桑葚（mulberry）又称桑果、桑枣、文武实等，成熟的桑葚个体饱满、甘甜多汁、口感极佳，富含鞣酸、多种维生素、蛋白质和花色苷等，具有很高的营养价值与药用价值，是少数“既是食品又是药品”的“药食同源”农产品之一[1-2]。然而桑葚季节性较强，鲜果组织松散易腐烂，每年均会有大量桑葚腐烂变质，造成资源浪费[3-4]。桑葚果实中水分占66%～85%，可溶性固形物含量占9%～18%，酸类物质含量占1%～2%，粗蛋白含量约占0.5%，粗纤维含量约占1%，剩余灰分占0.5%左右，是优质的酿酒原料[5-6]。以鲜桑葚为原料酿造桑葚酒，不仅能保留桑葚的固有风味和营养成分，还能提高果农的经济效益，是带动果桑产业发展、增加果农收益的有效途径[7-8]。
酵母菌是果酒发酵过程中的一个关键要素，直接影响到果酒的风味。目前，国内普遍使用商业化酵母单菌发酵桑葚酒，常导致桑葚酒香味寡淡、风味不足等问题[9-10]。现有研究表明，在发酵过程中添加一定量的非酿酒酵母，能在一定程度上改善果酒品质[11-12]。非酿酒酵母含有丰富酶系，能分泌蛋白酶、果胶酶、葡萄糖苷酶等胞外酶，在果酒发酵过程中产生醇类、酯类、酸类、萜烯类等物质，对桑葚酒的品质与风味有较大影响[13-16]。CONTRERAS A等[17-19]均研究发现，在酿造葡萄酒时将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）与美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）共同发酵，酒样中的花香及果香将有明显提高；HU K等[20]研究发现，在葡萄酒发酵过程中同时接种有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），发酵结束后葡萄酒中中链脂肪酸乙酯的生成量高于酿酒酵母单菌发酵；张文文等[21]研究发现，采用东方伊萨酵母（Issatchenkio orientalis）和酿酒酵母混菌发酵杨梅酒，混菌发酵比酿酒酵母纯种发酵效率高，减少了酿酒酵母产生的辛酸和正癸酸2种不良风味物质，还降低了酿酒酵母发酵产生的酵母味和癸酸乙酯等带来的涩味。
本研究以异常威克汉逊酵母（Wickerhamomyces anmalus）与市售酿酒酵母BO213共同发酵桑葚酒，以酒精度、残糖、总酸、总酯、挥发酸以及感官品评为评价指标，采用单因素试验及响应优化试验，优化发酵工艺条件，并对桑葚酒的感官、微生物、理化指标与挥发性成分进行分析，以期为混菌发酵桑葚酒的研究提供一定理论依据和参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与菌株
桑葚（云桑二号）：攀枝花市盐边县；桑葚酒样品1、桑葚酒样品2：市售。
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BO213：法国LAFFORT公司；异常威克汉逊酵母（Wickerhamomyces anmalus）：四川轻化工大学生物工程学院实验室。
1.1.2 试剂
氢氧化钠、硫酸、邻苯二甲酸氢钾、酚酞等（均为分析纯）：成都科龙化工试剂厂；五水硫酸铜、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾等（均为分析纯）：重庆川东化工试剂厂；次甲基蓝（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）（液体）培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
7890A-5975B气相色谱-质谱联用（gas chromatographymass spectrography，GC-MS）仪：美国Agilent科技有限公司；SHB—Ш循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；UV-2000紫外可见分光光度计：上海湘仪仪器有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 桑葚酒加工工艺流程及操作要点[22]
桑葚→打浆→调整成分→添加SO2→入罐→接种酵母→前发酵→过滤→后发酵→低温静置→陈酿→桑葚酒
操作要点：
（1）酿酒酵母BO213的活化：称取一定质量的商业酿酒酵母活性干粉与等质量白砂糖混合，加入10倍质量的水，在35～40 ℃条件下活化20 min，随后加入2～3倍体积的果汁进行稀释即活化完毕。异常威克汉逊酵母的活化：将异常威克汉逊酵母划线接种到YPD培养基，在28 ℃条件下培养36 h，挑取单菌落接种到YPD液体培养基中，在28 ℃、150 r/min条件下培养36 h。
