生物胺是一类具有生物活性的含胺基础化合物的总称，在发酵食品中普遍存在，其主要由发酵微生物对氨基酸的脱酸作用产生[1]。摄入适量的生物胺具有促进机体蛋白合成、调节血管和肌肉张力、控制血压和血糖稳定、增强机体免疫调节、参与神经信号传导、清除体内自由基等生理活性[2]，但高剂量的生物胺则会对机体产生毒性，特别是组胺和酪胺，可引发偏头痛和高血压等不良反应[3]，因此，生物胺被认为是反映安全性的重要指标之一[4]。
发酵食品中常见的生物胺主要有色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺8种[5]，其在发酵食品中的含量受样品中氨基酸的浓度、发酵微生物种类、脱羧酶活性、发酵条件等因素的影响[6-7]。目前在常见的食品发酵微生物乳杆菌（Lactobacillus）、片球菌（Pediococcus）、乳球菌（Lactococcus）、链球菌（Streptococcus）、肠球菌（Enterococcus）等属的部分菌株中均检测到了氨基酸脱羧酶基因及活性[8]，但不同菌种来源的氨基酸脱羧酶在底物特异性和催化活性上差异较大[9]。
由于氨基酸水平是制约发酵食品生物胺含量最关键的因素，因此那些高蛋白质含量的发酵食品通常含有较高水平的生物胺，如发酵肉制品[10]、发酵水产品[11]和发酵豆制品等[12]。我国的传统发酵豆制品种类较多，包括豆酱、豆豉、腐乳、酱油等，相关文献中已经系统报道了国内市售豆酱[13]、豆豉[14]和酱油[15]中的生物胺水平，但国内市售腐乳中的生物胺水平尚缺乏系统报道。
本研究的主要目的是分析检测我国市售不同品牌腐乳中的生物胺种类及水平，采用丹磺酰氯柱前衍生结合高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）法对我国市售的20个品牌白方腐乳和20个品牌红方腐乳中的生物胺含量进行分析，并揭示发酵工艺对产品中生物胺含量影响的规律，以期为全面解析我国市售腐乳中生物胺分布规律提供科学数据，为腐乳生产企业有针对性地降低产品中特定生物胺的水平进而提高产品安全性提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
腐乳样品（共计80个，其中白方腐乳和红方腐乳各40个，分别来自20个品牌，每个品牌取2批次样品，生产日期为2020年和2021年）：西安市大型超市以及网络电商平台购买。
腐胺、尸胺、酪胺、组胺、色胺，β-苯乙胺、精胺、亚精胺生物胺标准物质（纯度均＞98%）、丙酮、三氯甲烷、正丁醇（均为色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司；衍生剂（丹磺酰氯）（色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
1260高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；ULPHW超纯水机：四川优普超纯科技有限公司；N-EVAP-34氮吹仪：美国Organomation公司。
1.3 检测方法
1.3.1 生物胺提取
取5 g腐乳样品加入50 mL离心管中，加入0.4 mol/L三氯乙酸溶液20 mL，高速匀浆2 min，离心，将全部液相转移至100 mL具塞量筒内，沉淀物用0.4 mol/L三氯乙酸溶液20 mL再提取一次，合并提取液至具塞量筒内，然后添加4 mol/L氢氧化钠溶液4 mL和0.5 mol/L碳酸钠溶液4 mL，将溶液调至pH 11.0，继后依次加入三氯甲烷20 mL和正丁醇20 mL，上下振荡1 min，静置10 min，倾出上层水相，向下层有机相中加入1 mol/L盐酸1 mL，然后于50 ℃旋转蒸发至近干，再加入0.1 mol/L盐酸5 mL复溶残留物，待衍生。
1.3.2 生物胺衍生
取1 mL上述样品提取液或标准溶液，加入至5 mL具塞试管中，再依次加入0.5 mol/L碳酸钠溶液0.5 mL和5 g/L丹磺酰氯丙酮溶液（将0.5 g丹磺酰氯溶于100 mL丙酮中）0.5 mL，混合均匀，于50 ℃水浴避光加热反应60 min，然后加入0.1 mL浓氨水，去除过剩衍生剂，经尼龙滤膜过滤后加入至色谱瓶中，待HPLC分析[16]。
1.3.3 高效液相色谱分析
衍生剂丹磺酰氯采用安捷伦TC-C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）在40 ℃柱温下对目标物进行分离，然后利用紫外检测器在波长254 nm处对目标物进行检测。
HPLC分析色谱条件：进样量20 μL，柱流量1 mL/min，使用梯度洗脱，流动相A为水，流动相B为甲醇，流动相B在30 min内从55%升至75%，然后在随后10 min内升至90%，维持10 min。
