min升至235℃，保持10min。不分流进样，进样量为1.0μL。
MS条件：电子电离（electronic ionization，EI）源；离子源温度为200 ℃；电子能量为70 eV；接口温度为250 ℃；扫描范围为45～450 m/z。
定性定量方法：用美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）02.L质谱数据库自带的谱库检索，确定其化学式，再通过资料分析、结合有关文献进行人工谱图解析，确认各种香气成分。采用面积归一法对各风味物质进行定量分析。
1.3.6 感官评价
感官评价法[18]结合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，由数位具有相关经验的老师和学生组成品酒小组，对龙眼果酒的香气、滋味、外观、典型性进行综合评价，满分100分，取平均分作为最终评分结果。龙眼果酒感官评分标准见表2。
表2 龙眼果酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of longan fruit wine
续表
1.3.7 数据处理
每组做3个平行样品检测结果，试验中独立样本t检验（显著性检验为t检验）采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析处理。
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 初始糖度对龙眼果酒品质的影响
初始糖度对龙眼果酒品质的影响见图1。由图1可知，随着初始糖度在20%～24%范围内的增加，龙眼果酒中感官评分、酒精度随之升高；当初始糖度为24%时，龙眼果酒的感官评分最高为86分，酒精度为11.9%vol；糖是酵母的主要碳源和能源，适宜的糖度会使酵母菌产出更多的酒精，当初始糖度＞24%之后，龙眼果酒的酒精度继续升高，但感官评分有所下降，龙眼果酒中的龙眼的清香风味不明显，果酒滋味偏酸。当糖度过高时，发酵液渗透压升高抑制酵母菌的生理活动，成品酒的残糖偏高，影响果酒的品质[19]。综合考虑，发酵龙眼果酒的最佳初始糖度为24%。
图1 初始糖度对龙眼果酒品质的影响
Fig. 1 Effect of initial sugar contents on the quality of longan fruit wine
2.1.2 初始pH值对龙眼果酒品质的影响
初始pH值对龙眼果酒品质的影响见图2。由图2可知，随着初始pH值在5.0～6.6范围内的增加，龙眼果酒中感官评分、酒精度随之升高；当初始pH值为6.6时，果酒颜色为金黄色、果酒滋味浓郁，龙眼特征风味明显，感官评分最高，为86分，酒精度为11.7%vol；当初始pH值＞6.6之后，果酒酒精度继续升高，但升高幅度放缓，说明所试验的初始pH值范围有利于酵母的生长繁殖，但pH值太高会导致杂菌的生长繁殖，使酒体浑浊、果酒中龙眼特征风味不明显，感官评分有所降低。初始pH过高时，会影响酵母菌的发酵，且果酒中的酯类物质产生水解，降低果酒的品质[20]。综合考虑，发酵龙眼果酒的最佳初始pH值为6.6。
图2 初始pH值对龙眼果酒品质的影响
Fig. 2 Effect of initial pH value on the quality of longan fruit wine
2.1.3 酵母接种量对龙眼果酒品质的影响
酵母用量对龙眼果酒品质的影响见图3。由图3可知，当酵母接种量为0.15～0.25 g/L时，龙眼果酒中感官评分、酒精度随之升高；当酵母接种量为0.25 g/L时，龙眼果酒感官评分、酒精度最高，分别为86分和11.4%vol。果酒滋味柔和爽口、醇厚协调；当酵母接种量＞0.25 g/L之后，酵母接种量过高，酵母菌数量过多，生理活动旺盛，导致果酒较浑浊，酵母味浓，口感偏酸[21]，果酒感官评分低。因此，发酵龙眼果酒的最佳接种量为0.25 g/L。
图3 酵母接种量对龙眼果酒品质的影响
Fig. 3 Effect of inoculum on the quality of longan fruit wine
2.1.4 发酵温度对龙眼果酒品质的影响
发酵温度对龙眼果酒品质的影响见图4。由图4可知，当发酵温度为21～25 ℃时，龙眼果酒中感官评分、酒精度随之升高；当发酵温度为25 ℃时，感官评分最高，为86分，酒精度为11.8%vol；当发酵温度高于25 ℃之后，龙眼果酒的酒精度继续升高，说明21～25 ℃为酵母繁殖和发酵的适宜温度范围，酵母活力高，发酵彻底。发酵温度过高，发酵速度会很快，但酵母菌衰老的也快，发酵停止的时间会提前，酒精度也达不到预期要求。发酵温度过低，酵母活性降低，发酵周期变长，影响果酒的口感[22]。因此，发酵龙眼果酒的最佳温度为25 ℃。