（2）桑葚打浆：挑选无腐烂、变质的新鲜桑葚，将适量的桑葚在自来水中进行冲洗，去掉表面的泥土及污垢，然后用清水浸泡，沥干后于打浆机中低速打浆。
（3）调整成分：按照桑葚汁与蒸馏水体积比3∶2混合，采用柠檬酸调pH值至4.0，利用白砂糖调节初始可溶性固形物到20°Brix。
（4）添加偏重亚硫酸钾：添加偏重亚硫酸钾使发酵液中SO2含量达到30 mg/L。
（5）入罐：将发酵液装入发酵罐中，装液量为70%～75%。
（6）接种酵母：混菌发酵工艺中将酿酒酵母与异常威克汉逊酵母均按1.5%的接种量接种于发酵罐中，单菌发酵工艺中将酿酒酵母BO213按1.5%的接种量接种于发酵罐中。
（7）前发酵：在28 ℃条件下发酵8 d。
（8）过滤：发酵结束后用8层纱布进行粗滤。
（9）后发酵：过滤后在12 ℃条件下发酵7 d。
（10）陈酿：发酵结束后，在4 ℃条件下避光陈酿30 d，期间每隔7 d倒罐一次，得到桑葚酒。
1.3.2 桑葚酒混菌发酵工艺优化单因素试验
采用单因素轮换法，依次考察初始可溶性固形物含量（16°Bx、18°Bx、20°Bx、22°Bx、24°Bx）、前发酵温度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）、桑葚汁与蒸馏水体积比（1∶1、1∶2、2∶1、2∶3、3∶2）、酵母接种量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，V/V）对桑葚酒理化指标及感官品评的影响。
1.3.3 桑葚酒混菌发酵工艺优化响应面试验
以单因素试验的结果为依据，选择影响显著的因素发酵温度（A）、初始可溶性固形物（B）和酵母接种量（C）为自变量，以桑葚果酒感官评价（Y）为响应值，采用响应面法进行发酵工艺优化。
1.3.4 分析与检测方法
残糖、总酸、挥发酸、总酯含量的测定：参照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；酒精度的测定：参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》；挥发性风味成分的测定及感官品评：参照曾霞等[23]的方法。
2 结果与分析
2.1 桑葚酒混菌发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 初始可溶性固形物含量的确定
由图1可知，随着初始可溶性固形物含量的增加，感官评分、总酸含量呈先升高后下降的趋势，酒精度及挥发酸含量呈升高趋势，残糖及总酯含量变化不明显。当初始可溶性固形物含量达到24°Bx时，桑葚酒酒精度最高，同时果香被酒味所掩盖，香气不协调；当初始可溶性固形物含量＜20°Bx之前，桑葚酒酒精含量低，酒体淡薄；当初始可溶性固形物含量为22°Bx时，酒体饱满，口感最佳，感官评分最高为84.4分、酒精度为12.5%vol、残糖、总酸、挥发酸及总酯含量分别为2.45 g/L、7.20 g/L、1.34 g/L、2.92 g/L。因此，确定最优初始可溶性固形物含量为22°Bx。
图1 初始可溶性固形物含量对桑葚酒感官评分及理化指标的影响
Fig. 1 Effect of initial soluble solids contents on sensory score and physicochemical indexes of mulberry wine
不同字母代表差异显著（P＜0.05）。下同。
2.1.2 发酵温度的确定
由图2可知，随着发酵温度的升高，桑葚酒的感官评分、总酸、挥发酸、总酯含量均呈先升高后下降的趋势，酒精度呈先升高后趋于稳定的趋势，残糖量呈下降的趋势。当发酵温度为28 ℃时，桑葚酒感官评分最高为86.8分，酒精度为11.9%vol、残糖、总酸、挥发酸及总酯含量分别为3.23 g/L、7.32 g/L、1.12 g/L、3.03 g/L。分析原因可能是发酵温度对酵母的生长增殖、发酵和酒体感官都有重要的影响，发酵温度过低或过高，都会使酵母增殖受到抑制。温度过低将导致起酵慢，发酵周期长，前期感染杂菌等问题；温度过高会促进酵母早衰、加速高级醇的生成，并造成桑葚酒中香气成分丧失，酒体暗淡无光、酒体粗糙，同时维生素、色素及黄酮类活性成分破坏分解，导致酒体功能性成分降低，影响果酒的品质[24-25]。因此，确定最优发酵温度为28 ℃。
图2 发酵温度对桑葚酒感官评分及理化指标的影响
Fig. 2 Effect of fermentation temperature on sensory score and physicochemical indexes of mulberry wine
2.1.3 桑葚汁与蒸馏水体积比的确定
