猕猴桃（Actinidia chinensis）也被称为奇异果、羊桃、毛木果、阳桃、麻藤果、藤梨等[1-2]，原产于中国，栽培历史已有1 300多年之久[3]。猕猴桃由于其独特的风味，丰富的营养，酸甜的口感，深受大众的喜爱。研究表明，猕猴桃富含维生素C、矿物质、膳食纤维及多酚类化合物[4-6]，而且红心猕猴桃还是一种集食用与药用为一体的水果[7]。
糯米中含有丰富的蛋白质、脂肪、糖类、钙、磷、铁、维生素B1、维生索B2、烟酸及淀粉等[8]。糯米酒酿历史悠久，酿造工艺简单，富含碳水化合物、多种氨基酸、脂肪、维生素、有机酸、微量元素等人体不可缺少的成分[9]，其酒精含量低，营养丰富，易于吸收，保健功能突出[10-12]，具有补血养颜、加强新陈代谢、健脾养胃、舒筋活血、祛风除湿等功效，现代医学发现可以改善血液循环、增加免疫力、促进食欲、丰胸、催乳和美容[9]，深受人们喜欢。徐杨郁青等[13]以小米和糯米为材料制备米酒，其最佳酿造工艺为发酵温度30 ℃、发酵时间4 d、小米添加量15%、酒曲添加量0.4%。此条件下的所制备米酒酒精度为2.8%vol，感官评分最高，且具有很强的抗氧化能力。贵州省轻工业科学研究所[14]以红心猕猴桃和糯米为原料，采用生料酿酒工艺，添加生料曲进行酒精发酵，提升了糯米酒的口感，但目前对猕猴桃米酒研究较少。李斌等[15]以绿米和猕猴桃为原料，通过单因素试验研究酒曲添加量、发酵温度、发酵时间和猕猴桃汁添加量对猕猴桃绿米米酒感官品质的影响。
本试验以糯米为主要原料，猕猴桃为辅料，通过单因素试验、正交试验优化猕猴桃糯米酒工艺，并利用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）-气质联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技术检测猕猴桃米酒中挥发性香气物质，以期丰富米酒的种类，促进猕猴桃的深加工，进一步提高米酒保健功效。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
糯米、蔗糖：市售；猕猴桃：绵阳市安州区西部猕都；安琪甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；草酸（分析纯）：郑州烨阳化工产品有限公司；盐酸（分析纯）：济南荣正化工有限公司；2,6-二氯酚靛酚（分析纯）：上海远慕生物科技有限公司；抗坏血酸（分析纯）：德州润昕实验仪器有限公司；果胶酶（酶活≥600 00 U/mL）：河南科雅食品配料商行。
1.2 仪器与设备
CP214电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；QYCQ 36B顶空固相微萃取（HS-SPME）仪：杭州菲跃仪器有限公司；安捷伦7890A气相色谱-质谱仪：上虞艾仪器设备有限公司；201不锈钢36L发酵容器：山东省滨州市宜仟家酿酒设备有限公司；36L广口磨砂玻璃瓶：山东省徐州千华玻璃制品有限公司；V82九阳榨汁机：山东省济南市九阳股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 猕猴桃米酒酿造工艺流程及操作要点
操作要点：
猕猴桃汁的制备：将猕猴桃去皮后榨汁，加入0.5%果胶酶，30 ℃酶解1 h，用四层纱布过滤，滤渣用新的四层纱布进行二次过滤，两次过滤的猕猴桃汁混合，添加10%蔗糖，调整糖度。置于4 ℃的冰箱中密封保存备用。
糯米蒸煮：称取一定量糯米，淘洗，按料水比1∶2（g∶mL）的比例在陶罐内室温条件下浸泡1 d，将糯米捞出沥干水分后蒸煮1 h。
淋饭、接种拌曲：糯米蒸煮后冷却至室温，取少量（猕猴桃汁总添加量的30%）的猕猴桃汁淋于糯米饭上代替淋饭用水，将糯米揉散，并同时拌入2%甜酒曲，拌合均匀。
搭窝糖化：将拌合均匀的糯米装入陶瓷发酵罐中，从边缘向中心堆砌，当糯米剩余1/3时，只添加边缘，让中间低于外边缘，即四周高，中心低，呈窝状。
