树莓是蔷薇科悬钩子属的一种落叶灌木的聚合浆果。树莓富含多种抗氧化活性成分，被誉为“第三代黄金水果”[1-2]。树莓果酒颜色艳丽、香气浓郁、口感独特，作为一种新型的健康商业饮品正在兴起[3]。
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是果酒酒精发酵的主导微生物[4-5]。在发酵过程中，酿酒酵母的生长代谢会引起果酒中各种物质组分的变化，从而影响着果酒的品质[6-9]。树莓中有机酸含量高，且柠檬酸比重大，导致红树莓果酒产品口感不佳。生物降酸是指微生物以有机酸为碳源，利用并分解，从而达到降酸目的。在果酒酿造中，通常采用苹果酸乳酸发酵法来降酸，但不能对柠檬酸起到降酸效果。有研究表明，有些酿酒酵母菌可以通过相关代谢降解有机酸[8]。陈思睿等[10-11]对红树莓果园土壤和鲜果上的微生物进行分离纯化，筛选出具有较强降解柠檬酸能力的菌株，这些菌株经鉴定均属于非酿酒酵母，其被推荐应用于红树莓果汁的降酸处理。目前，商业酿酒酵母对树莓有机酸组成影响的研究较少。
树莓果酒中的酚类物质在感官质量、抗氧化活性等方面发挥着重要影响[12-13]，它可分为花色苷酚和非花色苷酚[13]。树莓果酒的一个重要特点是颜色靓丽，但在存贮过程中，颜色容易加深褐化。果酒的视觉特性主要是由花色苷酚引起的，但花色苷酚与非花色苷酚类物质的相互作用对视觉的影响更为重要[14-16]。另外，非花色苷酚还会对果酒口感特征也产生重要影响[14]。
以往树莓果酒酿酒酵母的筛选研究多集中在理化指标、抗氧化活性、香气分析上[11-12，17-18]，对有机酸和非花色苷酚物质影响的研究报道较少。该实验采用山西地区的秋福树莓冻果为原料，考察了5种商业酿酒酵母对树莓果酒发酵曲线、理化指标、有机酸组分及非花色苷单体酚组分及感官指标的影响，以筛选出能体现树莓原料特征的酿酒酵母。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
秋福树莓：2020年9月在山西省繁峙县大木瓜村采集（成熟度超过80%）；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CECA、BV818：湖北安琪酵母股份有限公司；酿酒酵母71B：烟台帝伯仕贸易有限公司；酿酒酵母VP5、Montrachet：意大利VASON公司
Color果胶酶（酶活30 000 U/g）：德国AB酶试剂公司。
有机酸的标准物：草酸、酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、醋酸、柠檬酸、琥珀酸（均为色谱纯）；单体酚的标准物：原花青素、香草酸、水杨酸、鞣花酸、没食子酸、绿原酸、咖啡酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、山奈酚、槲皮素标准品（均为色谱纯）；上海安谱实验科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenyl，DPPH）：美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
LC-1260Ⅱ型高效液相色谱仪：美国安捷伦科技公司；Innoval ASB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和NH2色谱柱（9 mm×250 mm，4.6 μm）：美国色谱科公司；QTRAP 4500 LC/MS液相色谱质谱联用仪：美国AB SCIEX公司；Thermo Hypersil GOLD C18液相色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）：美国热电公司；WGZ-200浊度仪：上海仪电物理光学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 树莓果酒的酿制
树莓冻果自然解冻后，加入保护剂偏重亚硫酸氢钾（30 mg/L）破碎；加入
