拥有良好感官品质，是一款葡萄酒被消费者接受的必要条件。而葡萄酒的感官品质中较为重要的是糖酸平衡和香气呈现[1]。糖在葡萄果实发育阶段积累，其作为葡萄酒中重要的呈味物质，对葡萄酒感官质量有重要影响[2]。葡萄酒中过多的糖残留，可能会导致葡萄酒口感失衡或引发微生物污染[3-4]。葡萄酒中的有机酸分别来源于葡萄果实和酿造过程，是葡萄酒中重要的风味物质，低含量的有机酸有利于丰富葡萄酒口感[5]，含量过高易使葡萄酒表现酸涩和粗硬等不良特征。葡萄酒中的香气来源于葡萄果实中的风味前体物质和发酵过程[6]。以上物质在葡萄酒酿造过程中容易受到外来微生物污染、环境温度变化等影响，导致葡萄酒感官品质下降。甘露糖蛋白用于葡萄酒酿造过程，可抵御外界环境的不良影响，改善葡萄酒口感，增加香气复杂度和浓郁度等[7-8]，从而改良葡萄酒感官品质。
甘露糖蛋白作为酵母自溶产物，可显著改善葡萄酒品质，同时不会对葡萄酒产生不良影响。现有国内外的研究主要着眼于向葡萄酒发酵过程以及陈酿阶段添加甘露糖蛋白研究其对葡萄酒花青素、单宁、多酚类物质以及颜色稳定性等的影响[9-12]，忽略了发酵前向葡萄汁中添加甘露糖蛋白对葡萄酒感官品质影响，而对感官品质影响巨大的单糖、有机酸以及香气物质来源于葡萄果实和酿造过程。鉴于此，该研究推测分别向酒精发酵前的葡萄汁和酒精发酵完成后的葡萄酒中添加甘露糖蛋白可能对葡萄酒的感官品质会产生不同的影响。因此该试验设计探究在酒精发酵前后分别添加不同浓度甘露糖蛋白对葡萄酒中单体糖、有机酸以及香气等物质含量的影响，以期为葡萄酒厂在为改善‘赤霞珠’葡萄酒感官品质方面选择甘露糖蛋白的添加时期和添加量提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
‘赤霞珠’葡萄：宁夏立兰酒庄；甘露糖蛋白、酵母：法国LALLEMANT公司；硫酸铜（CuSO4·5H2O）、酒石酸钾钠（C4HKNaO6·4H2O）、氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾、葡萄糖等（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；果糖、葡萄糖、2-辛醇、酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸：美国Sigma公司；乙腈（色谱纯）：美国ACS试剂公司。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：日本岛津公司；TRACE DSQ气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：美国THERMO Fisher公司；萃取纤维CAR/DVB/PDMS（50 μm/30 μm萃取头）：美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 葡萄酒制作工艺与操作要点
以欧亚种酿酒葡萄‘赤霞珠’为试材，当总糖含量达到230～240 g/L时采收，‘赤霞珠’酒样均采用传统工艺酿造。具体工艺流程如下：
酒精发酵前添加甘露糖蛋白处理：葡萄分选，除梗破碎→入100 L发酵罐，分组编号→添加50 mg/L二氧化硫，30 mg/L果胶酶，200 mg/L酵母以及分别添加0、0.1 g/L、0.3 g/L甘露糖蛋白，启动酒精发酵（温度控制在（25±1）℃）→发酵结束，比重在0.992～0.996间且残糖量≤2 g/L时，皮渣分离→自然启动苹果酸-乳酸发酵（利用纸层析法监控发酵进程）→发酵完全→转罐分酒→添加30～40 mg/L二氧化硫→20 ℃条件下瓶储12个月。
酒精发酵后添加甘露糖蛋白处理：收集酒精发酵完全的未经甘露糖蛋白处理的‘赤霞珠’干红葡萄酒，分组编号→分别添加0.1 g/L、0.3 g/L甘露糖蛋白→倒罐→自然启动苹果酸-乳酸发酵（利用纸层析法监控发酵进程）→发酵完全→转罐分酒→添加30～40 mg/L二氧化硫→20 ℃条件下瓶储12个月。
1.3.2 酒样处理方式
