腐乳又名豆腐乳，霉腐乳等，是一种利用微生物法改变植物蛋白风味的传统大豆发酵制品，至今已有一千多年历史，因其口感鲜美，营养丰富，物美价廉，受到广大群众喜爱，是一种常见的调味品[1]。目前，腐乳生产主要集中在中国、日本、韩国及东南亚一带。在制作腐乳方法上主要以传统腐乳制作工艺为主，制作过程中弃去豆渣，这种方法导致产品出品率低，不仅降低企业利润，还增加了企业处理豆渣的成本，且豆渣含水量高，如不及时处理极易变质，导致环境污染。然而豆渣不仅并非工业废物，还具有较高的营养价值和食用价值，其蛋白质含量为22.56%，脂肪含量为19.70%，碳水化合物含量为37.99%，纤维素含量为14.62%[2]，有关研究称豆渣可作为人体抗氧化的潜在资源，其水解物在体外表现出更强的抗氧化性，在体内测试时，增强了免疫调节活性。但豆渣直接利用其营养价值并不高且口感粗糙，因此对豆渣改性是提高豆渣价值的重要步骤。
目前，豆渣改性主要是机械法、生物发酵法和水解法等，其中生物发酵法成本最低，产率最高，并能有效提高豆渣中营养成分，降解的豆渣降低了不适口的渣感，提高了消化率。李艳芳等[3]用黑曲霉和米曲霉复合发酵豆渣，改善了豆渣粗糙的口感。莫重文等[4]用米曲霉、黑曲霉和酿酒酵母混合菌进行豆渣发酵，利用霉菌降解豆渣中的纤维素等物质变成低分子质量的糖类，再利用酵母菌在生长繁殖过程中将糖类物质与无机氮合成菌体蛋白，使豆渣蛋白含量比原始蛋白含量增加43.1%。
与传统腐乳相比，全豆腐乳不需要弃渣，尽可能多的保留营养成分。目前，全豆腐乳的制备难点体现在两方面，一方面体现在磨浆工艺上，传统腐乳制备白坯过程中磨浆滤出的浆渣颗粒比较大，用直接过滤出的豆渣制作腐乳，其口感过于粗糙，消费者难以接受，除此之外如果磨浆细化程度不够，制作出的全豆腐乳还会出现质地粗糙的问题；另一方面体现在点卤工艺上，豆渣中含有大量的不溶性膳食纤维和多糖，不溶性膳食纤维会在凝固过程阻碍蛋白形成有序网络结构，而多糖则会参与凝胶网络结构的形成，这就导致生产出的白坯硬度不好，结构松散[5]。鉴于此，本研究选用黑曲霉发酵豆渣，对豆渣进行纤维细化，再以发酵后豆渣作为腐乳制作原料之一，在白坯制作过程中进行回填，通过发酵改善豆渣不适口的渣感，提高了豆渣的营养价值，使其更易被消化吸收。通过此工艺制作出的腐乳，不仅提高了腐乳中的营养成分，而且提高了出品率。实现了高效利用资源，减少浪费，降低环境污染，为豆渣的综合利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
大豆（黑河43号）：国家大豆产业体系岗位科学家鹿文成研究员提供；新鲜豆渣：取适量大豆加入5倍体积的水在阴凉处浸泡16 h，磨浆完成后使用80目纱布过滤豆渣并挤压至无法继续挤出豆浆，此时分离出的豆浆即为生浆，出渣率为141%，滤出物为豆渣，生浆与豆渣保存待用。
1.1.2 菌株
五通桥毛霉（Mucor wutung kiao）PR9.00151：朱老六食品股份有限公司；黑曲霉孢子粉（Aspergillus niger）hi3.042：山东和众康源生物技术有限公司。
1.1.3 化学试剂
98%浓硫酸、硼酸、体积分数95%乙醇、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、2-（N-吗啉代）乙烷磺酸（2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid，MES）、无水乙醇（分析纯）：北京化工厂；溴甲酚绿：中国公私合营新中化学厂；丙酮、石油醚（沸程30～60 ℃）：北京鼎国生物技术有限责任公司、甲醇、乙腈（均为色谱纯）：美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
