我国是大豆生产加工大国，豆制品企业数量众多，产生的大豆副产品也较多，副产品中的豆渣水分含量较高，营养成分丰富，不能及时处理容易腐烂变质，造成严重的浪费[1]。因此，实现豆渣的再利用，使其变废为宝成为近年来的研究热点，主要表现在提取豆渣营养成分[2-5]、制作豆渣饲料[6-9]和开发豆渣食品[10-12]等方面。
霉豆渣是我国传统的豆渣食品，主要分布在湖北省和河南省信阳市等地区，其发酵工艺为将豆渣加入少量的黄浆水或饮用水均匀搅拌后，进行蒸制、翻炒、放凉，手捏成团放在干净的稻草上进行自然发酵，待豆渣表层长出大量白色绒毛即可。它不仅能使豆渣中蛋白质和不溶性膳食纤维在一定程度上得到降解，产生奇特的发酵风味，还能增加豆渣中游离氨基酸的含量，提高豆渣的可吸收性和营养性[13]。另有研究表明，发酵后的霉豆渣具有抗氧化、降血压、抑制糖尿病和降低胆固醇等多种功能性作用[14-16]。目前，霉豆渣的研究集中在菌种多样性研究[17-19]、发酵剂的制备与优化[20-22]、营养成分及功能性研究[23-25]等方面，对于霉豆渣的工艺优化研究较少。姚英政[26]采用分段发酵方法对湖北地区的霉豆渣粑发酵工艺进行了优化，确定其最佳发酵工艺为：28 ℃条件下发酵18 h，降温至24 ℃发酵4 h、再降温至20 ℃发酵62 h，此时的霉豆渣粑营养价值得到了较大提升。
传统霉豆渣的制作主要是依照工作人员的经验，以当地环境中特有的霉菌作为发酵剂进行自然发酵，因此不同地区霉豆渣的制作工艺和口味略有差别。本试验以干豆渣粉为主要原料制备霉豆渣，参照河南信阳的霉豆渣制作工艺，以纯发酵剂代替天然发酵剂，感官评分及氨基酸态氮含量为评价指标，采用单因素试验及响应面法对其发酵工艺进行优化，并对霉豆渣营养成分进行分析，为霉豆渣的工业化生产提供一定的理论支持，以期为传统美食霉豆渣进行推广。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干豆渣粉：郑州市祥云食品有限公司；毛霉菌粉（10 000 CFU/mg）：沂水锦润生物科技有限公司；体积分数95%乙醇（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；石油醚（30～60 ℃）：郑州派尼化学试剂厂；热稳定α-淀粉酶（酶活10 000 U/mL）、蛋白酶液（酶活300～400 U/mL）、淀粉葡萄糖苷酶液（酶活2 000～3 000 U/mL）：上海蓝季生物试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
FA1204型分析天平：上海力辰仪器科技有限公司；GRP-9080型隔水式恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；HH-1型电热恒温水浴锅：北京市光明医疗仪器有限公司；UV-4802型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；DZF-6050A型真空干燥箱：北京中兴伟业仪器有限公司；BBS-SDC型超净工作台：济南鑫贝西生物技术有限公司；BSXT-02型索氏抽提器：上海贺帆仪器有限公司；KDN-08B（04B）型凯氏定氮仪：上海洪纪仪器设备有限公司；YXQ-50A型立式高压蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3 方法
1.3.1 霉豆渣发酵工艺流程及操作要点[22]
干豆渣粉预处理→浸泡→灭菌→接种→搅拌成型→发酵→霉豆渣
操作要点：
干豆渣粉预处理：挑选干燥、无霉烂、不变质的豆渣粉，过60目筛后备用。
浸泡：准确称取100 g预处理过的干豆渣粉，添加质量比为80%的纯净水混合搅拌均匀，室温下浸泡12 h。
灭菌：浸泡好的豆渣在115 ℃条件下灭菌30 min。
接种：取干豆渣粉质量的2%的发酵菌种溶于少量蒸馏水中，无菌环境下，采用直投式的方法接入灭过菌的豆渣中，混合均匀。
搅拌成型：用手将接种好的豆渣，捏制成团，置于干燥的豆腐框中，框上依次覆盖一层带小孔的保鲜膜和一层豆腐盖布，便于豆渣的保湿和发酵菌种的呼吸。
发酵：将接种过的湿豆渣放置于发酵箱中，28 ℃条件下发酵48 h，直至菌丝完全覆盖表面，霉香味浓郁，发酵完成。
1.3.2 霉豆渣发酵工艺优化单因素试验