由图3可知，随着桑葚汁与蒸馏水体积比的减小，桑葚酒的感官评分、酒精度、残糖及总酸含量均呈先升高后下降的趋势，总酯含量呈下降趋势，挥发酸含量变化不明显。当桑葚汁与蒸馏水体积比为4∶1与3∶1时，酒体涩味、酸味明显，并且酒体浑浊，不利于后期陈酿及澄清处理；当桑葚汁与蒸馏水体积比为2∶1、3∶2和1∶1时，酒体感官品评得分均高于80分，且当桑葚汁与蒸馏水体积比为3∶2时，桑葚酒感官评分最高为86.9分，酒精度为12.6%vol、残糖、总酸、挥发酸及总酯含量分别为2.50 g/L、7.60 g/L、1.03 g/L、3.31 g/L。因此，确定最优桑葚汁与蒸馏水体积比为3∶2。
图3 桑葚汁与蒸馏水体积比对桑葚酒感官评分及理化指标的影响
Fig. 3 Effect of mulberry juice and distilled water volume ratio on sensory score and physicochemical indexes of mulberry wine
2.1.4 酵母接种量的确定
由图4可知，随着酵母接种量的升高，桑葚酒的感官评分、酒精度呈先升高后下降的趋势，残糖量呈下降的趋势，总酸、挥发酸及总酯含量呈升高趋势。分析原因可能是酵母的接种量对桑葚酒的发酵有重要影响。接种量少将导致起酵缓慢，发酵力弱，酒精转化率低，对酒体的香味、色泽及口感均有较大影响；接种量过高使得酵母大量自我繁殖，浪费过多营养物质导致发酵效率降低，桑葚酒香味寡淡，丰度不足，同时发酵温度上升过快，过程不易控制[26]。当酵母接种量为2.0%时，桑葚酒的感官评分最高为87.2分，酒精度为12.5%vol、残糖、总酸、挥发酸及总酯含量分别为2.20 g/L、6.90 g/L、0.90 g/L、2.90 g/L。因此，确定最优酵母接种量为2.0%。
图4 酵母接种量对桑葚酒感官评分及理化指标的影响
Fig. 4 Effect of yeast inoculum on sensory score and physicochemical indexes of mulberry wine
2.2 桑葚酒混菌发酵工艺优化响应面试验
根据单因素试验结果进行响应面试验，试验设计及结果见表1，方差分析结果见表2。
表1 桑葚酒混菌发酵工艺优化响应面试验设计及结果
Table 1 Design and results of response surface tests for mulberry wine fermentation process optimization
采用Design Expert 8.0.6软件对表1中的数据进行回归拟合分析，得到自变量与感官评分（Y）的二次多项回归方程：Y=90.07+2.76A+2.06B+1.32C-2.77AB+0.80AC+0.10BC-8.35A2-2.35B2+1.23C2。
由表2可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明该模型拟合程度好，试验误差小。决定系数R2=0.974 2，调整决定系数R2adj=0.927 6，说明92.76%的试验数据的变异型可用此回归模型解释。由表2亦可知，一次项A及二次项A2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项B、交互项AB及二次项B2对结果影响显著（P＜0.05）。交互项AB对结果影响的响应面及等高线见图5。
表2 回归模型的方差分析
Table 2 Variance analysis of regression model
注：“**”表示差异极显著（P＜0.01），“*”表示差异显著（P＜0.05）。
由图5可知，初始可溶性固形物含量与前发酵温度间交互作用对桑葚酒感官评分影响的响应曲面呈凸形，等高线呈椭圆形，说明交互作用显著，与方差分析结果一致。采用Design Expert 8.0.6软件对多元回归方程预测，得到最优桑葚酒混菌发酵工艺为前发酵温度28.3 ℃、初始可溶性固形物含量20.7°Bx、酵母接种量1.5%，在此条件下，桑葚酒感官评分的理论值为93.29分。为便于实际操作，将最优发酵工艺修正为前发酵温度28 ℃、初始可溶性固形物含量21 °Bx、酵母接种量1.5%，在此优化条件下进行验证试验，桑葚酒感官评分实际值为93.10分，与理论值接近，说明该模型可用于预测桑葚酒的感官评分。
图5 发酵温度与初始可溶性固形物含量间交互作用对桑葚酒感官评分影响的响应曲面及等高线图
Fig. 5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between initial soluble solid content and fermentation temperature on sensory score of mulberry wine