Color果胶酶30 mg/kg，在50 ℃条件下进行酶解1.5 h，每30 min搅拌一次；酶解浸渍结束后，迅速降温，并压榨出汁；在4～5 ℃条件下，静置沉淀24 h后，将清汁分离，测清汁的酸度、糖度、pH；配制碳酸氢钾母液（100 g/L），调节pH至3.2；加入葡萄糖，调整起始糖度为21 °Bx。均质化后的果汁分装到5 L玻璃瓶中，控制温度于15～18 ℃储藏。活化商业酵母（VP5、Montrachet、71B、BV818、CECA）按200 mg/L接种，并加入200 mg/L营养剂，启动发酵；每天监测两次pH、糖度、温度；待发酵彻底结束，倒罐，加入50 mg/L的偏重亚硫酸氢钾，密闭低温陈酿三个月后取样检测，期间倒罐一次。
1.3.2 发酵曲线绘制
发酵曲线是用来表示微生物发酵过程的动态情况，每12 h测一次糖度，以发酵时间为横坐标，以果酒糖度为纵坐标，绘制发酵曲线。
1.3.3 理化指标的测定
pH、可滴定酸、残糖等指标的测定参考GB/T 15038—2006《葡萄酒果酒分析方法》；乙醇含量的测定参考文献[5]；色度以酒样在波长420 nm、520 nm、620 nm处吸光度值加和来表示；浊度使用WGZ-200浊度仪测定；总酚含量采用Folin酚比色法测定，结果以mg没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）/L表示[19]；DPPH自由基清除率的测定参考文献[19]；糖度用手持糖度计测定。
1.3.4 高效液相色谱测定有机酸和甘油
酒样品8 000×g离心5 min后，用0.22 μm滤膜过滤后进行分析。采用Innoval ASB C18色谱柱分离有机酸，流动相为0.1 mol/L H3PO4，流速1.0 mL/min，总运行时间7 min，紫外-可见光谱检测波长214 nm。
甘油测定采用NH2柱（9 mm×250 mm，4.6 μm），使用流动相为乙腈∶水（85∶15，V/V），流速为1.0 mL/min，采用RI-II检测器进行检测。样品需用流动相稀释10倍。样品进行3次平行测定[20]。
1.3.5 高效液相色谱-质谱测定非花色苷单体酚
10 mL树莓果酒样品分别在pH 7.0和pH 2.0条件下用120 mL乙酸乙酯分六次提取。提取液混合后，采用真空旋转蒸发器上蒸发干燥，温度设置35 ℃。干残渣用10 mL甲醇溶解后，通过0.22 μm有机膜过滤后进入高效液相色谱-质谱系统。色谱柱为Thermo Hypersil GOLD C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），进样量为5 μL。流动相A、B分别为0.1%甲酸水和乙腈，流速为0.30 mL/min。单体酚分离梯度程序为0 min，5%；0.5 min，5%；2 min，95%；4 min，95%；1 min，5%；5 min，5%。采用电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）负离子模式对12种单体酚进行了质谱分析。毛细管源温度为600 ℃，护套气体流量为60 m3/h，辅助气体流量为10 m3/h，喷雾电压设置为5 500 V。光谱在100～1 000 m/z全扫描模式下获得。使用标准溶液在6种不同浓度下的峰面积校准曲线计算出所有单体酚的含量，并以μg/L表示[21]。
1.3.6 树莓果酒感官质量评分
感官指标主要是通过视觉、嗅觉、味觉、触觉对酒样进行感官评价，包括颜色、香气、滋味、口感、典型性5个方面[18]。每个指标得分以10分计，得分标准：极端不舒服（1分）；非常不舒服（2分）；中度不舒服（3分）；轻微不舒服（4分）；无好无坏（5分）；轻微舒服（6分）；中度舒服（7分）；非常舒服（8分）；极度舒服（9分）；完美（10分）；由学院20名具有专业知识的人员，对酒样进行感官评分。对应感官评价得分以平均值计，满分50分。
1.3.7 实验数理统计分析
所有的试验均做3次重复，结果表示为“平均值±标准差”（n=3）。所有数据均采用IBM SPSS version 26.0进行统计分析。使用Origin8.0软件进行图表绘制。
2 结果与分析
2.1 不同酿酒酵母菌的发酵曲线
不同酿酒酵母菌的发酵曲线可反映出酵母菌的启动、发酵速率和发酵周期情况，是衡量酵母发酵能力的重要方法[4]。整个发酵实验保持15～18 ℃低温环境下进行，不同酿酒酵母菌的发酵曲线图见图1。
图1 不同酿酒酵母菌的发酵曲线