根据已有的研究，在探究甘露糖蛋白对葡萄酒质量的影响时，其常用的质量浓度通常为0.1 g/L、0.2 g/L、0.25 g/L和0.3 g/L，同时在浓度介于0.1 g/L和0.3 g/L之间的处理中可以看到最积极的效果[13-14]。因此，试验选择甘露糖蛋白的浓度为0.1 g/L和0.3 g/L。为使葡萄酒充分展现果香和醇香，获得饱满优雅的口感，试验选择瓶储12个月后进行指标分析和感官品鉴，酒样处理方式详见表1。
表1 酒样处理方式
Table 1 Treatment mode of wine samples
1.3.3 葡萄酒常规理化指标测定
理化指标测定参照王华[15]的方法，用斐林试剂热滴定法测定还原糖质量浓度；用酸碱滴定法测定总酸质量浓度；使用pH计测定pH值。
1.3.4 葡萄酒中单体糖的测定[16]
标准溶液的配制：分别准确称取果糖和葡萄糖（分析纯）0.500 g，加入5 mL容量瓶中，纯水溶解并定容，得100 g/L可溶性糖混合标准溶液。依次用2.0、2.5、5.0、10.0倍纯水稀释配成50 g/L、40 g/L、20 g/L、10 g/L可溶性糖混合标准溶液，各质量浓度的标准溶液经0.45 μm滤膜过滤后放入样品瓶中，备用。
样品处理：各葡萄酒样品经0.45 μm滤膜过滤后用无菌注射器打入1.5 mL进样瓶中，采用HPLC进行测定。
色谱条件：以ZORBAXSB-C18（4.6mm×250mm，5μm）为色谱柱参数；流动相为乙腈-水（75∶25，V/V）；流速1.0mL/min；柱温40 ℃；以示差检测器为测器；进样量10 μL；分析时间为20 min。
1.3.5 葡萄酒中有机酸的测定[16]
标准溶液配制：分别准确称取酒石酸、L-苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸0.100 g于5 mL容量瓶中，用流动相溶解并定容，得到20 g/L有机酸混合标准溶液依次用流动相稀释配成1.000 g/L、0.500 g/L、0.250 g/L、0.125 g/L的有机酸混合标准溶液，各质量浓度的标准溶液经0.45 μm滤膜过滤后放入样品瓶中，备用。
样品处理：各葡萄酒样品经0.45 μm滤膜过滤后用无菌注射器打入1.5 mL进样瓶中，采用HPLC进行测定。
色谱条件：以HypersilGOLDaQ（250mm×4.6mm，5μm）为色谱柱；流动相为0.01 mol/L磷酸氢二钾溶液（pH 2.2）；流速0.5 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL；波长210 nm；分析时间30 min。
1.3.6 葡萄酒中香气成分的测定[17]
用顶空固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）提取葡萄酒样品中的香气物质，采用GC-MS分析香气组分的质量浓度。
SPME方法：吸取8 mL酒样（含10 μL 2-辛醇）加入15 mL装有磁力搅拌子的顶空瓶中，加入2.0 g NaCl；将顶空瓶放入电磁搅拌器中，40 ℃条件下水浴平衡15 min；在顶空瓶中插入萃取纤维CAR/DVB/PDMS，于40 ℃条件下吸附30min，立即将萃取头插入GC进样口解吸8 min，进行GC-MS分析。
GC-MS条件：无分流进样；DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；以高纯氦气（He）为载气；流速1 mL/min；柱温从40 ℃以4 ℃/min升至160 ℃，随后从160 ℃以7 ℃/min升至230℃，保持8min；连接杆温度230℃；离子源温度230℃；电子能量70 eV；灯丝电流0.2 mA；检测器电压350 V。质谱扫描为全扫描，范围为33～450 amu，扫描速率1次/s。
1.3.7 葡萄酒的感官品评
葡萄酒的感官品评参照美国葡萄酒协会（American Wine Society，AWS）的葡萄酒品尝表，组织10人的感官品尝小组。特别地，使用葡萄酒标准味感物质和香气物质对品尝小组成员的味觉和嗅觉进行强化训练。品尝小组对5种酒样酒样分别从外观、香气、口感和结构、余味以及整体印象五个方面进行打分评定，统计品评小组成员给出的各指标的分数，计算每个指标的平均值后统计总分（满分20分）。
