食醋是一种日常生活中不可或缺的酸性调味品，不仅能增进食欲、防腐杀菌，还具有防心血管疾病、抗癌抗衰老、缓解消除疲劳、防止感冒等功效。浙江玫瑰醋因色泽如玫瑰般艳丽而得名，酸中带甜、口感柔和、香气独特，深受江浙一带消费者的喜爱。玫瑰醋的发酵工艺独特，为静态表面自然发酵[1]。但浙江玫瑰醋的酿造受季节的限制，一年只能生产一次到两次，在生产过程中经常由于气候潮湿而导致异常发酵变质，即醋醪表面产生膜醭，处理不当会使醋醪浑浊褪色，影响产品品质[2]，这给产量不占优势的玫瑰醋行业带来了较大的问题。
食醋依靠微生物发酵而成，自然也容易因为微生物污染而产生膜醭甚至异常发酵变质，而膜醭的形成是由于单一运动的细胞互相黏连而形成细胞长链，然后产生细胞外基质相互黏附[3]。随着宏基因组等分子生物学技术的快速发展，许多传统发酵食品的微生物菌群被鉴定分析。由于食醋的酿造工艺存在差异，食醋污染的来源和微生物种类也有所不同，翟磊等[4]研究发现，食醋中耐酸乳杆菌能消耗碳源并产生乳酸，从而导致食醋酸败；李伟丽等[5]从异常发酵醋中分离出多株细菌，且绝大多数为革兰氏阳性菌；孙文丽等[6]在胀袋食醋中不仅发现芽孢杆菌，还分离出了腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）和头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis）。浙江玫瑰醋是个复杂的多菌种体系，酿造季节高温且多雨水，草缸盖若不定期晾晒，容易使异常发酵微生物肆意生长，致使酿造中的玫瑰醋微生物生态失衡[7]。
目前玫瑰醋研究仍未见有关异常发酵菌的相关报道，鉴于此，本研究采用传统培养分离方法分离异常发酵玫瑰醋中的微生物，通过回接实验分析菌株的异常发酵特征，并通过形态观察及分子生物学技术鉴定微生物种属，同时探究培养温度、酸度、酒精度对主要异常发酵微生物生长特性的影响，为控制玫瑰醋异常发酵变质提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
正常玫瑰醋醋样品、异常发酵玫瑰醋样品：宁波佐餐王食品有限公司、湖州老恒和酿造有限公司、浙江五味和食品有限公司；营养琼脂、虎红琼脂培养基：杭州微生物试剂有限公司；LB肉汤培养基、麦芽汁培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；细菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒、真菌基因组DNA提取试剂盒：北京索莱宝科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-1FD洁净工作台、SPX-250B-Z生化培养箱：上海博迅实业有限公司；FE20实验室pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DYY-6C电泳仪：北京六一生物科技有限公司；HBPX220聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：英国Hybaid Limited公司；DChemiDoc XRS+化学发光凝胶成像系统：美国Bio Rad公司；NSKY-200B恒温培养振荡器：上海苏坤实业有限公司；SpectraMax i3x酶标仪：美谷分子仪器（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 异常发酵玫瑰醋样品微生物的分离
用无菌玻璃棒挑取异常发酵玫瑰醋表面的膜醭于10 mL无菌生理盐水中，将其振荡混匀，按等梯度稀释至10-6，然后分别取100 μL不同梯度的稀释液，均匀涂布在营养琼脂和虎红琼脂培养基上，将接种后的培养基分别置于37 ℃和30 ℃培养箱中培养24～48 h。挑去形态各异的菌落进行划线分离纯化，记录纯化后的单菌落形态，将真菌和革兰氏染色后的细菌，在光学显微镜下观察其菌体形态，并斜面保藏，待用。
1.3.2 回接实验
取同批次中酸度和酒精度与异常发酵醋样品相近的正常玫瑰醋，用0.22 μm滤膜过滤除菌。挑取分离的细菌及真菌菌株，分别接种到LB肉汤和麦芽汁培养基，分别在37 ℃和30 ℃条件下摇床扩培12～18 h。取5 mL扩培后的悬浮液分别接种于50 mL正常玫瑰醋中，以不接种组为空白对照（M-0），在32 ℃条件下静置培养7 d，观察玫瑰醋样品的异常发酵和产膜醭现象。
1.3.3 异常发酵微生物的分子生物学鉴定
分别用真菌DNA提取试剂盒和细菌DNA提取试剂盒，提取纯化后6株分离菌株的基因组DNA。以提取的基因组为模板，细菌以27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）为引物PCR扩增16S rDNA，PCR扩增体系（25 μL）：5×reaction buffer 5 μL，5×GCbuffer 5 μL，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，DNA模板2 μL，双蒸水（ddH2O）8.75 μL，Q5 DNA聚合酶0.25 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，46.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃再延伸10 min。真菌以内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）为引物PCR扩增18S rDNA，PCR扩增体系同上。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，51.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测、纯化后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果提交至美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库中采用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行同源性搜索比对，选取同源性较高的模式菌株的16S rRNA、18S rDNA基因序列，利用Clustal X软件进行多重序列比对，再使用MEGA 7.0软件中的邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统发育树。