2 结果与分析
2.1 生物胺衍生物及色谱分离
本研究对腐乳的8种生物胺（腐胺、尸胺、酪胺、组胺、色胺，β-苯乙胺、精胺、亚精胺）进行了定量检测，该8种生物胺的分子结构信息见表1。由表1可知，腐胺、尸胺、精胺、亚精胺为脂肪族生物胺；酪胺、β-苯乙胺为芳香族生物胺；组胺和色胺为杂环生物胺。每种生物胺分子在所含胺基类型上存在较大差异，腐胺、尸胺、酪胺和β-苯乙胺只含伯胺基，而精胺、亚精胺、组胺和色胺则同时含有伯胺基和仲胺基。不同生物胺分子在所含的胺基数量上也存在较大差别，β-苯乙胺和酪胺分子只含1个胺基，而精胺分子则含有4个胺基。
表1 8种生物胺的分子结构
Table 1 Molecular structure of 8 kinds of biogenic amines
尽管许多衍生剂，如9-芴甲氧羰酰氯[17]、苯甲酰氯[18]、4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯[19]等，均能与生物胺分子中的伯胺基和仲胺基中的至少一个发生反应，但产生的这些生物胺衍生物稳定性不佳，容易降解[20]，而丹磺酰氯与生物胺形成的衍生物即便在室温下也能在48 h内保持足够的稳定性[20]，因此，选择丹磺酰氯对样品中的生物胺进行了衍生，以确保目标物在高效液相色谱批处理分析过程中具有足够的稳定性。
丹磺酰氯与伯胺基和仲胺基均能发生反应，并且在反应过程中均释放出氯化氢，故反应体系维持碱性环境对加快反应速率和提高衍生产物得率非常必要[21]。此外，酪胺分子的羟基也能与丹磺酰氯发生反应，这是丹磺酰氯区别于其他胺基衍生化试剂的一个典型特征[22]。丹磺酰氯衍生生物胺的反应如下：
生物胺标准物质衍生物的HPLC分析结果见图1。由图1可知，每种衍生物都实现了基线分离，且峰形尖锐和对称，未见明显前沿峰和拖尾峰。由于衍生物极性不同，故其在C18色谱柱上的保留时间也存在响应差异，色胺衍生物的保留时间最短，而精胺衍生物的保留时间最长。精胺具有极性的四个胺基均被丹磺酰氯衍生，致使其极性显著降低，这是其保留时间最长的关键原因。
图1 生物胺标准物质衍生物HPLC分析色谱图
Fig. 1 Chromatogram of biogenic amine standard derivatives analyzed by HPLC
色谱峰：1色胺；2β-苯乙胺；3腐胺；4尸胺；5组胺；6酪胺，7亚精胺；8精胺。
2.2 腐乳样品中生物胺含量的测定
由图2可知，腐乳样品中存在的主要生物胺为色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺和酪胺。由于在绝大多数样品中精胺和亚精胺的含量都接近或低于检出限0.5 mg/kg，因此在本研究中未对该两种生物胺的含量进行统计学分析。
图2 红方腐乳和白方腐乳中生物胺含量的比较
Fig. 2 Comparison of biogenic amines contents in red and white sufu
“***”表示差异高度显著（P＜0.001），“**”表示差异极显著（P＜0.01），“*”表示差异显著（P＜0.05）。
对于红方腐乳样品，生物胺的平均含量由高到低依次为酪胺、组胺、腐胺、色胺、β-苯乙胺和尸胺，含量分别为56.4 mg/kg、30.6 mg/kg、17.4 mg/kg、12.8 mg/kg、3.1 mg/kg和2.7 mg/kg；对于白方腐乳，生物胺的平均含量由高至低依次为酪胺、腐胺、组胺、色胺、尸胺和β-苯乙胺，含量分别为90.9 mg/kg、59.6 mg/kg、56.9 mg/kg、42.6 mg/kg、8.1 mg/kg和7.7 mg/kg。由此可见，红方腐乳与白方腐乳在不同类型生物胺水平的高低规律上大致相似，仅是二者在组胺和酪胺的顺序上相反。在该图中也可以发现另一个明显的规律，即白方腐乳中每种生物胺的水平都显著高于红方腐乳（P＜0.05）。白方腐乳中色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺和酪胺的含量分别为红方腐乳的3.3、2.3、3.4、3.0、1.9和1.6倍。
2.3 腐乳中不同类型生物胺含量水平
将白方腐乳和红方腐乳共计160个样品放在一起进行统计以分析不同种类生物胺在含量水平上的差异，结果见图3。由图3可知，在腐乳样品中含量最高的生物胺是酪胺、组胺和腐胺次之，色胺再次之，β-苯乙胺和尸胺含量最低。上述6种生物胺在它们的含量水平上差距很大，酪胺的平均水平约是β-苯乙胺和尸胺的13.6倍。
图3 腐乳样品中不同类型生物胺含量比较
