黑枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）属于茄科枸杞属多年生植物[1]，它主要分布于我国的西北地区，地貌相对复杂且干燥[2]，在国外主要分布于欧洲南部以及地中海沿岸等地区[3]。类胡萝卜素，维生素C、维生素B1、维生素B2等在黑枸杞的果实中含量较高，并且黑枸杞中还含有丰富的微量元素，如Fe、Sn、Zn等[4]。黑枸杞中富含花青素和黄酮类化合物等功能成分，具有提高免疫力、降血脂、抗疲劳等功能[5]。花青素作为黑枸杞重要功能成分之一，有着预防心脑血管疾病、抗癌、提高视力、降血脂、消炎、抗辐射以及延缓衰老等一系列作用[6-9]。
虽然黑枸杞在我国历史悠久，种植面积广，但目前在食品行业中发展较缓慢，深加工产品很少。食用黑枸杞的主要方式是加水浸泡后饮用，食用方式单一，但黑枸杞在医药以及食品方面都有很大的潜在应用价值。国内对于黑枸杞的研究大多是对于黑枸杞多糖、酚类等营养物质的测定和提取，近几年兴起了对于黑枸杞饮料的开发。刘艳怀等[10]对黑枸杞蓝莓复合饮料的配方进行了研究，研制的黑枸杞蓝莓复合饮料不仅口感细腻、醇厚浓郁，且营养价值极高，具有较好的市场发展前景。陈海魁等[11]研究黑枸杞果醋和果酒的发酵工艺，确定最优发酵条件下制得的黑枸杞果醋风味纯正，具有水果香味，是一种价值较高的营养保健型果醋。国外对黑枸杞研究多集中在花色苷组分含量以及抗氧化降血脂等活性变化，而对黑枸杞乳酸菌饮料开发却鲜有报道。
本实验选择黑枸杞为主要原料，经植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）发酵，制备黑枸杞乳酸菌发酵饮料。采用单因素试验和响应面设计试验对发酵工艺进行优化。黑枸杞乳酸菌饮料的研制，既可以满足消费者口味的多元化同时也满足人们对营养丰富产品的追求，充分研究和利用其功能成分，从而提高产品的附加值和黑枸杞的利用率，为黑枸杞功能发酵饮料开发和工业化发展奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑枸杞：市售；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）：本实验室保藏；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、冰乙酸、亚硫酸氢钠、盐酸、酒石酸钾钠、氯化钾、醋酸钠、苯酚（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-5500PC紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；JJ-2组织捣碎匀浆机：江苏杰瑞尔电器有限公司；HZQ-F100振荡培养箱：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；JYL-CO2DE多功能破壁料理机：九阳股份有限公司；GL-21M冷冻离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；QN-30压盖机：湖南省科特包装检测技术有限公司；LRH-150生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；T10分散机：广州仪科实验室技术有限公司；WYA-2W双目数字阿贝折射仪：上海精科仪电物光仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅：常州国华电器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 黑枸杞乳酸菌饮料加工工艺流程及操作要点
操作要点：
原料挑选、清洗：选择大小适中、干净无霉的优质黑枸杞，取适量的水洗涤干净，备用。
黑枸杞浆液的制备：按所需用量称取处理好的黑枸杞，并按照1∶25（g∶L）固液比加水，打浆。此时原料打浆后还原糖含量为7.32 mg/mL，可以为菌种后续发酵提供足够的碳源[12]，打浆后的原浆用四层纱布过滤，得到黑枸杞浆液。
菌种活化：将植物乳杆菌的保藏菌种培养物取出解冻，取100 μL于MRS平板上进行活化复壮后，接种到100 mL的菌液中，并放入37 ℃恒温培养箱培养24 h。
