多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs），又称多烯脂肪酸，主要是指含有两个或两个以上双键的长链脂肪酸，包括亚油酸（linoleic acid，LA）、γ-亚麻酸（gamma linolenic acid，GLA）、花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、二十二碳五烯酸（docosapentaenoic acid，DPA）等[1-2]，PUFAs是生物膜系统的重要组成成分，可以调节细胞膜的功能，影响基因的表达。PUFAs在生物体内发挥着重要的生物学功能[3]，也是生物活性的前体，如前列腺素、血栓素、白三烯等类二十烷类物质，而这些活性物质对于脂类代谢、血液流变学、血管弹性、免疫活性等生理功能有重要的调节作用[4-6]。PUFAs可以保护生物膜结构[7]、抗炎[8]、抗癌[9]、治疗心血管疾病[10]，还可以增加动物的产仔率和成活率以及促进大脑发育[11]。
PUFAs主要来源于动植物，但原料有限，且易受气候、产地等各种因素的制约，市场出现了供不应求的趋势[12-13]。而微生物生产PUFAs具有生产周期较短、繁殖速度快、成本低、营养简单、易规模化生产、产品质量稳定、不受产地的限制等优点，从而成为开发生产PUFAs的研究热点[14-15]。
目前，用于生产PUFAs的微生物主要集中在被孢霉属（Mortierella）真菌[16]，但是野生菌株生产PUFAs的能力很低。因此，近年来人们一直在探索利用诱变育种等技术，对现有产PUFAs菌株进行改造，进一步提高PUFAs的含量[17-19]。本研究以深黄被孢霉（Mortierella isabellina）AS3.3410为出发菌株，利用紫外线及氯化锂（LiCl）对其进行复合诱变，通过乙酰水杨酸、苏丹黑B染色初筛，摇瓶复筛，选育出高产PUFAs的突变菌株，以期提高菌体生物量和油脂产量。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种
深黄被孢霉（Mortierella isabellina）As3.3410：中国科学院微生物研究所国家菌种保藏中心。
1.1.2 试剂
玉米糖（浓度≥17%，葡萄糖当量值（dextrose equivalen，DE）≥90%）：实验室自备；氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖、磷酸二氢钾（均为分析纯）：北京化工厂；琼脂（生化试剂）：北京奥博兴生物技术有限责任公司；磷酸铵（分析纯）：天津光复精细化工研究所；硫酸镁（分析纯）：天津市津北精细化工有限公司；柠檬酸钠（分析纯）、酵母膏（生化试剂）、无水氯化锂（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；乙酰水杨酸（分析纯）、苏丹黑B（生物学染色）、二甲苯（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；0.5%番红染色液（生物学染色）：常德比克曼生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
斜面培养基[20]：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基。去皮马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，pH自然。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。PDA液体培养基中不添加琼脂。
种子培养基[21]：葡萄糖50 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁0.30 g/L，硫酸铵2 g/L，酵母膏2 g/L，pH 6，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
产脂培养基[22-23]：玉米糖60 g/L，柠檬酸钠2 g/L，硫酸镁0.50 g/L，酵母膏2 g/L，pH 6，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
YP10002电子天平：上海恒际科学仪器有限公司；ESJ120电子分析天平：天津市德安特传感技术有限公司；85-2控温磁力搅拌器：江苏金坛城东新瑞仪器厂；BSD-TX270恒温振荡器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；MTX-8013霉菌培养箱：天津市宏诺仪器有限公司；motic B SERIES显微镜：麦克奥迪实业集团有限公司；MLS-3750高压灭菌锅：日本三洋公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵：北京科伟永兴仪器有限公司；RE 5298A旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；101-1AB型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；PHS-25型pH计：上海晶磁仪器有限公司；BCN-1360型生物洁净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；250mL索氏抽提器：天津玻璃仪器厂；7890B气相色谱（gas chromatography，GC）仪：美国安捷伦科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株活化