Fig.1 Fermentation curves of different Saccharomyces cerevisiae strains
由图1可知，酿酒酵母CECA和71B耐受性强，发酵启动快速，24 h后进入旺盛发酵期，发酵速率快且发酵周期短；菌株CECA通常用于红葡萄酒的酿造，发酵能力强，菌株71B为降酸酵母。菌株Montrachet与BV818发酵的酒样启动快速，24 h后开始进入旺盛发酵期，后期发酵速率缓和有力，发酵彻底，发酵周期适中；这两菌株通常为白葡萄酒推荐使用菌株。从后期成品酒的感官评分看，更适合树莓果酒发酵。而且，菌株Montrachet被认为是一种非常好的适合大多数水果使用的酿酒酵母[4]。菌株VP5启动最为缓慢，72 h后进入旺盛发酵期，180 h后发酵结束，发酵周期最长。
2.2 不同酵母对树莓果酒发酵基础指标的影响
2.2.1 理化指标分析
五株酿酒酵母发酵所得树莓果酒的理化指标见表1。由表1可知，不同酿酒酵母在pH、可滴定酸、残糖、酒精度等方面都存在显著性差异（P＜0.05）。菌株71B和Montrachet发酵的酒样pH高于其他菌株，菌株71B是用于葡萄酒降酸的酿酒酵母，但在树莓果酒中，并没有表现出明显的降酸优势，可能与两者有机酸组成组分不同有关，而Montrachet的降酸能力却值得进一步分析。所有酒样的残糖含量都＞4 g/L，其中残糖量最大、酒精度较低的是菌株BV818，说明树莓果汁的低酸环境对BV818的发酵能力有一定影响，而残糖较低、酒精度较高的是菌株Montrachet和CECA。同时，菌株Montrachet具有较强的产甘油的能力，其甘油含量最高，为8.22 g/L，显著高于其他四个酒样（P＜0.05）。甘油是果酒酿造中一种非常重要的副产物，具甜味和油性的感官特性，对于平衡果酒风味具有重要作用，低温、高酸的发酵条件有利于酵母菌在发酵过程中生成甘油[4]。从总酚和抗氧化性的角度看，菌株Montrachet发酵的酒样与菌株71B、CECA发酵的酒样无显著差异（P＞0.05），均表现出较高的总酚含量和抗氧化活性。总酚检测结果与文献报道的树莓总酚范围1.5～3.0 g/L相符[21]。菌株VP5的总酚含量和抗氧化活性均显著低于其他菌株（P＜0.05），可能与其酒泥凝聚沉淀能力强有关。从上述理化指标分析结果来看，菌株Montrachet在发酵树莓果酒的过程中表现最佳，具有一定的降酸能力，发酵彻底，酒精度高，且具有较强的甘油生产能力，其总酚含量和抗氧化活性高。
表1 不同酿酒酵母菌树莓果酒的理化指标
Table 1 Physicochemical indexes of raspberry wine fermented by different Saccharomyces cerevisiae strains
注：同行不同小写字母表示具有显著性差异（P＜0.05）。下同。
2.2.2 有机酸比较
有机酸的含量在一定程度上影响着葡萄酒的风味平衡、化学稳定性、pH值，从而影响着果酒的质量[23]。不同酿酒酵母树莓果酒中的部分有机酸含量测定结果见表2。
由表2可知，树莓果酒中最主要的有机酸是柠檬酸，约占总酸含量的90%；其次是苹果酸、乳酸、抗坏血酸、酒石酸等，酒样中未检出琥珀酸，测定结果与PONDER A等[1]的检测结果（柠檬酸17.2 g/L，苹果酸0.46 g/L）接近。发酵能力最强的菌株CECA发酵酒样总酸值最大，柠檬酸占比最高，且菌株CECA代谢会造成苹果酸、乳酸、醋酸含量显著升高（P＜0.05）。适合白葡萄酒酿造的菌株BV818和Montrachet发酵所得酒样总酸值较小，且苹果酸含量显著低于其他3个样品（P＜0.05），所有样品的酒石酸含量无显著差异（P＞0.05）。MENA P等[22]报道了石榴酒发酵过程中有机酸的变化，研究发现柠檬酸和酒石酸含量没有变化，而苹果酸在酿造过程中显著增加。王博[24]在优选蓝莓酿酒酵母时，分析了四种酿酒酵母对蓝莓果酒有机酸的动态影响，发现柠檬酸在发酵过程中降低幅度最大，使得成品蓝莓酒中基本检测不出柠檬酸，而苹果酸含量却大幅增加，为起始含量的4倍。菌株Montrachet发酵酒样发酵速率平缓，总酸值最少，柠檬酸和苹果酸含量最低。在保持酒样糖酸平衡方面，具有明显优势。
表2 不同酿酒酵母菌树莓果酒中的有机酸成分