米酒发酵：将拌匀糯米转移至陶瓷发酵罐中搭窝发酵，于温度30 ℃恒温发酵4 d。
猕猴桃米酒发酵：发酵后将剩余的猕猴桃汁液（猕猴桃汁总添加量的70%）全部转移至罐中再次发酵，30 ℃恒温发酵6 d。
过滤、澄清：将发酵液用纱布过滤，将滤液装罐，添加0.2%的皂土溶液澄清7 d，采用虹吸管虹吸上清液。
灭菌：澄清后的猕猴桃米酒80 ℃热水浴中灭菌10 min。
陈酿：猕猴桃米酒于阴凉、避光、干燥的环境中陈酿45 d，即得猕猴桃米酒成品。
1.3.2 猕猴桃米酒酿造工艺优化（1）单因素试验
在发酵时间为10 d，发酵温度为30 ℃，蔗糖添加量为9%的基础条件下，分别考察猕猴桃汁添加量（20%、25%、30%、35%、40%）、发酵时间（8 d、10 d、12 d、14 d、16 d）、发酵温度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）、蔗糖添加量（5%、7%、9%、11%、13%）等因素对成品酒精度及感官品质的影响。
（2）正交试验
在单因素试验基础上，以感官评分为评价指标，选择猕猴桃汁添加量（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）、蔗糖添加量（D）4个因素，进行4因素3水平L9（34）正交试验设计，正交试验因素与水平见表1。
表1 猕猴桃米酒酿造工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for brewing process optimization of kiwi rice wine
1.3.3 挥发性风味物质测定[16]
挥发性风味物质测定采用HS-SPME-GC-MS法。顶空固相微萃取：取6 mL猕猴桃米酒样品、2.0 g NaCl于20 mL顶空瓶中，密封，将顶空瓶于40 ℃搅拌平衡15 min后，将老化的萃取头插入密封的顶空瓶中，顶空萃取40 min，然后在气相色谱进样口230 ℃解吸3 min，采用GC-MS分析。
GC条件[17]：石英毛细管色谱柱HP-5MS（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；起始温度40 ℃，保留时间2 min，以5 ℃/min升至230 ℃，保留时间15 min；不分流进样，载气为高纯氦气（He），流速1.2 mL/min。
MS条件[17]：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，进样口温度250 ℃，传输线温度250 ℃，质量范围33～400 amu。
定性定量方法[18]：将得到的每个样品的质谱数据与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）Library 对照相匹配，对匹配度＞80%（最大为100%）的鉴定结果予以确认。按峰面积归一化法进行定量分析。
1.3.4 产品品质评价
（1）理化指标分析检测
酒精度的测定[19]：按照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》；维生素C含量的测定[20]：按照GB 5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》；总酸含量的测定[21]：按照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》。
（2）微生物分析检测
菌落总数的测定[22]：按照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数》中的平板计数法；大肠菌群测定[23]：按照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中的最大可能数（most probable number，MPN）法测定。
（3）感官评价