表2 葡萄酒的评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard of wine
1.3.8 数据处理
指标重复测定3次，数据用Microsoft Office 2010和SPSS Statistics 26.0软件（邓肯检验方法）进行分析，所有测定结果分析中应用的显著性水平为P＜0.05。单体糖、有机酸和香气数据处理：采用对比标准品保留时间的方法定性，曲线法定量。
2 结果与分析
2.1 对葡萄酒常规理化指标的影响
甘露糖蛋白作用于苹果酸-乳酸发酵过程，影响葡萄酒中苹果酸和乳酸的含量[18]，从而改变可滴定酸的含量。由于甘露糖蛋白本身是多糖物质，可能会增加酒精产品的糖含量[14]。甘露糖蛋白对葡萄酒总酸、还原糖、pH的影响见表3。
表3 甘露糖蛋白不同添加方式对葡萄酒理化指标的影响
Table 3 Effect of mannoprotein addition way on the physicochemical characteristics of wine
注：相同字母表示差异不显著（P＞0.05），不同字母表示差异显著（P＜0.05），下同。
由表3可知，添加甘露糖蛋白，使‘赤霞珠’葡萄酒中总酸含量与对照组酒样相比均降低，其中，AF0.3组降低最多，显著降低3.2%（P＜0.05）；pH值提高，除BF0.1组样品还原糖含量降低2.8%外，其余组还原糖含量均增加。而本研究中BF0.1组还原糖含量降低的机理尚不明确，需要进一步的研究。因此，除BF0.1组外，添加甘露糖蛋白可以增加还原糖的含量，降低总酸含量，增加pH值。
2.2 对葡萄酒单体糖和有机酸的影响
过多果糖（＞2 g/L）残留在葡萄酒中，可能会存在葡萄酒口感失衡和引发微生物污染的危险[3，4]。低含量的有机酸有利于丰富葡萄酒口感[5]，其中，苹果酸含量较高则会有稍带苦的特殊香味[19]，对葡萄酒口感的影响较大，葡萄酒中苹果酸的含量一般在0.766～2.083 g/L[20]；酒石酸不仅对葡萄酒pH值的高低有影响[21]，对葡萄酒的口感和稳定性也均有一定影响，葡萄酒中酒石酸的含量一般为1.615～3.215 g/L[22]；琥珀酸的味既酸又苦，是葡萄酒中味觉反映最明显的一种酸[22]，葡萄酒中琥珀酸的含量一般在0.033～0.833 g/L[21]，琥珀酸含量少，苦味越少。当葡萄酒中苹果酸、酒石酸和琥珀酸的含量过大时，葡萄酒的口感将变得粗糙且伴有涩感[23]，使葡萄酒感官品质下降。甘露糖蛋白可降低葡萄酒中苹果酸和乳酸的含量[18]。甘露糖蛋白对葡萄酒单体糖和有机酸的影响见表4。
由表4可知，发酵前添加甘露糖蛋白果糖含量显著增加（P＜0.05），其中BF0.3组中果糖含量对照组酒样相比增加49.5%。李影[24]的研究中得出，甘露糖蛋白中的D-甘露糖可与D-果糖发生可逆异构化反应，由此发酵前向酒样中添加甘露糖蛋白可增加果糖含量，从陈莹等[25]的研究中发现低葡萄糖-果糖比可使发酵进行缓慢，甚至出现发酵停止，使得发酵前添加甘露糖蛋白的酒样发酵缓慢，从而积累比对照组更多的果糖。而发酵后添加甘露糖蛋白果糖含量显著减少（P＜0.05），AF0.1和AF0.3组中果糖含量分别减少17.5%和20.7%。此外，添加甘露糖蛋白的酒样中葡萄糖含量均增加，可能是由于甘露糖蛋白具有增加葡萄酒糖含量的效用[14]。
表4 甘露糖蛋白的添加对单体糖和有机酸含量的影响
Table 4 Effect of mannoprotein addition on the contents of monomer sugars and organic acids