Table 2 Organic acid ingredient of raspberry wine fermented by different Saccharomyces cerevisiae strains
2.2.3 不同酿酒酵母菌树莓果酒中单体酚含量比较
果酒中的非花色苷酚类物质在感官品质、抗氧化活性等方面发挥着重要影响[13]，不同酿酒酵母树莓果酒中单体酚的含量测定结果见表3。
表3 不同酿酒酵母菌树莓果酒中单体酚的含量
Table 3 Mono-phenol contents of raspberry wine fermented by different Saccharomyces cerevisiae strains
结果表明，该研究共定量检测了树莓酒中11种非花色苷单体酚，各酒样中槲皮素含量最高，其次是鞣花酸、没食子酸、儿茶素、表儿茶素等。从各类单体酚的总量来看，酚酸类约占总含量的50.2%，黄酮醇类32.5%，黄烷醇类17.3%。JELENA J等[25]通过高效液相色谱法测定树莓多酚的检测结果显示，表儿茶素含量最高。郭雪[13]提出树莓果肉中最丰富的非花色苷酚是黄酮醇类和酚酸类。YANG J等[21]认为鞣花酸单宁是树莓中含量较高的重要功能成分，这与本研究检测结果基本保持一致。
从酚酸总值看，菌株BV818和Montrachet发酵的酒样中含量最高，其中鞣花酸和没食子酸含量显著高于其他样品（P＜0.05）。在低温环境下，这两菌株的发酵速率平缓，可能有利于小分子酚酸物质的溶出。有研究表明，这些小分子酚酸物质具有较强的辅色能力，因为能保护花青素在黄酮离子的C2位置不被亲核分子攻击，从而促进更高的颜色稳定性[28]。ZHANG X K等[29]提出酚酸类中的鞣花酸与没食子酸对果酒的花色苷有护色、增强稳定性的作用。
黄烷醇类是树莓果酒苦涩味的物质基础，能够影响到果酒的口感[14，27]。由表3可知，发酵力强的菌株CECA和71B具有较强的黄烷醇类物质的浸提能力。而菌株Montrachet和BV818发酵的样品中黄烷醇类含量居中。这也可能是Montrachet和BV818酒样由于适当的黄烷醇含量，而在感官品评中能获得较高分值的一个原因。而VP5黄烷醇类物质含量最小，不利于形成丰富的口感，从而会影响感官评分。非花色素苷酚中的黄酮类物质无明显规律性变化，其含量主要影响树莓酒的颜色[14]。
从总体上看，酿酒酵母Montrachet在低温发酵过程中，能整体提升酒样中酚类物质的含量，显著促进了鞣花酸和没食子酸的释放，增强了护色作用，并弱化黄烷醇类物质的提取，减少了苦涩感。
2.3 不同酿酒酵母菌树莓果酒的感官评价
由实验室成员组成评定小组，对五种酿酒酵母发酵所得的果酒样品进行感官评定，评价结果见图2。由图2可知，由五种酿酒酵母发酵获得的树莓果酒在果酒颜色方面，Montrachet和BV818酒样颜色鲜艳。但在香气、滋味、口感和典型性方面，Montrachet酒样评分都最高。Montrachet酒样澄清透亮、香气自然舒适、滋味均衡丰富，酒体圆润并具有一定的结构感，但没有强烈的酸涩感，保持了良好的树莓酒风格的典型性。
图2 不同酿酒酵母树莓果酒的感官评价
Fig.2 Sensory evaluation of raspberry wine fermented by different Saccharomyces cerevisiae strains
3 结论
该研究以秋福树莓为原料，选用5种不同酿酒酵母发酵制备树莓果酒。结果表明，菌株VP5启动最为缓慢，71B无明显降酸效果，CECA和BV818感官评分略低，而酵母菌株Montrachet发酵树莓汁启动快速，发酵速率平缓，发酵彻底。所得酒样可滴定酸低，乙醇含量高，残糖量低，甘油含量高，且具有高的总酚含量及抗氧化活性。从有机酸分析结果看，酿酒酵母Montrachet具有较强的降低柠檬酸和苹果酸的能力。从非花色苷单体酚检测结果看，酿酒酵母Montrachet酒样非花色苷总酚含量最高，其中鞣花酸、没食子酸等酚酸物质含量高，有助于保护树莓果酒靓丽的色泽；而黄烷醇酚物质含量居中，可避免强烈的苦涩感。故酿酒酵母Montrachet是适合树莓果酒酿造的优良菌株。
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