挑选经过专业系统培训的男女同学共10名，组成感官评定小组。分别从色泽、澄清度、香味、口味、酒体等方面对样品进行评分，满分为100分。猕猴桃米酒感官评分标准见表2[24-25]。
表2 猕猴桃米酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of kiwi rice wine
2 结果与分析
2.1 猕猴桃米酒发酵工艺优化单因素试验结果
2.1.1 猕猴桃汁添加量的确定
猕猴桃汁是猕猴桃糯米酒的原料之一，它的添加直接为糯米酒提供特殊香味成分和风味物质，增加猕猴桃糯米酒的维生素C的含量[15]。猕猴桃汁添加量对猕猴桃米酒酒精度与感官评分的影响见图1。
由图1可知，当猕猴桃汁添加量在20%～30%范围内增加，猕猴桃米酒感官评分增加，其中猕猴桃汁添加量为20%～25%时，发酵的酒液主体香为糯米酒香，猕猴桃风味完全被压制，果酒酸味淡；当猕猴桃汁添加量为30%时，猕猴桃糯米酒的感官评分最高，为93分，糯米酒和猕猴桃的香味相互兼容，既有猕猴桃的清香，又有糯米酒的醇香；当猕猴桃汁添加量在35%～40%时，主体香为猕猴桃果味香，酸涩味重。当猕猴桃汁添加量在20%～30%范围内增加，酒精度逐渐增加，猕猴桃汁添加量在30%时，酒精度最高，为13.0%vol，当猕猴桃汁继续增加，酒精度逐渐下降。综合考虑，选择最适猕猴桃汁添加量为30%。
图1 猕猴桃汁添加量对猕猴桃米酒感官评分与酒精度的影响
Fig.1 Effect of kiwi juice addition on sensory score and alcohol content of kiwi rice wine
2.1.2 发酵时间的确定
发酵时间对猕猴桃米酒的口味有直接影响，随着发酵时间的延长，酿造米酒的风味物质含量随之增加[26]。发酵时间对猕猴桃米酒感官评分和酒精度的影响见图2。
图2 发酵时间对猕猴桃米酒感官评分与酒精度的影响
Fig.2 Effect of fermentation time on sensory score and alcohol content of kiwi rice wine
由图2可知，随着发酵时间在8～12 d范围内的增加，感官评分呈上升趋势，猕猴桃米酒以猕猴桃和糯米香为主体香味，且带有酸涩味；当发酵时间到达12 d时，感官评分最高，为92分，酒体主体香为醇香，且酸涩味减弱，口味清爽，香味怡人；当发酵时间继续增加至16 d时，感官评分为76分，酒体香味变得单一，酸涩味完全消失，酒体复杂感消失。随着发酵时间在8～12 d范围内的增加，酒精度呈增加趋势，当发酵时间到达16 d，酒精度达到最大值，为14.4%vol，而发酵时间在12 d时，其酒精度与发酵时间为16 d时，变化不大。综合考虑，选择最适发酵时间为12 d。
2.1.3 发酵温度的确定
随着温度的上升，单位细胞的发酵活性增强，故低温条件下单位细胞的发酵活性比高温条件下低[27]。发酵温度对猕猴桃米酒感官评分与酒精度的影响见图3。
图3 发酵温度对猕猴桃米酒感官评分与酒精度的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory score and alcohol content of kiwi rice wine
由图3可知，随着发酵温度在24～30 ℃范围内升高，猕猴桃米酒的感官评价分逐渐增加，当发酵温度为30 ℃时，感官评分最高，为91分，酒体呈现出淡绿色，清香浓郁，入口香甜，心旷神怡，当发酵温度继续增加，感官评分下降。其原因是，温度低于30 ℃时，发酵较慢，香味物质较少，酒体甜味较高；温度高于30 ℃时，发酵过快，杂菌生长，酒中异味严重，苦涩难以下咽。当发酵温度在24～28 ℃时，酒精度呈增加趋势，当发酵温度为28 ℃时，酒精度最高（12.7%vol），随着发酵温度继续增加，酒精度下降。综合考虑，选择最适发酵温度为30 ℃。
2.1.4 蔗糖添加量的确定
蔗糖添加量对米酒感官评分与酒精度的影响见图4。
图4 蔗糖添加量对猕猴桃米酒感官评分与酒精度的影响