图4 发酵温度对龙眼果酒品质的影响
Fig. 4 Effect of fermentation temperature on the quality of longan fruit wine
2.2 发酵工艺优化正交试验
在单因素试验基础上，以酒精度和感官评价为评价指标，以初始糖度（A）、酵母接种量（B）、初始pH值（C）、发酵温度（D）为影响因素，按照L9（34）正交试验设计，龙眼果酒发酵工艺正交试验结果与分析见表3。
表3 发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization
由表3可知，对果酒品质影响的4个因素的强弱顺序为A＞B＞C＞D，即初始糖度＞酵母接种量＞初始pH值＞发酵温度。以酒精度为评价标准，发酵工艺最佳组合为A3B2C2D1；以感官评分为评价标准，发酵工艺最佳组合为A2B2C2D1。两个最佳组合中3个因素相同，由极差讨论出，通过初始糖度对酒精度的影响（Rj=4.27）与对感官评价的影响（Rj=11.67）对比，可得出对感官评价影响最大的因素是初始糖度，选择该因素的水平为A2。故龙眼果酒的最佳发酵工艺组合为A2B2C2D1，即初始糖度24%、酵母接种量0.25g/L、初始pH值6.6、发酵温度23 ℃。在此最佳发酵工艺条件下，进行3次平行验证试验，龙眼果酒酒精度为11.5%vol，感官评分为89分。
2.3 龙眼果酒品质指标及抗氧化活性分析
有研究表明，发酵果酒的抗氧化活性成分含量高于浸泡型果酒[23]。发酵型龙眼果酒与浸泡型龙眼果酒的品质指标及抗氧化活性对比结果见表4。由表4可知，发酵型果酒具有低酒度、低总糖和高酸度的特点，而浸泡型果酒具有高酒精度、高总糖和低酸度的特点。果酒的酸度适中可使酒醇厚爽口，平衡苦味，但酸度过高会造成酒味酸涩、酒体粗糙[24]，发酵型龙眼果酒与浸泡型龙眼果酒两种果酒的相互融合可以较好地平衡各自在酸度的不足。
表4 龙眼果酒品质指标及抗氧化活性测定结果
Table 4 Determination results of quality indexes and antioxidant activity of longan fruit wine
发酵型龙眼果酒的多酚含量、维生素C含量、超氧阴离子自由基清除率、羟基自由基清除率、DPPH自由基清除率均高于浸泡型龙眼果酒，抗氧化能力明显优于浸泡型龙眼果酒，说明发酵可使龙眼果实中的活性成分更好地溶出。果酒中的抗自由基及抗氧化成分能提高机体免疫机能，促进机体健康[25]。
2.5 发酵型龙眼果酒与浸泡型龙眼果酒香气成分分析
香气成分是果酒的重要品质指标，如何最大程度地保留原料水果特有的香气特征，又能具有良好的口感是果酒研发的主要目的之一。发酵型龙眼果酒与浸泡型果酒的香气成分GC-MS分析结果见表5。
表5 两种龙眼果酒中香气成分GC-MS分析结果
Table 5 Results of aroma components in two kinds of longan fruit wines analyzed by GC-MS
由表5可知，发酵型龙眼果酒中共检出27种挥发性物质，其中醇类共6种，占香气成分的56.03%；酯类有7种，占香气成分的34.44%；有机酸类有5种，占香气成分的4.98%；酮类有2种，占香气成分的1.86%；醛类有3种，占香气成分的1.43%；杂环类为2种，占香气成分的0.57%；烯烃类有1种，占香气成分的0.36%；醚类为二乙二醇醚，占香气成分的0.33%。而浸泡型龙眼果酒中只有13种挥发性物质，其中醇类2种、酯类4种、有机酸3种、醛类1种、酚类2种、烯烃类1种，香气成分远少于发酵型龙眼果酒。发酵果酒的发酵工艺添加了果胶酶、酵母等物质，在发酵过程中会产生芳香化合物[26]，使酒体风味更丰满。
3 结论
本研究采用单因素试验及正交试验对发酵型龙眼果酒的发酵工艺进行优化，得到的发酵龙眼果酒最佳发酵工艺条件为：初始糖度24%、酵母0.25 g/L、初始pH值6.6、发酵温度23 ℃。此优化工艺下，发酵型龙眼果酒的酒精度为11.5%vol，酒体澄清，口感柔和，具有龙眼典型性风味，感官评分为89分。总糖含量为3.6%、多酚含量为114.515 μmg/L、维生素C含量为100.045 μg/mL、超氧阴离子自由基清除率为64.97%、DPPH自由基清除率为93.75%、羟基自由基清除率为69.17%，而浸泡型龙眼果酒酒精度、总糖和总酸含量较高，其他各项品质指标均低于发酵型龙眼果酒。发酵型龙眼果酒共检出27种挥发性香气物质，其中醇类6种、酯类7种、酸类5种、酮类2种，醛类3种，杂环类2种，烯烃类1种，醚类1种。
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