将深黄被孢霉（Mortierella isabellina）As3.3410接种于PDA斜面培养基上，28 ℃恒温培养5 d，直至孢子大量形成转变为灰色后4 ℃冰箱保存。
1.3.2 孢子悬浮液的制备
取25 mL 9 g/L的氯化钠溶液加入菌株活化后的斜面培养基中，使用无菌接种环刮掉孢子，制成孢子菌悬液后，置于带有玻璃珠的三角瓶中，30 ℃、200 r/min条件下振荡打散孢子30 min，然后用无菌脱脂棉进行过滤，制成103 CFU/mL的单孢子悬浮液。
1.3.3 紫外诱变时间的选择
调整培养皿与紫外灯的距离为28 cm，打开紫外灯预热30 min。取1 mL制备好的单孢子悬浮液分别置于恒温磁力搅拌器上的无菌培养皿中，盖上皿盖紫外照射1 min，在黑暗条件下打开皿盖后，打开紫外灯（波长253.7 nm）边照射边搅拌，分别照射5 s、10 s、15 s、20 s、25 s、30 s。分别吸取0.20 mL上述条件下的孢子悬浮液涂布于PDA平板培养基，28 ℃避光培养48 h，统计菌落数[24]并计算致死率，其计算公式如下：
1.3.4 氯化锂质量浓度的选择
分别配制含0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L氯化锂的PDA诱变培养基，取0.20 mL紫外照射后的单孢子悬液涂布于诱变培养基，28 ℃避光培养48 h，统计菌落数并计算致死率。
1.3.5 乙酰水杨酸质量浓度的选择
分别配制含0.40 g/L、0.45 g/L、0.50 g/L、0.55 g/L、0.60 g/L、0.65 g/L乙酰水杨酸的PDA筛选培养基。将经紫外-氯化锂复合诱变的菌种转接到PDA液体培养基中，28 ℃、200 r/min条件下培养5 h，再将培养液转接到PDA斜面上传代2次。斜面加入15 mL 9 g/L的氯化钠溶液，无菌接种环刮掉孢子，制成单孢子菌悬液后，用无菌脱脂棉过滤，吸取0.20 mL单孢子悬液涂布于筛选培养基，28 ℃培养5 d，统计菌落数并计算抑菌率，其计算公式如下：
1.3.6 苏丹黑B染色[25-26]
从含最适质量浓度乙酰水杨酸的PDA筛选培养基中选取生长速度快的单菌落，在载玻片上加一滴无菌水，用接种环挑取少许菌体制成涂片，自然干燥后，用3 g/L的苏丹黑B（苏丹黑B 0.30 g、100 mL体积分数70%乙醇）染色10～15 min，水洗，自然干燥，滴加二甲苯脱色至涂片透明，干燥后滴加0.5%蕃红染液复染30 s，水洗，自然干燥后显微镜观察脂肪粒，挑取胞内脂肪粒大、多且明显的单菌落。
1.3.7 摇瓶复筛
将初筛得到的单菌落划线接种于PDA斜面培养基上，28 ℃恒温培养5 d。取15 mL无菌水置于成熟斜面中，使用无菌接种环刮掉孢子，制成单孢子菌悬液，倒入装液量为200 mL/1 000 mL种子培养基中，28 ℃、200 r/min振荡培养2 d，作为种子液备用。按10%的接种量将种子液接种于装液量为200 mL/1 000 mL产脂培养基中，28 ℃、200 r/min振荡培养5 d，测定菌体生物量和油脂产量，选择菌体生物量、油脂含量高的菌株。
1.3.8 遗传稳定性实验
为确保诱变菌株遗传性状的稳定性，将获得的高产菌株连续传代5次，28 ℃恒温培养5 d，每代都要在相同的条件下接入产脂培养基培养5 d，并且每传代1次都要进行生物量和油脂产量的测定[27-28]。
1.3.9 分析检测
生物量的测定[29]：将发酵液用布氏漏斗抽滤，得到的菌丝体用蒸馏水水洗一次，置于室温下干燥至恒质量，称质量，并计算生物量，其计算公式如下：
油脂的提取及测定[30]：采用索氏抽提法测定油脂含量，并计算出油率，其计算公式如下：
多不饱和脂肪酸的测定[31-32]：采用GC法测定发酵液中的多不饱和脂肪酸种类及含量。
2 结果与分析
2.1 紫外线照射时间的确定
紫外线是非电离辐射的物理诱变剂，任何诱变剂都同时具有致死和诱变的双重效应[33]，因此，需要测定深黄被孢霉As3.3410经紫外照射后的致死率曲线，结果见图1。由图1可知，紫外照射时间短时孢子的致死率低，但随着紫外照射时间的逐渐增加，致死率逐渐升高。现代育种理论认为，当紫外线诱变深黄被孢霉的致死率为75%～80%时产量性状正突变率较高，有利于突变株的筛选[34]。因此，本研究采用79.60%的致死率对应的照射时间20 s为最佳诱变时间。
图1 不同紫外照射时间下深黄被孢霉As3.3410的致死率曲线
Fig.1 Lethality rate curve of Mortierella isabellina As3.3410 under different ultraviolet irradiation time
2.2 氯化锂质量浓度的确定
氯化锂是一种碱金属卤化物，其本身没有诱变作用，但可以和其他的诱变因子产生协同作用，对菌种产生诱变作用[35]。因此，本研究采用紫外线与氯化锂复合诱变的方法对深黄被孢霉As3.3410进行处理，并考察深黄被孢霉As3.3410紫外照射20 s后经不同质量浓度氯化锂处理后的致死率曲线，结果见图2。由图2可知，经紫外线照射20 s后，当LiCl质量浓度分别为0.8 g/L、1.0 g/L时，深黄被孢霉As3.3410的诱变致死率均为100%；当LiCl质量浓度为0.6 g/L时，深黄被孢霉As3.3410的致死率为75.10%，单菌落较多，并且致死率比较稳定，所以选择质量浓度为0.6 g/L氯化锂处理深黄被孢霉As3.3410。