以100 g干豆渣粉为基础，设定水分添加量分别为70%、75%、80%、85%、90%，菌种添加量分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，温度分别为24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃，发酵时间分别为24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，进行单因素试验，考察水添加量、菌种添加量、发酵温度和发酵时间对霉豆渣感官评分和氨基酸态氮含量的影响，其中以感官评价为主要评价指标。
1.3.3 霉豆渣发酵工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上，选取对结果影响较大的水添加量（A）、菌种添加量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）为自变量，以感官评分为响应值（Y），进行4因素3水平的Box-Behnken响应面试验，因素与水平见表1。
表1 霉豆渣发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for Meitauza fermentation process optimization
1.3.4 霉豆渣的感官评价
选取10名感官评价人员从霉豆渣的外观（20分）、气味（30分）、滋味（30分）、质地（20分）四个方面进行评价，满分为100分，并取平均值，霉豆渣的感官评分标准[13]见表2。
表2 霉豆渣的感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Meitauza
续表
1.3.5 霉豆渣理化指标的检测方法
氨基酸态氮含量的测定：根据GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中的比色法进行；蛋白质含量的测定：根据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法进行；脂肪含量的测定：根据GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法进行；膳食纤维含量的测定：根据GB 5009.88—2014《食品安全国家标准食品中膳食纤维的测定》进行；总酸含量的测定：根据GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》进行。
1.3.6 试验数据处理方法
利用OriginLab OriginPro 8.5和Design Expert.V8.0.6软件对数据进行分析处理。
2 结果与分析
2.1 霉豆渣发酵工艺优化单因素试验结果
2.1.1 水分添加量对霉豆渣品质的影响
水分添加量对霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量的影响见图1。
图1 水分添加量对霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量的影响
Fig.1 Effect of water addition on sensory score and amino nitrogen contents of Meitauza
由图1可知，当水分添加量为70%～85%时，由于含水量较低，不利于微生物的生长，发酵出的霉豆渣表面菌丝较稀疏，质地较为松软，氨基酸态氮含量相对较低，表明霉豆渣中游离氨基酸含量较低；当水分添加量为85%时，水分充足，微生物生长迅速，霉豆渣表面覆盖稠密菌丝，质地软硬适中，弹性较好，霉香味浓郁，滋味鲜美，具有霉豆渣特殊风味，此时感官评分和氨基酸态氮含量达到最高，分别为83.5分、7.89 mg/g；当水分添加量＞85%之后，霉豆渣含水量较高，呈糊状，质地偏软，弹性较差，口感过于绵软，感官评分有所下降，微生物生长依旧迅速，氨基酸态氮含量相对稳定不变。综合考虑，最佳水分添加量为85%。
2.1.2 菌种添加量对霉豆渣品质的影响
菌种添加量对霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量的影响见图2。
图2 菌种添加量对霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量的影响
Fig.2 Effect of culture addition on sensory score and amino nitrogen contents of Meitauza