一次灭菌、接种发酵：将过滤后的黑枸杞浆液进行巴氏杀菌（65 ℃下灭菌30 min），冷却后的浆液在无菌条件下接种经过活化后的植物乳杆菌，并在37 ℃恒温条件下按照试验设计时间发酵。
离心、调配、均质：将发酵液在10 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，取上清液加入6%白砂糖并在8 000 r/min条件下均质5 min。
灌装：均质后的发酵液装入合适容器内并封口。
二次灭菌、冷却：将灌装后的发酵液进行二次灭菌（65 ℃、30 min），取出冷却至常温即可得到黑枸杞乳酸菌饮料成品。
1.3.2 黑枸杞乳酸菌饮料发酵工艺优化
（1）单因素试验
在不同接种量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、固液比（1∶40、1∶35、1∶30、1∶25、1∶20（g∶mL））、发酵时间（4 h、6 h、8 h、10 h、12 h）、装液量（20%、30%、40%、50%、60%）条件下，分别考察上述各因素对黑枸杞乳酸菌饮料花青素含量和感官评分的影响。
（2）响应面试验设计
根据单因素试验结果，选择接种量（A）、发酵时间（B）、固液比（C）、装液量（D）为影响因素，以感官评分（Y）为响应值，采用Box-Behnken试验设计4因素3水平试验，确定最佳工艺参数。Box-Behnken试验因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design
1.3.3 分析检测
可溶性固形物测定：采用折光计法[13]；总酸含量测定：参照国标GB/T 12456—2021《食品中总酸的测定》；总糖含量测定：采用苯酚-硫酸法[14]；花青素含量测定：采用pH示差法[15]；总黄酮含量测定：参考程诗韔等[16]的方法；多酚含量测定：福林酚比色法[17]，结果以没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）表示。
微生物指标测定：按照国标GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》、GB 4789.3—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》、GB29921—2021《预包装食品中致病菌限量》分别检测成品的菌落总数、大肠菌群及致病菌[18-20]。
1.3.4 感官评价
以10人组成品尝小组，对黑枸杞乳酸菌发酵饮料的色泽、风味、口感、组织状态进行评定，满分10分。感官评分标准见表2。
表2 黑枸杞乳酸菌饮料感官评分标准
Table 2 Sensory scoring standards of black wolfberry Lactobacillus beverage
1.3.5 数据处理
采用Origin9.5和Design ExpertV8.0.6等软件对试验数据进行绘图以及处理分析，每组试验3次平行，P＜0.01代表差异极显著，P＜0.05代表差异显著。
2 结果与分析
2.1 黑枸杞乳酸菌发酵饮料工艺优化单因素试验
2.1.1 接种量的确定
由图1可知，当接种量为1.0%～2.0%时，感官评分和花青素含量随着接种量的增加逐渐上升；当接种量为2.0%时，感官评分和花青素含量均达到最高，分别为49.60 mg/L和8.2分；当接种量＞2.0%之后，感官评分和花青素含量逐渐下降。因为过多的接种量会使饮料过度发酵导致其口感过酸影响评分。接种量低时发酵初期菌种繁殖慢，发酵不充分可能会导致花青素类物质溶出率低。如果接种量太高，那么乳酸的浓度就会很高，在发酵初期乳酸快速增加时就会导致乳酸在短暂的一段时间内大量消耗糖分，从而使其增加了发酵液中的水活性，产生过多的代谢物也可能会直接加速其对花青素的分解，从而降低其含量[21]。同时过高或者是过低的初始接种量均不太合适用于酿制发酵的饮料。因此，确定最佳接种量为2%。
图1 不同接种量对乳酸菌饮料感官评分和花青素含量的影响
Fig.1 Effect of different inoculum on sensory score and anthocyanin contents of lactic acid bacteria beverage
2.1.2 固液比的确定