Fig. 3 Comparison of different types of biogenic amines contents in sufu samples
字母不同表示均值间差异显著（P＜0.05）。
2.4 腐乳中酪胺和组胺含量频数
由于组胺和酪胺是食品中毒性最强也是最被关注的生物胺，因此进一步对不同腐乳样品中的酪胺和组胺的水平进行了频数统计分析，结果见表2。
由表2可知，不同样品中的组胺和酪胺水平高度分散。酪胺含量范围为8.9～146.0 mg/kg，最高含量是最低含量的16.4倍；组胺含量范围为4.5～155.5 mg/kg，最高含量是最低含量的34.6倍。在总样品中，有10%样品的酪胺含量高于119.0 mg/kg，这些样品均为白方腐乳；在总样品中，有10%样品的组胺水平高于81.1 mg/kg，这些样品只有1个为红方腐乳，其余样品均为白方腐乳。
表2 腐乳样品中酪胺和组胺含量的频数统计结果
Table 2 Frequency statistics results for tyramine and histamine content in sufu samples
3 讨论
高蛋白发酵食品腐乳中生物胺含量过高的现象已逐渐受到关注，食品发酵过程中生物胺产生的途径见图4。高含量生物胺的产生与产品在发酵过程中产生足够的游离氨基酸、发酵微生物能够分泌高活性的氨基酸脱羧酶、发酵条件促进脱羧酶活性微生物的生长及代谢等因素都有关[23]。腐乳是以大豆为原料，经磨浆、成坯、前酵、腌制、后酵等过程制成的传统发酵豆制品。大豆中蛋白质含量约40%，其氨基酸组成与牛奶蛋白质接近，除蛋氨酸略低外，其余必需氨基酸含量均较丰富，是植物性的完全蛋白质[24]。在腐乳发酵的前酵阶段，通常采用纯菌接种发酵，除了黑龙江克东腐乳等少数腐乳接种的是微球菌属的细菌外[25]，其他的腐乳接种的主要是毛霉属和根霉属等霉菌微生物，霉菌在豆腐坯周围形成菌丝，同时利用菌体分泌的淀粉酶将豆腐中的少量淀粉糖化，利用分泌的蛋白酶和肽酶将蛋白质水解为肽和游离氨基酸，而在后酵阶段，需要在此基础上再加入食盐、红曲、黄酒等辅料然后再装坛进行发酵，是毛霉菌和其他多种微生物共同参与的复杂发酵过程[26]。本研究发现白方腐乳样品中存在较高水平的酪胺、组胺和腐胺的现象与腐乳发酵过程中产生的大量游离酪氨酸、组氨酸和精氨酸有关，因为后者分别是前者产生的前体物质[27]。
图4 食品发酵过程中生物胺的产生途径
Fig. 4 Production pathways of biogenic amines during food fermentation
在本研究中发现的白方腐乳中生物胺水平普遍高于红方腐乳的现象应与发酵工艺有关。在红方腐乳发酵过程中要加入红曲米和白酒（或黄酒）等，红曲米中含有红曲霉微生物，接种后其在一定程度上主导后发酵过程，从而抑制其他具有更强氨基酸脱羧酶活性微生物的生长或繁殖，再者，红曲米中含有红曲霉的活性代谢物洛伐他汀[28]，其关键作用是能够抑制体内胆固醇合成的关键酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的活性，进而发挥体内降胆固醇活性[29]，由红曲米接种引入的洛伐他汀可能对参与发酵微生物的氨基酸脱羧酶或其他代谢酶产生一定程度的抑制作用，进而影响了发酵微生物的氨基酸脱羧酶活性或其他代谢活性。另外，在红方腐乳制备过程中添加的白酒或黄酒等在一定程度上也抑制了部分微生物的生长或代谢，进而也会影响最终产品中的生物胺水平。无论是白方腐乳还是红方腐乳，其生物胺水平均呈现高度分散化，这主要与发酵微生物的构成有关，并且也与发酵时间、发酵工艺、辅料种类等有关[30-31]。目前我国仅对鲜、冻动物性水产品中的组胺含量进行了限量要求，规定鲐鱼和其他鱼类中组胺的限量分别为400 mg/kg和200 mg/kg，而美国则对所有食品中的组胺含量进行限量要求，限值为50 mg/kg[32]。在本研究检测的白方腐乳和红方腐乳样品中分别有约60%和10%的样品超过了美国的限量标准，说明我国市售腐乳特别是白方腐乳在组胺含量上存在着一定安全隐患。由此可见，在国家标准层面，制定和出台腐乳中生物胺特别是组胺的限量标准以确保腐乳产业健康发展非常必要。
4 结论
本研究结果表明，在我国市售的腐乳中存在的主要生物胺有6种，其平均含量由高至低依次为酪胺、组胺、腐胺、色胺、β-苯乙胺、尸胺，每种生物胺在白方腐乳中的平均水平均显著高于红方腐乳，且在不同品牌之间高度差异化。但由于组胺和酪胺相对于其他生物胺具有更高毒性作用及潜在多靶点潜在危害效应，因此生产企业通过优化工艺特别是严控发酵剂菌种使用以降低腐乳中组胺和酪胺水平非常必要。
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