2.3 不同桑葚酒品质的检测与分析
测定混菌发酵桑葚酒的感官评分、理化指标及微生物指标，并与酿酒酵母单菌发酵桑葚酒及两款市售桑葚酒进行对比分析，结果见表3。由表3可知，混菌发酵桑葚酒的感官评分最高；理化及微生物指标均能达到农业行业标准NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》要求。结果表明，混菌发酵桑葚酒品质优于单菌发酵桑葚酒及两款市售桑葚酒。
表3 不同桑葚酒品质的比较
Table 3 Comparison of quality of different mulberry wine
2.4 桑葚酒挥发性成分分析
香气是衡量果酒品质的重要指标之一，香气的形成过程复杂，按来源可以分为品种香、发酵香和陈酿香，其中果酒中主要的香气物质是酵母菌通过乙醇发酵转化而来，因此酵母对果酒香气的形成起着至关重要的作用[27]。将最优工艺条件下发酵的桑葚酒与酿酒酵母BO213单菌发酵的桑葚酒进行挥发性成分对比，结果见表4。由表4可知，混菌发酵桑葚酒中共检测出28种主要挥发性成分，而单菌发酵桑葚酒中只检测出22种。两种发酵方式对酯类物质种类数量影响不大，混菌发酵共检测出11种酯类，较单菌发酵多1种，但混菌发酵对乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、棕榈酸乙酯等酯类物质含量的提升较为明显，增加了桑葚酒中的果香、青草香、坚果香、玫瑰香等，使得桑葚酒更加厚重。在混菌发酵中共检测出10种醇类物质，较单菌发酵多2种，混菌发酵增加了桑葚酒中甘油、苯乙醇、苯甲醇、4-萜品醇等醇类物质的含量，同时大幅降低桑葚酒中异戊醇的相对含量，丰富了桑葚酒的感官并且使得桑葚酒的口感更加醇甜净爽。结合感官与理化指标分析，混菌发酵对桑葚酒香味与口感有显著增强，能有效提升桑葚酒的品质。
表4 桑葚酒主要挥发性成分测定结果
Table 4 Determination results of main volatile components in mulberry wine
注：“-”表示未检出。
3 结论
本研究采用异常威克汉逊酵母（Wickerhamomyces anmalus）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BO213混菌发酵桑葚酒，通过单因素试验及响应面试验优化得到桑葚酒最优发酵工艺为：异常威克汉逊酵母与酿酒酵母的接种量均为1.5%，桑葚汁与蒸馏水体积比3∶2，初始可溶性固形物含量21 °Bx，前发酵温度28 ℃。采用最优工艺制备的桑葚酒较酿酒酵母BO213单菌发酵的桑葚酒品质更优，感官评分为93.10分，酒精度为11.9%vol，总酯、总酸、挥发酸含量分别为2.42 g/L、7.95 g/L、0.84 g/L，理化指标及微生物指标均达到相关标准要求。从混菌发酵的桑葚酒中共检出28种主要挥发性成分，较酿酒酵母BO213单菌发酵的桑葚酒多6种，赋予了桑葚酒坚果、樱桃、哈密瓜、草莓等香味，在一定程度上改善了桑葚酒的品质。因此，将异常威克汉逊酵母应用于桑葚酒混菌发酵，可有效改善桑葚酒整体风味，具有一定的应用前景。
[1]杨芳，刘铁，刘燕，等.发酵型桑葚果酒主要成分动态变化规律及香气成分分析[J].食品与机械，2018，34（6）：15-20.
[2]XU X,HUANG Y Y,XU J W,et al.Anti-neuroinflammatory and antioxidant phenols from mulberry fruit (Morus alba L.)[J]. J Funct Foods,2020,68:103914.
[3]边名鸿，许强，周阳子，等.桑葚酒用非酿酒酵母的筛选及特性研究[J].中国酿造，2021，40（5）：70-75.
[4]杨新，卢红梅，杨双全，等.桑葚及桑葚果酒的研究进展[J].食品与发酵工业，2019，45（4）：257-262.
[5]陆燕，曾霞，郑克铭，等.不同品种桑葚果的风味成分分析[J].现代食品科技，2020，36（2）：232-240.
[6]TCHABO W,MA Y,KWAW E,et al.Aroma profile and sensory characteristics of a sulfur dioxide-free mulberry(Morus nigra)wine subjected to non-thermal accelerating aging techniques[J]. Food Chem,2017,232:89-97.
[7]钮成拓，李正学，范林旭，等.桑葚果酒发酵过程中功能性物质的检测及其变化情况[J].食品与发酵工业，2019，45（3）：83-88.