由图2可知，当菌种添加量为1.0%～2.0%时，霉豆渣的感官评分与氨基酸态氮含量随菌种添加量增加而上升；当菌种添加量为2.0%时，霉豆渣口感和滋味达到最佳，感官评分达到最高，氨基酸态氮含量较高，分别为80.5分、7.90 mg/g；当菌种添加量为2.0%～2.5%时，霉豆渣开始出现氨味，影响霉豆渣整体风味，感官评分开始下降，氨基酸态氮含量继续缓慢升高；当菌种添加量为2.5%时，氨基酸态氮含量达到最高，为8.52 mg/g；当菌种添加量＞2.5%之后，过量的微生物开始消耗部分游离氨基酸，氨基酸态氮含量逐渐下降。综合考虑，最佳菌种添加量为2.0%。
2.1.3 发酵温度对霉豆渣品质的影响
发酵温度对霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量的影响见图3。
图3 发酵温度对霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory score and amino nitrogen contents of Meitauza
由图3可知，当发酵温度为24～28 ℃时，温度偏低导致霉菌生长繁殖及代谢活动较为缓慢，发酵不充分，霉豆渣表面菌丝较为稀疏，内外颜色不一，风味不够明显；随着发酵温度的升高，霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量逐渐上升，当发酵温度达到28 ℃时，霉菌生长迅速，发酵速度加快，霉豆渣表面菌丝密且长，霉香味明显，煎炸之后有明显香味与鲜味，此时感官评分和氨基酸态氮含量达到最高，分别为85.6分、8.10 mg/g；当发酵温度高于28 ℃之后，杂菌开始繁殖代谢，消耗霉豆渣中的营养物质，氨基酸态氮含量缓慢降低，豆渣出现腐烂味，导致感官评分下降。综合考虑，最佳发酵温度为28 ℃。
2.1.4 发酵时间对霉豆渣品质的影响
发酵时间对霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量的影响见图4。
图4 发酵时间对霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on sensory score and amino nitrogen contents of Meitauza
由图4可知，随着发酵时间在24～72 h范围内的增加，霉豆渣感官评分呈先增加后下降的趋势，氨基酸态氮含量呈先上升后缓慢降低的趋势。当发酵时间在24～48 h之间时，霉菌处于增殖阶段，降解蛋白质速度低，游离氨基酸含量较少，霉豆渣风味不明显；当发酵时间为48 h时，霉豆渣感官评分与氨基酸态氮含量达到最高，分别为82.6分、8.03 mg/g；当发酵时间＞48 h之后，发酵时间过长，霉豆渣出现腐烂味与氨味，影响整体风味，导致感官评分降低。综合考虑，最佳发酵时间为48 h。
2.2 霉豆渣发酵工艺优化响应面试验结果
2.2.1 响应面试验结果与方差分析
在单因素试验结果基础上，以感官评分（Y）作为响应值，水分添加量（A）、菌种添加量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）为自变量，采用Box-Behnken响应面法进行优化，筛选出霉豆渣的最佳发酵工艺参数，响应面试验设计及结果见表3，方差分析见表4。
表3 霉豆渣发酵工艺优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface tests for Meitauza fermentation process optimization
表4 回归模型的方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
续表
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
采用Design Expert.V8.0.6数据分析软件对表3响应面试验的结果进行回归拟合，得到模型的二次多项回归方程为：