ZEISS-EVO18型扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）：德国卡尔蔡司公司；TA.new plus型质构分析仪：上海瑞玢国际贸易有限公司；KL 04-A型离心机：美国Agilent公司；GZX-9140 MBE型电热恒温鼓风干燥箱：博讯实业有限公司医疗设备厂；BK-FD 10S冷冻干燥机：济南欧莱博技术有限公司；6890N-5975B气相色谱质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪、1260液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：安捷伦科技公司；100 μL PDMS 萃取纤维头固相微萃取针、HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国SUPELCO公司；BR4I离心机：赛默飞世尔（中国）有限公司；LA 8080氨基酸自动分析仪：日本株式会社日立高新技术集团；大豆脱皮机：山东誉亚大豆机械有限公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程
（1）传统腐乳制备工艺
大豆→去皮→浸泡→磨浆→浆渣分离→煮浆→点脑→蹲脑→压制→划坯→白坯→接菌→前发酵→装瓶→灌汤封口→装箱→后发酵→传统腐乳成品
大豆经脱皮机进行脱皮处理，经过清洗、浸泡（5倍体积的水在阴凉处浸泡16 h）、滤干、磨浆、浆渣分离；煮浆后进行点脑及蹲脑，将蹲脑后的豆腐进行压制成型，然后进行划坯处理，形成白坯；将白坯进行接菌和前发酵处理；发酵和腌制后装瓶、灌汤封口、装箱、送入发酵库房进行后发酵，发酵温度25 ℃，湿度32%，经60 d发酵后得到传统腐乳成品。
（2）黑曲霉全豆腐乳制备工艺
大豆→去皮→浸泡→磨浆→浆渣分离→黑曲霉发酵豆渣→发酵后豆渣→浆渣混合→胶体磨研磨→煮浆→点脑→蹲脑→压制→划坯→白坯→接菌→前发酵→装瓶→灌汤封口→装箱→后发酵→黑曲霉全豆腐乳成品
与传统腐乳工艺不同的是，预实验中黑曲霉接种量为底物的0.8%、发酵温度35 ℃、发酵时间72 h，在此条件下可溶性固形物含量最高，以此作为发酵条件，将豆渣进行黑曲霉发酵，并将发酵好的豆渣与豆浆混合，制备黑曲霉全豆腐乳。
1.3.2 品质指标的测定
水按照商业标准SB/T 10170—2007《腐乳》[6]中的方法进行感官评定并测定水分含量、氨基酸态氮、水溶性蛋白质、总酸、和食盐含量；总膳食纤维按照国标GB 5009.88—2014《食品中膳食纤维的测定》[7]中的方法进行测定；氨基酸组成按照国标GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》[8]中的方法进行测定；大豆皂苷按照国标GB/T 22464—2008《大豆皂苷》[9]中的方法进行测定；大豆异黄酮按照国标GB/T 26625—2011《粮油检验大豆异黄酮含量测定高效液相色谱法》[10]中的方法进行测定；蛋白体外消化率按照国标GB/T 17811—2008《动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定过滤法》[11]中的方法进行测定。
1.3.3 微观结构
使用扫描电镜对三种腐乳进行微观结构观察。将腐乳切成1 cm3大小的正方体进行冷冻干燥，冷冻干燥结束后用导电双面胶固定在样品台上用离子溅射仪进行样品表面喷金，喷金后放置于扫描电子显微镜下观察。在20 kV条件下观测结果[12]。
1.3.4 质构特性
选取块型整齐均匀的黑曲霉全豆腐乳、全豆腐乳和传统腐乳，除去汤汁和腐乳外表皮，置于质构仪操作台中央，采用质地剖面分析（texrue profile analysis，TPA）模式测定腐乳质构特性。仪器使用参数：探头型号：TA/36R柱状探头；探头直径：36 mm；测试前速度：1 mm/s；测试速度：1 mm/s；测试后速度：1 mm/s；触发力：5 g。测定参数：弹性、硬度、黏着性、咀嚼性、内聚性。同一品种腐乳3个平行，取平均值[13]。
1.3.5 出品率的测定
称量腐乳成品质量m1和使用大豆质量m2[20]。按公式（1）计算得出腐乳的出品率。
1.3.6 持水性的测定
称取均匀的样品记为m1，将其置于离心管中，在20 ℃10 000×g条件下离心10 min，吸取洗出的水分后，称质量记为m2，随后将样品置于105 ℃烘箱中干燥6 h，对干燥后的样品进行称质量，记为m3[21]。持水性计算公式（2）如下。
1.3.7 挥发性风味物质GC-MS分析
固相萃取样品制备：称取适量样品置于顶空瓶中，密封，置于80 ℃水浴中平衡30 min，保持温度用固相微萃取针萃取30 min，待萃取结束后，将萃取针头拔出，插入GC-MS进样器中解吸5 min[15]。