图2 不同质量浓度氯化锂下深黄被孢霉As3.3410的致死率曲线
Fig. 2 Lethality rate curve of Mortierella isabellina As3.3410 under different mass concentrations of lithium chloride
2.3 乙酰水杨酸质量浓度的确定
为获得PUFAs高产菌株，进行乙酰水杨酸初筛，为避免进行盲目筛选，提高筛选效率，研究了不同质量浓度的乙酰水杨酸对诱变后菌株生长的抑制效应。不同质量浓度的乙酰水杨酸对诱变后菌株的抑菌率见图3。由图3可知，随着乙酰水杨酸质量浓度的逐渐增加，诱变后菌株的抑菌率也随之增加，当乙酰水杨酸质量浓度为0.60 g/L时，抑菌率达100%。乙酰水杨酸的质量浓度过低，起不到好的筛选抗性突变株的效果，会使筛选工作量增加，筛选效率降低；乙酰水杨酸的质量浓度过高，又会漏筛一些高产菌株，所以筛选浓度一般都定为菌株的临界致死浓度，因此，确定初筛培养基乙酰水杨酸质量浓度为0.60 g/L。
图3 不同质量浓度乙酰水杨酸对诱变后菌株的抑菌率
Fig. 3 Inhibition rate of different mass concentrations of acetylsalicylic acid on the strains after mutagenesis
2.4 高产多不饱和脂肪酸突变株的选育
从含0.60 g/L乙酰水杨酸的初筛培养基上挑选出现时间较早、菌落直径较大、生长旺盛的单菌落后，进行摇瓶培养，再进行苏丹黑B染色，筛选得到一株脂肪粒较大、分布密集的突变菌株，编号为SLZH-20，其与出发菌株AS3.3410的苏丹黑B染色镜检结果见图4。
图4 出发菌株AS3.3410（A）与突变菌株SLZH-20（B）的苏丹黑B染色镜检结果（10×40）
Fig. 4 Microscopic examination results of the Sudan black B staining of starting strain AS3.3410 (A) and the mutant strain SLZH-20(B) (10×40)
由图4可知，突变株SLZH-20菌丝体中油脂颗粒大且密集，而出发菌株AS3.3410菌丝体中油脂颗粒小且零散，说明该突变株SLZH-20富含大量油脂，有一定的研究价值。
通过摇瓶发酵，测定突变株SLZH-20的生物量和油脂含量，结果表明，突变株SLZH-20的菌体生物量和油脂含量分别为22.76 g/L、52.30%，较原始菌株As3.3410分别增加34.60%、24.30%，说明紫外线与氯化锂复合诱变对深黄被孢霉AS3.3410是非常有效的，尤其是在产脂性能方面极为优良。
2.5 高产多不饱和脂肪酸突变菌株SLZH-20的遗传稳定性实验
将突变株SLZH-20连续传接5代，测定生物量及油脂含量，考察突变株的遗传稳定性，结果见表1。由表1可知，突变株SLZH-20连续移接5代后，遗传性能稳定，未发生原位回复突变等情况，菌体生物量和油脂含量分别为22.19～22.67 g/L、49.54%～51.21%，不同代数间差异不显著（P＞0.05），说明此菌株具有良好的遗传稳定性。
表1 突变菌株SLZH-20的遗传稳定性实验结果
Table 1 Experimental results of genetic stability of mutant strain SLZH-20
注：同行小写字母相同表示差异不显著（P＞0.05）。
2.6 出发菌株AS3.3410与突变株SLZH-20脂肪酸组成成分的分析比较
突变株SLZH-20和出发菌株AS3.3410油脂的脂肪酸组成及含量见表2。由表2可知，从两菌株的油脂中共检测到9种脂肪酸，包括肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈一烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸。其中突变株SLZH-20中的不饱和脂肪酸的含量为81.41%，较出发菌株AS3.3410的不饱和脂肪酸含量增加5.72%。其中多不饱和脂肪酸含量达到16.24%，较出发菌株AS3.3410增加了2.18%，随着多不饱和脂肪酸含量的增加，使得突变株SLZH-20有着更高的研究价值。
表2 出发菌株AS3.3410与突变菌株SLZH-20的脂肪酸组成比较
Table 2 Comparison of fatty acid composition between the starting strain AS3.3410 and the mutant strain SLZH-20
3 结论
为获得多不饱和脂肪酸高产菌株，本研究以深黄被孢霉（Mortierella isabellina）AS3.3410为出发菌株，利用紫外线及氯化锂对其进行复合诱变，通过乙酰水杨酸初筛、苏丹黑B染色，摇瓶复筛，筛选得到一株高产多不饱和脂肪酸的突变菌株，编号为SLZH-20，具有较好的遗传稳定性，其摇瓶发酵5 d时，生物量和油脂含量分别为22.76 g/L、52.30%，比出发菌株分别提高34.60%和24.30%；该菌株所产油脂中不饱和脂肪酸包括棕榈一烯酸、油酸、亚油酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸，含量为81.41%，其中多不饱和脂肪酸含量为16.24%，比出发菌株分别提高5.72%和2.18%。
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