由图2可知，当固液比在1∶40～1∶25（g∶mL）范围内的增大，花青素含量和感官评分均随之有所增高；当固液比为1∶25（g∶mL）时；花青素含量和感官评分均达到最大值，分别为48.04 mg/L和8.5分；随着固液比的增加，可溶物固形物含量和其他的营养物质也随之增加，利于乳酸菌生长；但当固液比过高时，发酵液的浓度过高，水分活度的降低和溶解氧的减少影响了乳酸菌的生长[21]。随着固液比的增加，饮料的颜色会变得越来越深，当深度超过一定值时，色泽评分会极低，所以感官评分在达到最高点之后会下降。因此，确定最佳固液比为1∶25（g∶mL）。
图2 不同固液比对乳酸菌饮料感官评分和花青素含量的影响
Fig.2 Effect of different solid and liquid ratio on sensory score and anthocyanin contents of lactic acid bacteria beverage
2.1.3 发酵时间的确定
由图3可知，当发酵时间为4～6 h时，花青素含量和感官评分均随之增高；当发酵时间为6 h时，花青素含量和感官评分均达到最大值，分别为50.77 mg/L和8.8分；当发酵时间＞6 h之后，花青素含量和感官评分均有所下降。这些菌种不断利用发酵底物中的糖产生酸，积累乳酸并继续产生酸，从而提高产品的酸度。乳酸菌的发酵不仅可以增加产品的酸度，而且对产品的风味和花青素的溶出也有很好的促进作用，因此感官评分和花青素含量也有所提高。发酵6 h后产酸过多口感变差感官评分开始逐渐下降，同时产生过多的代谢产物可能会导致其花青素分解含量降低。因此，确定最佳发酵时间为6 h。
图3 不同发酵时间对乳酸菌饮料感官评分和花青素含量的影响
Fig.3 Effect of different fermentation time on sensory score and anthocyanin contents of lactic acid bacteria beverage
2.1.4 装液量的确定
由图4可知，当装液量为20%～40%时，花青素含量和感官评分均随之增高；当装液量为40%时，花青素含量和感官评分均达到最大值，分别为48.43 mg/L和8.9分；当装液量＞40%之后，花青素含量以及感官评分均开始下降。这是因为装液量过高会导致饮料口感过于寡淡，同时菌种的发酵与环境有着密切的关系。植物乳杆菌是一种异养厌氧型微生物，当瓶子里的氧气耗尽时，它开始进行厌氧呼吸，水分活度和溶解氧的多少会影响乳酸菌的生长进而影响感官评分及花青素的含量[22]。因此，确定最佳装液量为40%。
图4 不同装液量对乳酸菌饮料感官评分和花青素含量的影响
Fig.4 Effect of different liquid loading volume on sensory score and anthocyanin contents of lactic acid bacteria beverage
2.2 黑枸杞乳酸菌饮料发酵工艺优化响应面试验
2.2.1 响应面设计及方差分析
根据单因素试验结果，以接种量（A）、发酵时间（B）、固液比（C）和装液量（D）为自变量，感官评分（Y）为因变量进行响应面试验，Box-Behnken试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments
续表
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
采用Design Expert 8.0.6软件对表3数据进行二次回归方程拟合，二次多项回归方程：
由表4可知，回归方程模型的P值＜0.000 1，极显著；失拟项P值为0.561 3＞0.05，不显著，说明建立的回归方程拟合良好。决定系数R2=0.994 3，表明99.43%的变化可以由这个模型来解释。由F值可以看出，对感官评分的影响顺序为发酵时间＞装液量＞固液比＞接种量。由P值可知，一次项B、C、D，交互项AC、AD、BD，二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01）。
2.2.2 各因素交互作用响应面分析
采用Design Expert 8.0.6软件对影响黑枸杞乳酸菌饮料发酵工艺的4个因素进行交互分析，各因素交互作用对结果影响的响应面及等高线见图5。