由表4可知，该模型P＜0.000 1，极显著，说明通过本次霉豆渣发酵工艺优化结果很好；失拟项P=0.070 1＞0.05，不显著，说明理论和实际值偏差较小，拟合度较高，可以通过得到的回归拟合方程预测结果。一次项A、C、D、交互项AD、BD及二次项A2、B2、C2、D2对霉豆渣感官评分的影响极显著（P＜0.01）。决定系数R2=0.979 1，说明此模型相关度良好，调整决定系数R2adj=0.958 1，表明此模型中的95.81%霉豆渣的感官评分变化来自于自变量A、B、C、D。通过F值大小和显著水平可知，影响感官评分的各因素顺序为发酵时间（D）＞发酵温度（C）＞水添加量（A）＞菌种添加量（B）。
2.2.2 交互作用响应面分析
各因素间交互作用影响霉豆渣感官评分的响应曲面图及等高线见图5。
图5 各因素间交互作用对霉豆渣感官评分影响的响应曲面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on sensory score of Meitauza
由图5可知，当水添加量、菌种添加量、发酵温度和发酵时间两两交互作用时，对霉豆渣的感官评分均有一定影响，各响应面陡峭程度及等高线椭圆化程度存在一定差异，其中AD、BD坡面较为陡峭，等高线椭圆程度较为明显，表明A与D、B与D之间具有良好的交互作用，对霉豆渣感官评分影响较大。在AB、AC、AD和BC坡面上，感官评分随A、B、C、D的增加呈现先迅速升高后缓慢降低的变化趋势；在BD和CD坡面上，感官评分随B、C、D的增加呈现缓慢升高后迅速降低的变化趋势，说明感官评分有最大值点。
由Design Expert.V8.0.6软件预测得出霉豆渣最佳发酵工艺为：水分添加量85.35%，菌种添加量1.98%，发酵温度29.12 ℃，发酵时间39.58 h，此时感官评分最高理论值为87.12分。结合实际操作，将发酵工艺修正为：水分添加量85%，菌种添加量2.0%，发酵温度29 ℃，发酵时间40 h。在此优化发酵工艺条件下进行3次平行验证试验，感官评分实际值为89.7±1.2分，与预测值接近，表明该工艺真实可行。
2.3 霉豆渣理化指标检测结果
对采用最优发酵工艺制作的霉豆渣的理化指标进行检测，结果见表5。
由表5可知，霉豆渣的各项指标均符合GB 2712—2014《食品安全国家标准豆制品》，对比发酵前豆渣和发酵后霉豆渣的营养成分，霉豆渣发酵过程中营养物含量发生了变化。氨基酸态氮含量由1.12 mg/g上升至8.75 mg/g，蛋白质含量由33.8 g/100 g下降至20.1 g/100 g，表明在微生物的作用下，部分蛋白质转变成了游离氨基酸，这使得霉豆渣产生特殊风味；脂肪含量由8.7 g/100 g下降至6.9 g/100 g，不可溶性膳食纤维含量由39.2 g/100 g下降至31.8 g/100 g，可溶性膳食纤维含量由10.6 g/100 g上升至12.5 g/100 g，总酸含量由6.2 g/kg上升至7.3 g/kg，表明霉豆渣在微生物发酵作用下向着低脂肪、高可溶性膳食纤维的方向转变，使得其营养价值更高，更容易消化吸收。
表5 发酵前豆渣及霉豆渣理化指标的检测结果
Table 5 Determination results of physical and chemical indexes of okara before fermentation and Meitauza
注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
3 结论
以信阳地区霉豆渣发酵工艺为基础，通过单因素试验和响应面试验优化，得到霉豆渣的最佳发酵工艺条件为以100 g干豆渣粉为基础，水分添加量85%，菌种添加量2.0%，发酵温度29 ℃，发酵时间40 h，采用优化工艺制作出的霉豆渣菌丝稠密，质地均匀、有弹性，内外均为土黄色，有发酵的霉香味，煎炸之后香气浓郁、味道鲜美，感官评分达87.1分。同时，与发酵前豆渣相比，霉豆渣营养品质得到改良，氨基酸态氮含量由1.12 mg/g上升至8.75 mg/g，蛋白质含量由33.8 g/100 g下降至20.1 g/100 g，脂肪含量由8.7 g/100 g下降至6.9 g/100 g，不可溶性膳食纤维含量由39.2 g/100 g下降至31.8 g/100 g，可溶性膳食纤维含量由10.6 g/100 g上升至12.5 g/100 g，总酸含量由6.2 g/kg上升至7.3 g/kg。本次研究确定了信阳地区霉豆渣的发酵工艺参数，分析了霉豆渣的营养成分变化，可为其工业化生产奠定理论基础。
[1]尹乐斌，何平，刘桠丽，等.豆渣综合利用研究进展[J].粮食与油脂，2021，34（5）：14-16.
[2]范晓文.真菌联合细菌发酵改性豆渣风味及食用品质研究[D].重庆：西南大学，2021.