各‘赤霞珠’酒样中，存在酒石酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸五种有机酸单体，含量最多的是苹果酸，其次是酒石酸和琥珀酸。发酵前添加甘露糖蛋白主要增加了苹果酸和酒石酸的含量，其中BF0.1 组中苹果酸和酒石酸分别增加3.2%和6.2%；BF0.3组中苹果酸含量增加17.5%。酒石酸含量增加，可能是由于甘露糖蛋白可以阻止酒石酸晶核的结合，从而减少了酒石酸的析出，使其含量增加[26-27]；而苹果酸含量增加与已有研究结论不符[14，20]，说明发酵前添加甘露糖蛋白可能对葡萄酒发酵过程产生了不利影响。发酵后添加甘露糖蛋白除乳酸含量增加外，其余各类有机酸含量均有所降低，其中AF0.1组中苹果酸和酒石酸显著降低6.8%和11.7%（P＜0.05）；AF0.3组苹果酸和酒石酸分别降低4.4%和8.4%，乳酸含量增加10.6%。
因此发酵后添加甘露糖蛋白（特别是添加0.1 g/L），果糖、苹果酸、酒石酸以及琥珀酸含量均显著减少，使酒体更加稳定，减少了葡萄酒的酸涩感，使口感更加协调。
2.3 对葡萄酒香气物质的影响
甘露糖蛋白对葡萄酒主要香气物质的影响见表5。
表5 甘露糖蛋白对葡萄酒香气成分质量浓度的影响
Table 5 Effect of mannoprotein on mass concentration of wine aroma components
续表
注：“nd”表示未检测到；“-”表示未查阅到相关资料。
由表5可知，5种酒样中检测出多种香气类物质，其中包括酯类、酸类、醇类及其他。发酵前添加甘露糖蛋白的酒样中，BF0.1组中OAV＞1的香气组分一共有8组，OAV在0.1～1范围的香气组分有8组，且各香气组分均减少，而BF0.3组中OAV＞1的香气组分有6组，OAV在0.1～1范围的香气组分有11组，且除醇类香气组分增加外，其他香气组分均减少。说明发酵前向‘赤霞珠’酒样中添加甘露糖蛋白对于酒样的香气浓郁度无明显贡献。发酵后添加甘露糖蛋白的酒样中，OAV＞1的香气组分一共有4组，OAV在0.1～1范围的香气组分有13组，且乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、3-甲基-1-丁醇增加得较为显著。其中AF0.1组中乙酸乙酯质量浓度与对照组相比增加了7.4倍、己酸乙酯增加约1.8倍、辛酸乙酯增加约1.8倍、3-甲基-1-丁醇增加约1.8倍；AF0.3组中上述四种物质分别增加了6.0、2.2、2.2和1.9倍。此外，丁二酸二乙酯为对照组没有的香气物质。
因此，发酵后添加甘露糖蛋白（特别是添加0.3 g/L），有助于提高酒样中酯类、醇类等香气组分的质量浓度，增加‘赤霞珠’葡萄酒香气的浓郁度；而增加了丁二酸二乙酯这种具有苹果香等愉快水果类香气的物质则有助于增加葡萄酒香气的复杂度。
2.4 对葡萄酒感官品质的影响
五种酒样的感官品评得分和雷达图结果分别见表6和图1。结果表明，发酵前添加甘露糖蛋白的酒样中，BF0.1组和BF0.3组外观、香气、口感和结构、余味以及整体印象的得分均下降，说明向酒精发酵前的葡萄汁中添加甘露糖蛋白对于葡萄酒的感官质量具有负面的影响。发酵后添加甘露糖蛋白的酒样中，各感官指标的得分均有不同程度的提高，其中，AF0.3组酒样的总分最高，其外观、香气、口感和结构以及整体印象的感官评分也较高，而AF0.1组的香气评分也较其他组略髙。由此可见，添加甘露糖蛋白可以改变葡萄酒的感官质量，其中酒精发酵后以0.3 g/L的剂量添加时改善葡萄酒感官质量的效果最为显著。
表6 五种酒样的感官品评得分
Table 6 Sensory evaluation scores of five wine samples
图1 五种酒样感官品评结果雷达图
Fig.1 Radar chart of sensory evaluation results of five kinds of wine samples
3 结论
总体来说，酒精发酵后添加甘露糖蛋白有利于改善‘赤霞珠’葡萄酒的感官质量，而酒精发酵前向酒样中添加甘露糖蛋白则会起到相反效果。酒精发酵后添加甘露糖蛋白的酒样中，果糖含量以及苹果酸、酒石酸等风味表现不佳的有机酸含量显著降低，酯类、醇类等香气组分的质量浓度有所提高，并增加了丁二酸二乙酯这种对照组所没有的令人愉快的香气物质，有利于维持葡萄酒糖酸平衡，稳定酒体，使葡萄酒口感更佳，同时赋予了葡萄酒更多愉悦的香气，增加了葡萄酒香气浓郁度和复杂度。
[1]杨贤良.葡萄酒的质量控制[J].食品导报，1991（3）：23.