图5 各因素交互作用对乳酸菌饮料感官评分影响的响应面和等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the sensory score of lactic acid bacteria beverage
该模型可用于拟合两个因素之间相互作用的响应面图，并且能够进一步研究各因素之间的相互作用强度。由图5可知，AC、AD和BD因素之间的相互作用是显著的，这表现为椭圆的等高线形状。AB、BC和CD因素之间的相互作用不显著，等高线形状为圆形。接种量与固液比、接种量与装液量以及发酵时间与装液量的响应面曲线比较陡峭，因此，对感官的影响最显著，而接种量和发酵时间、发酵时间与固液比以及固液比与装液量的响应面曲线比较平缓，响应值的变化随其数值的变化较小，所以对感官评价的影响也较小。
2.2.3 验证试验
采用Design ExpertV8.0.6软件对回归模型进行分析，得到最佳发酵工艺条件为：接种量1.98%，发酵时间5.7 h，固液比1∶25.26（g∶mL），装液量40.16%。在此条件下，感官评分的理论值为9.28分。为了便于实际操作，将最佳发酵工艺条件修正为：接种量2%，固液比1∶25（g∶mL），发酵时间6 h，装液量40%。在上述条件下进行3次重复验证试验，黑枸杞发酵饮料的感官评分实际值为9.3分，与理论预测值相近，说明该模型与实际情况有较好的对应关系，可以用于优化黑枸杞发酵饮料的发酵工艺参数。
2.3 产品质量评价
感官指标：该产品无沉淀、呈均匀的紫色、酸甜细腻的口感、乳酸菌发酵的浓郁香气；理化指标：成品中总糖含量为0.17 mg/mL，总酸含量为1.69 g/L，可溶性固形物含量为7%；微生物指标：细菌总数＜100 CFU/mL；大肠菌群＜3 MPN/100 mL；致病菌未检出。
2.4 功能性成分分析
由图6可知，黑枸杞汁经过植物乳杆菌发酵后的总酚含量高达0.988 mg/mL，较未经发酵的黑枸杞汁中总酚含量提升了11.34%，可能是因为酚类物质有两种状态形式分别为游离和结合状态，结合状态又分为不溶性共价结合酚和可溶性共价结合酚[23]，可溶性共价结合酚可与长链脂肪酸、长链醇等物质相连[24]，在乳酸菌发酵过程中，各种酶作用于底物，可使黑枸杞汁中的可溶性结合酚释放，从而使总酚含量增加。接种乳酸菌发酵的产品中花青素含量要高于未接种的黑枸杞汁，这与高辰哲等[25]的结果一致，可能是因为乳酸菌发酵促进了花青素的溶出同时产生酸性环境使花青素更加稳定，具体机理还需进一步深入研究。未接菌的黑枸杞汁中总黄酮含量为0.066 mg/mL。经过发酵后，黑枸杞汁的总黄酮含量有所增加，但与未发酵相比含量增加不显著（P＞0.05）。赖婷等[26]研究发现，植物乳杆菌的发酵可以将结合的类黄酮释放为游离的类黄酮，从而增加总的类黄酮含量，这可能是导致本研究总黄酮含量增加的原因之一，具体变化的原因可能与酶的复杂作用和黄酮类本身的不稳定性有关。
图6 黑枸杞汁发酵前后总酚、总黄酮及花青素含量测定结果
Fig.6 Determination results of total phenols,total flavonoids and anthocyanin contents of black wolfberry juice before and after fermentation
不同小写英文字母表示差异显著（P＜0.05）。
3 结论
本研究选用黑枸杞作为试验主要原料，通过植物乳杆菌发酵，采用单因素试验以及响应面法优化得到黑枸杞乳酸菌饮料的最优发酵工艺条件为：固液比为1∶25（g∶mL），植物乳杆菌接种量2.0%，温度37 ℃下发酵6 h，装液量40%。在此优化条件下，黑枸杞乳酸菌饮料感官评分为9.3分，色泽均匀，酸甜可口，口感细腻柔和。功能性成分含量分析结果显示，黑枸杞汁经接种发酵后得到的饮料中总酚、总黄酮和花青素含量均比未接种的黑枸杞汁有所上升，由此可知，通过工艺优化后不仅可以增加黑枸杞发酵饮料中的功能性成分含量并且使其拥有了较高的感官品质和乳酸菌的益生作用，提高了黑枸杞利用率的同时也满足了人们对营养丰富、具有保健功效产品的追求，说明此优化后的产品可以为进一步开发黑枸杞发酵饮料提供参考依据。
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