[3]李昕，徐宏建，霍鹏举，等.不同热处理豆渣中碳水化合物分子结构与其营养价值及瘤胃降解特性的相关性研究[J].动物营养学报，2018，30（11）：4683-4694.
[4]王凌翌，周利琴，刘志国，等.联合酶法提取豆渣蛋白肽和可溶性膳食纤维[J].中国油脂，2021，46（6）：114-118.
[5]王思琪，胡彦波，翟丽媛，等.豆渣可溶酸性多糖的分离纯化及结构解析[J].食品科学，2021，42（10）：52-57.
[6]杨洋，汤晓娟，王江勤，等.发酵豆渣的菌种选择及应用研究进展[J].食品研究与开发，2021，42（8）：192-196.
[7]乔君毅，任继武，樊瑞泉，等.混菌固态发酵豆渣生产菌体蛋白饲料生产条件的研究[J].饲料工业，2021，42（8）：30-35.
[8]王雅菲，李强.饲料中添加不同水平的发酵豆渣对育肥猪生长性能、屠宰性能及经济效益指标的影响[J].中国饲料，2021，4（5）：127-130.
[9]王雪洋，韩淑敏，李雁冰，等.不同添加剂对豆渣型发酵饲料发酵品质及有氧稳定性的影响[J].中国饲料，2020，4（15）：116-119.
[10]周钰皖，张英明，高洁，等.红糖豆渣食品加工工艺研究[J].农产品加工，2021，4（9）：39-42，47.
[11]戴赛男.豆渣酥性饼干中豆渣粉与面粉配比的研究[J].食品安全导刊，2021，4（12）：151-152.
[12]江宇峰，洪豆，朱文秀，等.豆渣粉膳食纤维营养强化米的研制[J].食品科技，2021，46（3）：135-141.
[13]许喜林，李应琼.雅致放射毛霉和运动发酵单胞菌混合发酵霉豆渣研究[J].食品科学，2011，32（11）：103-106.
[14]ZHU Y P,CHENG Y Q,WANG L J,et al.Enhanced antioxidative activity of Chinese traditionally fermented okara(Meitauza)prepared with various microorganism[J].Int J Food Prop,2008,11(3):519-529.
[15]LI S,WANG L,SONG C,et al.Utilization of soybean curd residue for polysaccharides by Wolfiporia extensa(Peck)ginns and the antioxidant activities in vitro[J].J Taiwan Inst Chem E,2014,45(1):6-11.
[16]王慧.豆渣发酵成分分析及其产品开发的研究[D].长沙：湖南农业大学，2014.
[17]刘梦琦，朱媛媛，倪慧，等.荆州地区霉豆渣真菌多样性研究[J].食品与发酵工业，2021，47（6）：241-246.
[18]尚雪娇，方三胜，朱媛媛，等.霉豆渣细菌多样性解析及基因功能预测[J].食品与发酵工业，2021，47（3）：36-42.
[19]徐书泽，黄丽，滕建文，等.传统发酵霉豆渣中产酶优势菌的分离鉴定及性质研究[J].食品与发酵工业，2014，40（3）：102-106.
[20]彭晓群.直投式霉豆渣发酵剂的制备及应用[D].广州：华南理工大学，2015.
[21]石美芬.直投式霉豆渣发酵剂的研制与初步应用[D].广州：华南理工大学，2012.
[22]李应琼.霉豆渣混合发酵的研究[D].广州：华南理工大学，2011.
[23]肖婧泓，辛嘉英，刘青云，等.微生物发酵提高豆渣可溶性蛋白的研究进展[J].饲料研究，2021，44（11）：131-134.
[24]吴学凤，陈明鑫，孙聪聪，等.安卡红曲霉As 3.4811液态发酵制备膳食纤维的特性研究[J].中国酿造，2021，40（3）：39-43.
[25]管瑛.雅致放射毛霉DCY-1固态发酵豆渣的营养及功能性研究[D].南京：南京农业大学，2016.
[26]姚英政.霉豆渣粑发酵过程中营养及风味成分变化研究[D].武汉：华中农业大学，2010.