[2]李华.葡萄酒化学[M].北京：科学出版社，2005：88-95.
[3]DUMONT A,RAYNAL C,RAGINEL F,et al.The ability of wine yeast to consume fructose[J].Aust NZ Grapegrower Winemaker,2009,543:52-57.
[4]BERTHELS N J,CORDERO OTERO R R,BAUER F F,et al.Discrepancy in glucose and fructose utilisation during fermentation by Saccharomyces cerevisiae wine yeast strains[J].FEMS Yeast Res,2004,4(7):683-689.
[5]刘品何，刘胜，秦伟帅，等.疏果斱式对赤霞珠葡萄酒中挥収性物质的影响[J].酿酒科技，2014（10）：32-36.
[6]陶永胜，朱晓琳，马得草，等.葡萄汁有孢汉逊酵母糖苷酶增香酿造葡萄酒的潜力分析[J].农业机械学报，2016，47（10）：280-286.
[7]苑伟，张会宁，祁新春，等.不同类型酵母多糖对干红葡萄酒品质的影响[J].中国酿造，2012，31（12）：88-90.
[8]李华.多糖对葡萄酒感官质量的作用[J].酿酒，2001，28（6）：65-67.
[9]ALCALDE-EON C,PÉREZ-MESTRE C,FERRERAS-CHARRO R,et al.The addition of mannoproteins and/or seeds during winemaking and their effects on pigment composition and color stability[J].J Agr Food Chem,2019,67(14):4031-4042.
[10] RODRIGUES A,RICARDO-DA-SILVA J M,LUCAS C,et al.Effect of commercial mannoproteins on wine colour and tannins stability[J].Food Chem,2012,131(3):907-914.
[11] GONÇALVES F J,FERNANDES P A R,WESSEL D F,et al.Interaction of wine mannoproteins and arabinogalactans with anthocyanins[J].Food Chem,2018,243:1-10.
[12]RINALDI A,COPPOLA M,MOIO L.Aging of Aglianico and Sangiovese wine on mannoproteins:effect on astringency and colour[J].LWT-Food Sci Technol,2018,105:233-241.
[13]BARRA C,HACKL K,DÜRRSCHMID K,et al.Effect of cold maceration,stem return,re-heating and mannoprotein addition on color stabilization of'Pinot Noir'wines[J].Mitt Klosterneuburg,2005,55:140-147.
[14]SUN X Y,YAN Z C,ZHU T,et al.Effects on the color,taste,and anthocyanins stability of blueberry wine by different contents of mannoprotein[J].Food Chem,2019,279:63-69.
[15]王华.葡萄酒分析检测[M].北京：中国农业出版社，2011：125-126.
[16]鞠延仑，宇航，刘敏，等.橡木提取液对霞多丽和赤霞珠葡萄果实品质的影响[J].食品科学，2018，39（3）：62-68.
[17]于立志，马永昆，张龙，等.GC-O-MS法检测句容产区巨峰葡萄香气成分分析[J].食品科学，2015，36（8）：196-200.
