近年来随着有机产品消费理念的流行，在质量、健康和安全等方面优于普通酸奶的有机酸奶越来越被消费者认可和接受[1-3]。有机酸奶不仅具有普通酸奶的营养功能特性，同时还具备有机食品安全、无污染的重要特点。有机奶中蛋白质、微量元素和天然脂溶性维生素的含量更高，氨基酸和脂肪酸的配比更优质，有益于人体对营养物质的吸收[4-5]。高品质、无公害的有机奶源以及消费者对有机酸奶奶的高认同度都代表着有机酸奶在我国广阔的市场前景，但目前有机酸奶的市场占有率较低。高溢价率和选择单一是限制有机酸奶发展的两个主要原因。目前有机酸奶产品口感较为单一且类似，受有机原料等客观因素限制导致产品特点不鲜明，可选种类少。
为了解决有机酸奶产品特点不鲜明的缺点，选择抹茶风味、益生菌双歧杆菌以及益生元菊粉等差异化元素进行研发。抹茶粉是将茶叶烘干和研磨成粉末制成的一种绿茶，抹茶中含有儿茶素、茶氨酸和咖啡因等成分，在日本进行的流行病学研究证明，饮用绿茶可以改善认知障碍[6]。关于抹茶研究的人群实验则表明，食用抹茶后注意力更加集中，对外界刺激的反应速度明显提高[7]。目前抹茶粉广泛应用于蛋糕、饼干和风味酱等产品中，而在酸奶产品中的应用则处于创新开发应用的阶段。
在酸奶开发中添加双歧杆菌（Bifidobacterium）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）或嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）等附属益生菌能够提升酸奶的保健功能[8-10]，双歧杆菌Bb-12、双歧杆菌C-I等菌株已在酸奶中广泛应用。菊糖和低聚果糖的益生作用在许多人体实验中得到证实，菊粉作为益生元有助于维持正常肠道功能[11]。通过在有机生牛乳中添加适量抹茶粉、菊粉和益生菌株发酵，使产品具有显著茶清香并强化保健效果。
本研究以有机生牛乳和有机白砂糖为主要原料，添加抹茶粉和益生元等配料共同进行发酵，研发抹茶益生菌有机酸奶，并对其贮存期品质进行分析。通过单因素试验和正交试验分别考察抹茶粉添加量、菊粉添加量、发酵剂接种量和发酵时间对抹茶益生菌有机酸奶感官品质的影响。抹茶益生菌有机酸奶的研制，旨在满足消费者对有机乳制品的保健功能与种类多样化的需求，具有广阔市场潜力。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
有机生牛乳：北大荒完达山乳业股份有限公司；有机白砂糖：大连盛禾谷农业发展有限公司；抹茶粉：贵州贵茶（集团）有限公司；菊粉（膳食纤维含量≥90%）：维乐夫集团；酸奶直投式发酵剂（嗜热链球菌（Streptococcus ther mophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和双歧杆菌（Bifidobacterium））：科汉森股份有限公司。
1.2 仪器与设备
RH250-70高压均质机：上海申鹿均质机有限公司；YXQSG46-280S不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；101A-3数显电子鼓风干燥箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公司；DV3T黏度仪：美国Brookfield公司；Turbiscan稳定性分析仪：法国Formulaction公司。
1.3 试验方法
1.3.1 抹茶益生菌有机酸奶加工工艺流程及操作要点
有机生牛乳→预热→混料（有机白砂糖、菊粉、抹茶粉）→均质、杀菌→冷却→接入发酵剂、双歧杆菌→发酵→后熟→抹茶益生菌有机酸奶
操作要点：
预热：有机生牛乳预热温度55～60 ℃。