同时蒸馏萃取法：取10 g样品置于装置一端的1 L圆底烧瓶中，加适量水，电热套加热。装置另一端盛有30 mL二氯甲烷的萃取瓶，60 ℃水浴加热，同时蒸馏萃取3 h。冷却，加入少许无水硫酸钠去除水分，4 ℃静置过夜，旋蒸仪浓缩至1 mL，密封，4 ℃保存供GC-MS定性分析。
气相色谱和质谱分析条件：色谱柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：起始温度：50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速率升至180 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min的速率升至250 ℃，保持5 min。进样口温度：250 ℃；载气氦气（He），载气流速：1.2 mL/min；分流比：不分流。载气流量：恒压12 psi；不分流；恒流1.2 mL/min；传输线温度280 ℃；离子源温度：230 ℃；四级杆温度：150 ℃；电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源；电子能量70 eV；扫描方式：全扫描[16]。
挥发性风味物质的确定：采集到的质谱图利用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）谱库进行检索，鉴定样品中的挥发性成分，并利用面积归一法分析各成分的相对含量[17]。
1.3.8 统计分析
所有试验均至少重复三次组间平行试验，结果以“平均值±标准差”表示。使用Microsoft Office 2016进行数据整理，IBM SPSS Statistics 20进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 腐乳的指标
测定黑曲霉全豆腐乳和传统腐乳的感官指标、理化指标以及微生物指标并进行比较，结果分别见表1～表3。
表1 两种腐乳感官指标的测定结果
Table 1 Determination results of sensory indexes of two kinds of fermented bean curd
表2 两种腐乳理化指标的测定结果
Table 2 Determination results of physiochemical indexes of two kinds of fermented bean curd
表3 两种腐乳微生物指标的测定结果
Table 3 Determination results of microbial indexes of two kinds of fermented bean curd
注：n为同一批次产品应采集的样品件数；c为最大可允许超出m值的样品数；m为微生物指标可接受水平的限量值；M为微生物指标的最高安全限量值。
由表1～表3可知，黑曲霉全豆腐乳断面呈黑褐色，有光泽；味道鲜美适口，咸味适中；具有腐乳特有气味，无不良气味；块型整齐，质地细腻，与传统腐乳相比，黑曲霉全豆腐乳色泽更深，呈黑褐色。黑曲霉全豆腐乳中的水分、氨基酸态氮、水溶性蛋白质、总酸、食盐的含量分别为66.77%、0.44 g/100 mL、5.13 g/100 mL、0.55 g/100 g、10.07 g/100 g；两种腐乳中大肠菌群＜10 MPN/100 mL，致病菌沙门氏菌均未检出，金黄色葡萄球菌＜10 CFU/mL。结果表明，两种腐乳都满足SB/T 10170—2007《腐乳》要求。
2.2 微观结构
为了更好地探究黑曲霉全豆腐乳与传统腐乳之间在微观结构方面的差异，将两种腐乳的微观结构进行对比，SEM结果见图1。由图1可知，黑曲霉全豆腐乳的结构较平整，并且无可见的纤维组织结构；传统腐乳的三维结构多孔且不紧密。
图1 两种腐乳的扫描电镜结果
Fig.1 Scanning electron microsope of two kinds of fermented bean curd
a：黑曲霉全豆腐乳；b：传统腐乳
2.3 质构特性