[18]DIEZ L,GUADALUPE Z,AYESTARÁN B,et al.Effect of yeast mannoproteins and grape polysaccharides on the growth of wine lactic acid and acetic acid bacteria[J].J Agr Food Chem,2010,58(13):7731-7739.
[19]杨春霞，苟春林，单巧玲.葡萄酒酿造过程中有机酸变化规律研究[J].中国酿造，2017，36（4）：83-86.
[20]曾竟蓝，马胤鹏，秦丹，等.果酒中有机酸的作用及检测方法研究[J].中国酿造，2018，37（6）：183-187.
[21]庞敏，蔡松铃，刘茜.葡萄酒中有机酸及其分析方法的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2019（6）：1588-1593.
[22]段云涛.葡萄和葡萄酒中9种有机酸RP-HPLC 检测体系的建立及其相关研究[D].北京：中国农业大学，2007.
[23]刘晓艳，白卫东，蒋爱民，等.荔枝果酒加工过程中有机酸的变化研究[J].中国酿造，2011，30（11）：65-69.
[24]李影.来源于Pseudomonasgeniculata的AGEfamilyepimerase/isomerase在大肠杆菌中的表达及其在D-甘露糖制备中的应用[D].无锡：江南大学，2019.
[25]陈莹，屈慧鸽，GAFBER J.葡萄糖-果糖比对发酵停滞的影响及其预防、重启策略[J].中外葡萄与葡萄酒，2010，5：69-71.
[26]张艳芳，王明杰.葡萄酒中酒石酸巧稳定性的探讨[J].中外葡萄与葡萄酒，2001（6）：48-50.
[27]门颖.酵母甘露糖蛋白对葡萄酒品质影响的研究[D].济南：齐鲁工业大学，2015.
[28]申静云，刘沛通，段长青，等.不同有孢汉逊酵母与酿酒酵母混合发酵对威代尔冰葡萄酒香气的影响[J].食品与发酵工业，2017，43（10）：16-23.
[29]王倩倩，覃杰，马得草，等.优选发酵毕赤酵母与酿酒酵母混合发酵增香酿造爱格丽干白葡萄酒[J].中国农业科学，2018，51（11）：2178-2192.
[30] HU K,JIN G J,MEI W C,et al.Increase of medium-chain fatty acid ethyl ester content in mixed H.uvarum/S.cerevisiae fermentation leads to wine fruity aroma enhancement[J].Food Chem,2018,239:495-501.
[31]TRISTEZZA M,TUFARIELLO M,CAPOZZI V,et al.The oenological potential of Hanseniaspora uvarum in simultaneous and sequential cofermentation with Saccharomyces cerevisiae for industrial wine production[J].Front Microbiol,2016,7:670-684.
[32]LOIRA I,MORATA A,COMUZZO P,et al.Use of Schizosaccharomyces pombe and Torulaspora delbrueckii strains in mixed and sequential fermentations to improve red wine sensory quality[J].Food Res Int,2015,76:325-333.
[33]张文静，杨诗妮，杜爽，等.本土毕赤克鲁维酵母与酿酒酵母混合发酵葡萄酒的增香潜力分析[J].食品科学，2020，41（12）：84-90.
[34]WANG X J,TAO Y S,WU Y,et al.Aroma compounds and characteristics of noble-rot wines of Chardonnay grapes artificially botrytized in the vineyard[J]. Food Chem,2017,226:41-50.
[35]左俊伟，亓相媛，赵彩云，等.宁夏贺兰山东麓产区霞多丽、贵人香干白葡萄酒香气成分分析[J].食品与发酵工业，2016，42（10）：149-155.
[36]CAI J,ZHU B Q,WANG Y H,et al.Influence of pre-fermentation cold maceration treatment on aroma compounds of Cabernet Sauvignon wines fermented in different industrial scale fermenters[J].Food Chem,2014,154:217-229.
[37]TAO Y S,ZHANG L.Intensity prediction of typical aroma characters of Cabernet Sauvignon wine in Changli County(China)[J].LWT-Food Sci Technol,2010,43(10):1550-1556.