混料：按照设定配方称取各种原料，将原料用预热牛奶溶解，用高速剪切机剪切15～20 min。
均质、杀菌：混合料在55～60 ℃、压力18～20 MPa条件下均质；混合料在杀菌温度（95±2）℃条件下杀菌5 min。
发酵：料液降温至（42±1）℃后，按设计好的发酵剂接种量加入菌种，发酵时间严格按试验设计控制，发酵温度42 ℃，发酵时间6 h。
后熟：发酵后酸奶在冷藏温度2～6 ℃条件下后熟12 h以上，得到抹茶益生菌有机酸奶。
1.3.2 抹茶益生菌有机酸奶配方优化
单因素试验：通过查阅酸奶加工工艺的相关文献及前期实验[12-13]，确定有机白砂糖添加量8%、发酵时间42 ℃，发酵时间6 h，分别研究抹茶粉添加量（0.07%、0.08%、0.09%、0.10%、0.11%）、菊粉添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、发酵剂接种量（0.006%、0.008%、0.010%、0.012%、0.014%）等因素对抹茶益生菌有机酸奶品质的影响，确定各因素的最佳用量范围。
正交试验：在单因素试验的基础上，利用正交试验来确定抹茶益生菌酸奶的最佳工艺条件，分别选取抹茶粉添加量（A）、菊粉添加量（B）、发酵剂接种量（C）3个参数为变量。设计3因素3水平L9（33）正交试验，正交试验设计因素与水平见表1。
表1 抹茶益生菌有机酸奶配方优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for formulation optimization of matcha probiotic organic yogurt
1.3.3 感官评定
选取15位具有食品感官评定经验的技术人员，综合抹茶益生菌有机酸奶的色泽、风味、组织状态和口感特性进行评定，按指定的评分标准对每项分别打分，满分100分，计算平均分。产品标准符合GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》[14]相关规定，抹茶益生菌有机酸奶评分标准见表2。
表2 抹茶益生菌有机酸奶感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of matcha probiotic organic yogurt
1.3.4 测定方法
酸度测定：参照国标GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》[15]中第一法进行滴定，每个样品重复试验3次。
黏度测定：使用黏度仪进行测定，取50 mL样品置于样品池中，转子选用LV-3型号，转速20 r/min，试验温度25 ℃，数据收集方式选择单点取平均值，每个样品重复试验3次。
乳酸菌活菌数测定：参照国标GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》[16]，每个样品重复试验3次。
稳定性分析：使用稳定性分析仪进行检测，采用多次扫描模式，扫描温度4 ℃，总扫描时间12 h，每次扫描间隔时间1 h，以12 h样品动力学稳定性指数（dynamic stability index，TSI）值和底部峰厚度平均值评价。TSI值越大，表明被测样品越不稳定。底部峰厚度反映所测样品底部沉淀累计速度，峰厚度值越大，底部沉淀速度越快，表明样品稳定性越差。
1.3.5 数据处理
采用Excel 2016和SPSS20.0进行数据处理和分析。每个指标重复试验3次，结果以“平均值±标准误差”表示，分析比较方法采用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）法，P＜0.05 认为具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 抹茶益生菌有机酸奶配方优化单因素试验