Fig.4 Effect of sucrose addition on sensory score and alcohol content of kiwi rice wine
由图4可知，随着蔗糖添加量在5%～9%范围内的增加，猕猴桃米酒的感官评分逐渐增加，当蔗糖添加量为9%时，感官评分增加至90分，猕猴桃的清香和糯米酒香两者能相辅相成，但随着蔗糖添加量的继续增加，酒体甜味加重，严重抑制了猕猴桃的清香，导致猕猴桃米酒的主体香被掩盖。当蔗糖添加量为5%～9%时，酒精度逐渐增加，当蔗糖添加量为9%时，酒精度达到最大值13.6%vol，随蔗糖添加量继续增加，酒精度下降。当蔗糖添加量过低，酵母菌发酵较慢，酒精度较低；蔗糖添加量过高，则会促进其他微生物的生长，抑制酵母菌的生长发酵。综合考虑，选择最适蔗糖添加量为9%。
2.2 正交试验结果
在单因素试验基础上，以感官评分为评价指标，分别选择猕猴桃汁添加量（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）、蔗糖添加量（D）4个因素，进行4因素3水平L9（34）正交试验，正交试验结果与分析见表3。
表3 猕猴桃米酒发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation process optimization of kiwi rice wine
由表3可知，影响猕猴桃米酒感官评分的试验因素大小依次为C＞B＞A＞D，即发酵温度＞发酵时间＞猕猴桃汁添加量＞蔗糖添加量。由正交试验得猕猴桃米酒酿造工艺条件最佳组合为A3B2C2D2，即猕猴桃汁添加量为35%，发酵时间为12 d，发酵温度30 ℃，蔗糖添加量9%。在该优化条件下进行3次平行验证，猕猴桃米酒酒精度为12.5%vol，感官评分为95分，酒液呈淡绿色，澄清透明，猕猴桃清香浓郁，酸甜可口。
2.3 猕猴桃米酒的理化和微生物指标
猕猴桃米酒理化和微生物指标测定结果见表4。由表4可知，所得猕猴桃米酒的总酸含量为7.851 g/L，残糖量为9%，维生素C含量为2.4 mg/L，菌落总数为3 CFU/mL，大肠杆菌未检出，其理化和微生物指标均符合国家标准要求。
表4 猕猴桃米酒理化和微生物指标
Table 4 Physicochemical and microbial indexes of kiwi rice wine
2.4 猕猴桃米酒风味物质分析结果
通过顶空固相微萃取（HS-SPME）及气质联用技术（GC-MS）检测猕猴桃米酒中挥发性物质，结果如表5所示，共得到31种风味物质，其中醇类9种、酯类14种、酸类5种、其他类3种。其中醇类的相对含量最高为69.019%，其次是酯类15.135%、酸类13.102%、其他类0.025%。3类物质中含量最高的是乙醇、乙酸、乙酸乙酯，乙醇相对含量达到了58.424%，乙醇使猕猴桃米酒风味口感更加醇香，因为乙醇还具有辛辣干的特点，饮用时可以更好的刺激味蕾，让味蕾更好的感受猕猴桃米酒的风味；乙酸相对含量为9.356%，其酸味为猕猴桃米酒的风味和口感增加了更多的复杂性；乙酸乙酯相对含量为5.456%。
表5 猕猴桃米酒中的风味物质及相对含量
Table 5 Flavor components and relative contents in kiwi rice wine
续表
3 结论
采用糯米和猕猴桃为原料，制备猕猴桃米酒。以感官评分为评价指标，通过单因素试验和正交试验对猕猴桃米酒的发酵工艺进行优化。结果表明，最佳工艺条件为猕猴桃汁添加量35%、发酵时间12 d、发酵温度30 ℃、蔗糖添加量9%，在该优化条件下，猕猴桃米酒的酒精度为12.5%vol，感官评分为95分，酒液呈淡绿色，澄清透明，猕猴桃清香浓郁，酸甜可口。在猕猴桃米酒中共检测31种风味物质，醇类9种、酯类14种、酸类5种、其他类3种。其中醇类、酯类、酸类的相对含量分别为69.019%、15.135%、13.102%。
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