三两种腐乳的质构特性结果见表4。由表4可知，两种腐乳的部分质构特性存在显著差异（P＜0.05）；黑曲霉全豆腐乳的弹性和内聚性略高于传统腐乳，而硬度、黏着性和咀嚼性显著高于传统腐乳（P＜0.05），黑曲霉全豆腐乳细软程度可能较低，口感上可能不及传统腐乳。黑曲霉全豆腐乳的质构特性表现优良，主要是因为豆渣经黑曲霉发酵后产生的多糖类物质与腐乳中蛋白质产生共价键与非共价键[18]，共价键导致了蛋白质-多糖化合物具有更高的热稳定性，非共价键产生的凝聚层改变了腐乳的质地。由此可见，多糖导致了黑曲霉全豆腐乳在结构上发生了改变，而且结合SEM图得出，黑曲霉全豆腐乳在质构特性上不仅与传统腐乳接近，甚至在弹性、硬度、黏着性、咀嚼性、内聚性等方面优于传统腐乳。
表4 两种腐乳的质构特性
Table 4 Texture properties of two kinds of fermented bean curd
注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
2.4 出品率、持水性及蛋白体外消化率
出品率是腐乳生产中重要的指标。由表5可知，黑曲霉全豆腐乳出品率为171.67%，传统腐乳出品率为158.33%，相较于传统腐乳，黑曲霉全豆腐乳显著提高了8.43%。较高的出品率，对食品未来加工来讲，既提高了豆渣的使用效率，也减少了环境污染。黑曲霉全豆腐乳持水性低于传统腐乳，黑曲霉全豆腐乳持水性为75.17%，传统腐乳持水性为77.67%。
表5 两种腐乳的出品率、持水性与蛋白体外消化率
Table 5 Production yield,water holding capacity and protein digestibility of two kinds of fermented bean curd
蛋白质的消化率是指食物蛋白被消化酶解的程度，是一种评价食物营养价值的重要指标，食物蛋白质的消化率越高，蛋白质被消化吸收的越彻底，食物的营养价值就越高。由表5可知，黑曲霉全豆腐乳的蛋白消化率要高于传统腐乳（P＞0.05），由于添加黑曲霉发酵后豆渣制作的腐乳，其产生的糖类等物质及被细微化的纤维素增加了消化酶与大豆蛋白的结合位点，从而促进了酶解反应的进行，提高了黑曲霉全豆腐乳的蛋白消化率。
2.5 活性成分含量
测定两种腐乳的活性成分含量，结果见表6。由表6可知，黑曲霉全豆腐乳与传统腐乳的总膳食纤维含量存在显著性差异（P＜0.05）。相同发酵条件下，黑曲霉全豆腐乳的膳食纤维含量高于传统腐乳。而黑曲霉全豆腐乳大豆皂苷含量显著低于传统腐乳（P＜0.05）。其主要原因是在白坯制作过程中，经过高温煮浆、点卤、制坯等工序，大豆皂苷随着黄浆水一同流失一部分，经黑曲霉发酵过的豆渣对豆渣的水解更彻底，产生的大豆皂苷也更多，结合大豆皂苷易溶于热水的特性，在煮浆过程中，大豆皂苷流失更多，故黑曲霉全豆腐乳含量更低。
表6 两种腐乳的活性成分含量
Table 6 Active ingredient content of two kinds of fermented bean curd
传统腐乳的异黄酮含量显著高于黑曲霉全豆腐乳（P＜0.05），这与豆渣的加入和发酵过程密切相关；黑曲霉发酵豆渣过程中，黑曲霉产生的蛋白酶和纤维素酶产生了大量的氨基酸、单糖、醛及酮类物质，通过一系列反应合成异黄酮，使豆渣中异黄酮含量增加[19]；在煮浆过程中温度达到95 ℃以上，根据马玉荣等[20-21]的研究可知，95 ℃以上短时处理豆浆异黄酮含量会减少。
2.6 挥发性风味物质含量
腐乳的香气作为重要的感官指标，决定着腐乳品质的好坏，而香气取决于挥发性风味物质的成分，它们通常受原材料、微生物、生产工艺、加工环境等因素影响，2种腐乳的挥发性成分及其组分含量测定结果见表7。
表7 两种腐乳的挥发性成分及其组分含量
Table 7 Volatile components and contents of two kinds of fermented bean curd
续表
注：“-”为未检出。
由表7可知，2种腐乳通过同时蒸馏萃取（simultaneous distillation and extraction，SDE），结合气质联用（gas chromatogrophymass spectrometry，GC-MS）法测定出挥发性物质77种，黑曲霉全豆腐乳检出物质39种，其中酯类占风味物质种类总数25.64%，烃类占12.82%，醇类占10.26%，酸类占7.69%；传统腐乳检出物质40种，其中酯类占风味物质种类总数的30%，烃类27.5%，醛类17.5%，醇类7.5%。