2.1.1 抹茶粉添加量对有机酸奶品质的影响
抹茶粉添加量对有机酸奶品质的影响结果见图1。抹茶粉的添加能够赋予产品绿色色泽和茶清香味，由图1A可知，抹茶粉添加量在0.07%～0.11%的范围内时，感官评分呈现先升高后降低的趋势。当抹茶粉添加量在0.07%～0.09%时，感官评分随之增高；当抹茶粉添加量在0.09%时，感官评分最高，为92分；当抹茶粉添加量＞0.09%之后，感官评分有所下降。抹茶粉添加量过低，产品色泽较浅，特征风味淡；抹茶粉添加量过高，酸奶色泽偏深绿，会产生不良风味，遮蔽酸奶原有的风味。由图1B可知，抹茶粉的添加量对有机酸奶产品酸度无显著影响（P＞0.05）。由图1C可知，抹茶粉添加量在0.07%～0.11%的范围内增加时，TSI值随之下降，说明抹茶粉的添加有助于提高有机酸奶稳定性。抹茶粉添加量达到0.09%时，TSI值显著下降（P＜0.05）。由图1D可知，底部峰厚度从统计学角度分析，各组数据之间无显著性差异（P＞0.05）。万腾腾等[21]在对抹茶杏仁凝固型酸奶工艺进行优化时发现，酸奶中添加0.04%的抹茶粉可以与杏仁浆共同作用促进产品风味的提升。杏仁风味较为清香，如果与本试验中抹茶粉添加量相同则会影响产品风味，而本试验选择0.09%的添加量不仅为了提升产品抹茶浓郁的风味，更是为了与双歧杆菌的独特味道结合，产品具有淡绿色色泽、口感细滑，后味绵长。综上，确定抹茶粉的最佳添加量为0.09%。
图1 抹茶粉添加量对有机酸奶品质的影响
Fig.1 Effect of matcha powder addition on the quality of organic yogurt
不同小写字母代表各组之间存在差异性（P＜0.05）。下同。
2.1.2 菊粉添加量对有机酸奶品质的影响
菊粉添加量对有机酸奶品质的影响结果见图2。菊粉是一种天然的水溶性膳食纤维，具有促进益生菌增殖、调节血糖水平、缓解肥胖症状等益生功能。在乳制品中添加菊粉时，会促进人体对乳中钙的吸收[17]。由图2A可知，当菊粉添加量在0.5%～2.5%时，感官评分随之增高。酸奶的感官评分与菊粉添加量呈正相关，随菊粉添加量增加，酸奶感官评分上升，口感醇厚浓稠，酸奶的口感逐渐提升。由图2B可知，当菊粉添加量在0.5%～2.5%时，酸度随之增高，并在菊粉添加量达到2.0%时，滴定酸度显著上升（P＜0.05），影响有机酸奶品质。由图2C和2D可知，菊粉添加量在0.5%～2.5%的范围内增加时，TSI值、底部峰厚度逐渐下降，并在菊粉添加量分别1.5%、2.5%时，TSI 值、底部峰厚度显著下降（P＜0.05），说明菊粉的添加有助于提高有机酸奶稳定性。
图2 菊粉添加量对有机酸奶品质的影响
Fig.2 Effect of inulin addition on the quality of organic yogurt
过量的菊粉可能会导致酸奶过甜，口感下降，适量的菊粉添加可模拟脂肪口感，史碧筠等[18]通过对酸奶中菊粉替代部分脂肪的研究发现，在脱脂奶中添加4%的菊粉经均质、杀菌、发酵后可模拟全脂酸奶的口感。在本实验中，由于所选原料为全脂有机生牛乳，为了防止菊粉添加过量使产品甜腻感过强，导致产品整体口感降低，不宜添加多量菊粉。综上，确定菊粉添加量为1.5%。
2.1.3 发酵剂接种量对有机酸奶品质的影响
发酵剂接种量对有机酸奶评分的影响结果见图3。