[8]吴均，黄传书，赵珮，等.响应面试验优化桑葚果酒发酵工艺及其品质分析[J].中国酿造，2021，40（1）：98-104.
[9]祝霞，王媛，刘琦，等.混菌发酵对贵人香低醇甜白葡萄酒的香气影响[J].食品与发酵工业，2019，45（4）：95-102.
[10]孔燕，秦凡平，覃俊，等.不同酵母对桑葚酒品质的影响及菌株筛选[J].食品与发酵工业，2020，46（22）：64-70.
[11]LIU S X,LAAKSONEN O,YANG B R.Volatile composition of bilberry wines fermented with non-Saccharomyces and Saccharomyces yeasts in pure,sequential and simultaneous inoculations[J]. Food Microbiol,2019,80:25-39.
[12] IRIS L,ANTONIO M,PIERGIORGIO C,et al.Use of Schizosaccha-romyces pombe and Torulaspora delbrueckii strains in mixed and sequential fermentations to improve red wine sensory quality[J].Food Res Int,2015,76:325-333.
[13]COMITINI F,GOBBI M,DOMIZIO P,et al.Selected non-Saccharomyces wine yeasts in controlled multistarter fermentations with Saccharomyces cerevisiae[J].Food Microbiol,2010,28(5):873-882.
[14]DAI C H,FENG X,HE R H.Effects of low-intensity ultrasound on the growth,cell membrane permeability and ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae[J].Ultrason Sonochem,2017(36):191-197.
[15] LIU Y,WANG W H,ZHOU Y H,et al.Isolation,identification and in vitro screening of Chongqing orangery yeasts for the biocontrol of Penicillium digitatum on citrus fruit[J].Biological Control,2017,4(2):18-24.
[16]JOLLY N P,VARELA C,PRETORIUS I S.Not your ordinary yeast:non-Saccharomyces,yeasts in wine production uncovered[J]. Fems Yeast Res,2014,14(2):215-237.
[17]CONTRERAS A,CURTIN C,VARELA C.Yeast population dynamics reveal a potential ′collaboration′ between Metschnikowia pulcherrima and Saccharomyces uvarum for the production of reduced alcohol wines during Shiraz fermentation[J].Appl Microbiol Biot,2015,99(4):1885-1895.
[18]VARELA C,SENGLER F,SOLOMON M,et al.Volatile flavour profile of reduced alcohol wines fermented with the non-conventional yeast species Metschnikowia pulcherrima and Saccharomyces uvarum[J].Food Chem,2016,209:57-64.
[19] VARELA C,BARKER A,TRAN T,et al.Sensory profile and volatile aroma composition of reduced alcohol Merlot wines fermented with Metschnikowia pulcherrima and Saccharomyces uvarum[J].Int J Food Microbiol,2017,252:1-9.
[20]HU K,JIN G J,XU Y H,et al.Wine aroma response to different participation of selected Hanseniaspora uvarum in mixed fermentation with Saccharomyces cerevisiae[J].Food Res Int,2018,108:119-127.
[21]张文文，翁佩芳，吴祖芳.东方伊萨酵母和酿酒酵母混合发酵杨梅酒的发酵效率及风味特征分析[J].食品科学，2019，40（18）：144-151.
[22]边名鸿，许强，周阳子，等.桑葚酒用非酿酒酵母的筛选及特性研究[J].中国酿造，2021，40（5）：70-75.
[23]曾霞，陆燕，曹建平，等.桑葚酒发酵工艺优化及其主要香气成分分析[J].酿酒科技，2016（1）：120-124.
[24]毕静莹，李华，王华.发酵温度对柑橘酒品质的影响[J].食品科学，2019，40（6）：209-216.
[25]尚远宏，田金凤.响应面法优化芒果蜂蜜果酒发酵工艺的研究[J].中国酿造，2019，38（12）：183-188.
[26]海金萍，刘钰娜，邱松山.三华李果酒发酵工艺的优化及香气成分分析[J].食品科学，2016，37（23）：222-229.
[27]祝霞，王媛，刘琦，等.混菌发酵对贵人香低醇甜白葡萄酒的香气影响[J].食品与发酵工业，2019，45（4）：8.
[28]申光辉，黎梅，王玥，等.发酵低醇西瓜果酒产香酵母的分离筛选及香气成分分析[J].食品与发酵工业，2016，42（8）：6.
[29]王媛，祝霞，杨学山，等.混菌发酵对美乐低醇桃红葡萄酒香气的影响[J].核农学报，2018，32（11）：13.