在发酵过程中，腐乳中的风味物质含量及种类不断增加，酯类物质尤为突出，由表8可知，两种腐乳酯类物质含量均较高，共同检出的酯类主要有辛酸乙酯、十六烷酸乙酯、（Z,Z）-9,12-十八烷二烯酸乙酯、油酸乙酯、硬脂酸乙酯等，他们构成了腐乳的主体风味。
在腐乳中，烃类物质主要来源于脂肪的分解和调料的添加，烃的香气不明显，故对腐乳风味增益不大。酯类物质在腐乳发酵过程中的酯化反应产生的，能赋予腐乳花香、果香[22-23]。黑曲霉全豆腐乳由于添加改性豆渣，形成了一些传统腐乳没有的风味物质，如1-辛烯-3-醇、2,3-三甲基-环戊基乙醇、3-苯基-1,2,4-三氧杂环戊烷、7-十六烷、乙酸乙酯、丁二酸单乙酯、十一酸乙酯、一氯乙酸十三烷基酯、亚麻酸乙酯、辛酸、棕榈油酸等物质，这些物质使黑曲霉全豆腐乳的风味更独特。
从两种腐乳中共检出11种醛类物质，分别为异丁醛、异戊醛、2-甲基丁醛、正戊醛、正己醛、3-甲硫基丙醛、苯甲醛、苯乙醛、2-苯基巴豆醛、乙醛、（Z）-13-十八碳烯醛。2-甲基丁醛具有坚果香，正戊醛具有强烈辛辣味，正己醛具有青草味，苯甲醛具有苦杏仁味，苯乙醛具有风信子香；腐乳中的醛类化合物主要通过Strecker反应或由醇、酚等物质氧化而成[24]。
由表7可知，黑曲霉全豆腐乳的醇类和酚类物质含量远高于传统腐乳，故黑曲霉全豆腐乳形成的醛类物质含量最高，种类最多，这些醛类物质为黑曲霉全豆腐乳增添了独特风味。而黑曲霉全豆腐乳最大的不同在于含有含硫类物质及吲哚类物质，根据孙娜等[25]对菌属与风味物质相关性分析表明，明珠串菌（Leuconostoc）、盐厌氧菌属（Halanaerobium）与含硫化合物、吲哚形成密切相关，且风味形成发生在发酵后期。说明本研究中黑曲霉全豆腐乳在后发酵过程中，形成了利于明珠串菌（Leuconostoc）、盐厌氧菌属（Halanaerobium）等菌群的生存环境，从而产生了含硫类物质和吲哚类物质，其丰富了黑曲霉全豆腐乳的特征香气。
2.7 氨基酸组成与分析
由表8可知，两种腐乳共测出17种氨基酸，传统腐乳总氨基酸含量为31.73 g/100 g，其中必需氨基酸含量为11.47 g/100 g，非必需氨基酸含量为20.26 g/100 g；黑曲霉全豆腐乳总氨基酸含量为26.58 g/100 g，其中必需氨基酸含量为9.57 g/100 g，非必需氨基酸含量为17.01 g/100 g。氨基酸的组成与含量除了与原料有关外，与发酵过程中的微生物群落与结构也紧密相关。传统腐乳在各项氨基酸组成上高于黑曲霉全豆腐乳，其原因是由于豆渣的加入，势必会导致全豆腐乳和黑曲霉全豆腐乳在蛋白含量上稍逊于传统腐乳，在后发酵过程中，各种酶系作用下氨基酸的含量也势必受到影响。
表8 两种腐乳氨基酸组成及含量测定结果
Table 8 Amino acid composition and contents of two kinds of fermented bean curd
注：*为必需氨基酸。
3 结论
添加黑曲霉发酵豆渣的黑曲霉全豆腐乳呈黑褐色，有光泽；味道鲜美适口，咸味适中；具有腐乳特有气味，无不良气味；块型整齐，质地细腻，其水分、氨基酸态氮、水溶性蛋白质、总酸、食盐的含量分别为66.77%、0.44 g/100 mL、5.13 g/100 mL、0.55 g/100 g、10.07 g/100 g，达到相关国标要求。通过微观结构表征可知，其三维结构显示纤维组织在各种酶系的水解作用下已完全被破坏，并且无可见的纤维组织结构，说明黑曲霉对豆渣粗纤维的分解效果十分优良；在质构特性中硬度、黏着性和咀嚼性表现优良；出品率达到171.67%；持水性达到75.17%；总膳食纤维达到22.6 g/100 g；大豆皂苷达到0.33 g/100 g；大豆异黄酮为466.2 mg/kg；蛋白体外消化率达到94.63%；挥发性风味物质共检出39种；氨基酸共检出17种；本研究结果说明：黑曲霉全豆腐乳可作为替代传统腐乳的新产品，解决了豆制品企业存在的新鲜豆渣大量堆积腐败变质和低值化利用问题并提高了腐乳出品率，具有进一步发展或者扩大生产的价值，为豆渣高值化加工提供了途径。
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