由图3可知，随着发酵剂接种量在0.006%～0.014%范围内的的增加，有机酸奶的感官评分呈先增长后下降的趋势。由图3A可知，当发酵剂接种量在0.006%～0.010%时，感官评分随之增高；当抹茶粉添加量在0.010%时，感官评分最高，为92分；当抹茶粉添加量＞0.010%之后，感官评分有所下降。接种量太少时，乳酸菌分泌胞外多糖量低，产品组织状态较差；接种量过高，产品酸度过高，酸甜比失衡，口感较差。双歧杆菌和嗜酸乳杆菌会分解有机奶中的乳糖产酸，造成产品酸度的上升。由图3B可知，当发酵剂接种量在0.006%～0.010%时，酸度随之增高，并在发酵剂接种量达到0.012%时，产品酸度显著升高（P＜0.05），影响酸奶品质。由图3C和3D可知，发酵剂接种量在0.006%～0.010%的范围内增加时，TSI值、底部峰厚度随之升高，并在发酵剂接种量分别0.014%、0.012%时，TSI值、底部峰厚度显著上升（P＜0.05），表明发酵剂的添加会降低酸奶的稳定性。综上，确定发酵剂接种量为0.010%。
图3 发酵剂接种量对有机酸奶品质的影响
Fig.3 Effect of fermentation starter inoculum on the quality of organic yogurt
在酸奶中添加双歧杆菌发酵后，酸奶具有独特风味，口感差异化明显。同时REDONDO-USEROS N等[19]对摄入多种益生菌发酵乳的健康成年人肠道菌群跟踪试验发现，摄入含双歧杆菌发酵乳人群的肠道菌群中动物双歧杆菌随发酵乳摄入量增加而增加，提升菌群丰度。KURU B E等[20]的另一项调查研究显示当受试人群的口腔不清洁卫生时，补充动物双歧杆菌益生菌酸奶，对牙菌斑积累和牙龈炎症参数有正向影响。本试验产品与普通有机酸奶相比差异性显著，选择在有机酸奶中添加双歧杆菌，一是丰富产品口感，双歧杆菌赋予有机酸奶独特风味；二是提升产品功能特性，益生功能显著。
2.2 正交试验结果
选取抹茶粉添加量（A）、菊粉添加量（B）以及发酵剂接种量（C）3个参数为变量进行正交试验，正交试验结果见表3。
由表3可知，影响抹茶益生菌有机酸奶的感官得分主次因素为：A＞B＞C，由此可以得出抹茶粉添加量是影响抹茶益生菌有机酸奶品质的重要因素，其次依次是菊粉添加量和发酵剂接种量。由极差分析结果可知，抹茶益生菌有机酸奶最优配方组合为A2B1C2，即抹茶粉添加量0.09%，菊粉添加量1.5%，发酵剂接种量0.01%。在此优化工艺下进行3次平行验证试验，抹茶益生菌有机酸奶感官评分为97分。由表4可知，抹茶粉添加量对产品感官评分影响极显著（P＜0.01），菊粉添加量和发酵剂接种量对产品感官评分影响显著（P＜0.05）。
表3 抹茶益生菌有机酸奶配方优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for formulation optimization of matcha probiotic organic yogurt
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results
2.3 抹茶益生菌有机酸奶与普通有机酸奶的品质分析
按照正交试验确定的最佳抹茶益生菌有机酸奶工艺制作酸奶，以有机白砂糖添加量8%、发酵温度42 ℃、发酵时间5 h条件下制作普通有机酸奶（空白对照组不进行调味，发酵菌种为保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），冷藏温度2～6 ℃，冷藏后熟时间不少于12 h后通过对成品进行感官评分以及酸度、黏度、乳酸菌活菌数的测定，比较抹茶益生菌有机酸奶与普通有机酸奶的品质差别，试验监测期为21 d，监测温度为2～6 ℃，除乳酸菌数仅检测破乳后的样品外，其余指标每7 d进行一次监测。试验相关结果见图4。
图4 两种酸奶21天贮存期品质对比
Fig.4 Comparison of two kinds of yogurt quality during 21 d storge
A：感官评分；B：酸度；C：黏度；D：乳酸菌活菌数。
由图4A可知，抹茶益生菌有机酸奶的感官品质在21 d内较稳定，贮存期内仅下降3分，普通有机酸奶在贮存期内的感官品质则下降明显，由85分下降至73分，下降了14.12%。这是由于抹茶粉及菊粉的添加，丰富了产品的口感，提升产品风味。
由图4B可知，普通有机酸奶在贮存期内酸度上涨平缓，21 d时较破乳后上涨6°T，这与贾庆超等[22]对市售酸奶在贮藏期酸度的变化规律基本一致。抹茶益生菌有机酸奶21 d贮存期内上升幅度较高，上涨了17°T，酸奶后酸化较普通有机酸奶更为严重。抹茶益生菌有机酸奶中添加了双歧杆菌和嗜酸乳杆菌两种益生菌，杆菌的添加不可避免造成酸奶贮存期内酸度的上涨。双歧杆菌除提高免疫力、调整肠道菌群等功能性外由于其基因组中有大量与代谢碳水化合物相关的基因，可在分解体内多糖，促进其他益生菌在肠道中的定殖[23]，提升菌群间的协同作用使益生菌更好的发挥其功能性。嗜酸乳杆菌是革兰氏阴性菌，具有转化植物糖苷[24]、抑制幽门螺杆菌[25]等特殊功能，在有机酸奶中加入双歧杆菌和嗜酸乳杆菌，产品差异化明显，提升产品功能性。
由图4C可知，21 d内普通有机酸奶黏度持续下降，由2 860 mPa·s下降至2 040 mPa·s，黏度下降820 mPa·s，黏度损失率高达28.7%，抹茶益生菌有机酸奶的黏度比较稳定，21 d内整体呈先生高后降低的趋势。相比黏度持续降低的普通有机酸奶，抹茶益生菌有机酸奶中添加了1.5%的菊粉。潘蕾等[26]对酸奶中不同菊粉的添加量开展实验，结果表明，当菊粉添加量为5%时，饮用型酸奶无吸水无乳清析出现象。BALTHAZAR C F等[27]在实验中发现2%～4%的菊粉可增加酸奶硬度。GUIMARAES J T等[28]选用光学显微镜、粒度分析仪等技术对番荔枝口味的乳清饮料进行稳定性研究发现，聚合度＞23的菊粉可以提升稳定性。本试验中选择1.5%的菊粉，在抹茶粉以及益生菌的共同作用下产品21 d内黏度保持稳定，无析水情况发生，产品组织状态稳定。
由图4D可知，由于抹茶益生菌有机酸奶的发酵剂较普通有机酸奶相比添加双歧杆菌和嗜酸乳杆菌，破乳后的抹茶益生菌有机酸奶乳酸菌含量为8.64×108 CFU/mL，较普通有机酸奶产品中活菌数提高了64.3%。何君等[29]研究菊粉对发酵乳品质的影响，结果表明，菊粉可减缓贮存期乳酸菌数的下降，提升产品品质。
3 结论
研究确定了在有机白砂糖添加量为8%、发酵时间6 h、发酵温度为42 ℃最佳配方条件下，以有机生牛乳和有机白砂糖为原料制备抹茶益生菌有机酸奶的最优工艺为抹茶粉添加量0.09%、菊粉添加量1.5%、发酵剂接种量0.01%，发酵后在2～6 ℃下冷藏12 h。在此工艺下制作的抹茶益生菌有机酸奶，口感醇厚，酸甜比适中，色泽淡绿光亮，益生菌风味浓郁，香气宜人，后味绵长，具有较好的感官评价、理化性质和质构特点。冷藏后熟后乳酸菌活菌数为8.64×108 CFU/mL，同时产品贮存21 d时，感官评分为93分；滴定酸度为95°T，上涨幅度在接受范围内；黏度为3 100 mPa·s，贮存期内黏度损失较小。所有监测指标均符合GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》相关规定，抹茶益生菌有机酸奶兼具有机酸奶的高营养、高安全的特点和抹茶粉、菊粉、双歧杆菌等配料的独特风味及质构特性，满足消费者对有机乳制品的保健功能与种类多样化的需求，丰富有机酸奶种类，具有广阔市场潜力。但该产品仍受到有机原料选择单一的限制，有机抹茶粉原料供应商较少、成本较高，限制抹茶粉等原料在酸奶中的应用，要想丰富有机酸奶产品种类，在现有工艺的基础上拓展新型有机原料是下一步开发的重点。
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