1.3.4 异常发酵微生物的生长特性分析
活化分离鉴定的异常发酵微生物，按5%（V/V）的接种量接种于50 mL正常玫瑰醋中，在不同温度（27 ℃、32 ℃、37 ℃）、不同pH值（3、5、7）、酒精度（0、2.5% vol、5.0% vol）条件下培养48 h，每4 h取样，在波长600 nm处测定吸光度值（OD600nm）。
1.3.5 统计分析
每组样品设3个重复，采用Microsoft Excel 2007和Origin 8.5进行数据处理和作图，并利用SPSS 22.0进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 异常发酵玫瑰醋中微生物的分离
经过营养琼脂培养基和虎红培养基培养分离，初步分离得到4株细菌（X-1～X-4）和2株真菌（Z-1、Z-2）。各菌株的菌落及细胞形态见图1。由图1可知，4株细菌经革兰氏染色后都呈紫色，即均为革兰氏阳性（G+）细菌，其中菌株X-1、X-4的菌落为白色不透明，边缘不整齐，细胞呈球形；菌株X-2和X-3的菌落呈点状、表面光滑、边缘整齐，菌株X-1的细胞呈短杆状，菌株X-3的细胞呈长杆状。2株真菌Z-1、Z-2的菌落表面湿润、呈粉红色、边缘光滑整齐，细胞呈椭圆形。
图1 异常发酵玫瑰醋中分离微生物的菌落及细胞形态
Fig.1 Colony and cell morphology of microorganisms isolated from abnormally fermented rosy vinegar
2.2 回接实验
将6株菌回接到正常玫瑰醋中，以不接种组为空白对照（M-0），静置培养7 d后，观察接种后醋样的异常发酵和产膜醭现象，结果见表1。
表1 各菌株回接实验的异常发酵现象
Table 1 Abnormal fermentation phenomenon of back-test experiment of each strain
由表1可知，从玫瑰醋的颜色变化发现，接种4株细菌的醋样都能保持与对照组类似的玫瑰色或淡玫瑰色，而接种真菌Z-1和Z-2的醋样颜色呈较深的暗红色和棕色。从玫瑰醋的酸度变化发现，对照组pH值为3.12，而除接种菌株X-2的醋样外，其他醋样的pH值升高，其中接种真菌Z-1、Z-2的醋样pH较高，分别为4.78、5.12，显然2株真菌生长过程中表现出氮代谢积累碱性物质的情形，pH升高会有利于其他细菌的繁殖生长。从玫瑰醋的气味变化发现，接种菌株X-1、Z-1和Z-2的醋样均有淡醋酸气味，接种菌株X-3的醋样有较淡醋酸味且略带异味，接种菌株X-2的醋样酸味较重且略带异味，而接种菌株X-4的醋样则有明显的异常发酵臭味，说明菌株X-4是关联玫瑰醋异常发酵的主要微生物之一。从产膜醭情况发现，4株细菌都不产生膜醭，仅接种菌株X-4的醋样底部出现膜状沉淀，而接种真菌Z-1和Z-2的醋样在培养1～2 d后液体表面形成膜醭。正常的玫瑰醋发酵中期，醪液表面可见清晰的树枝状醋酸菌膜，“翻缸”操作时会将醋酸菌膜打碎，但第二天就会重新形成这种醋酸菌膜。异常发酵总是从液体表面形成粗糙而厚实的异样膜璞开始，这种粗糙的膜璞会迅速阻碍醋酸菌膜的存在，醪液的酸度就不再增加，行业内将这种有异常膜璞的醋叫“桐油醋”，推测2株真菌是玫瑰醋产生膜醭的主要微生物。
2.3 异常发酵微生物的分子生物学鉴定结果
细菌X-1、X-2、X-3、X-4的16S rRNA及真菌Z-1和Z-2的18S rDNA的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。由图2可知，6株菌经PCR扩增后获得预期大小的产物，电泳条带清晰明亮。
图2 6株菌株PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products of 6 strains
分别基于16S rDNA、18S rDNA基因序列构建4株细菌及2株真菌的系统发育树，结果见图3。
由图3A可知，菌株X-1与类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）聚于一支，亲缘关系最近，鉴定其为类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.），何银等[8]对赤水晒醋的异常发酵微生物研究发现，类芽孢杆菌是引起醋异常发酵的菌株之一，其在15 ℃时生长很微弱，pH 3.0时几乎不生长，能耐受5%以上的盐分；王虎虎等[9]对真空包装盐水鹅贮藏期的优势菌群研究发现，类芽孢杆菌生存能力强，分解蛋白质能力较强，是产品贮藏后期的主要异常发酵菌。菌株X-2与金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）聚于一支，亲缘关系最近，鉴定其为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），其为革兰氏阳性耐盐的食源性致病菌，在食品加工过程中易污染食品。菌株X-3与表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）聚于一支，亲缘关系最近，鉴定其为表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），是人体皮肤黏膜常见的正常菌群，可能与醋发酵过程中人工操作污染有关。王向阳等[10]研究发现，胀袋的腌萝卜干中存在表皮葡萄球菌，不过其产气缓慢，产气量较少。菌株X-4与蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）聚于一支，亲缘关系最近，鉴定其为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），该革兰氏阳性菌产孢子，常出现在蛋白质和碳水化合物含量高的食物，在腐质食物中含量也较高，产生的毒素会引起食物中毒[11]。研究显示，蜡状芽孢杆菌会引起榨菜异常发酵变质，引起榨菜“胖袋”现象[12]；在异常发酵后的韩国豆腐中分离到两株异常发酵菌，鉴定均为蜡状芽孢杆菌[13]。
由图3B可知，真菌菌株Z-1与库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）聚于一支，亲缘关系最近，鉴定其为库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）。菌株Z-2与盔形毕赤酵母（Pichia manshurica）聚于一支，亲缘关系最近，鉴定其为盔形毕赤酵母（Pichia manshurica）。在发酵食品中真菌引起的污染较为常见，毕赤酵母属在弱酸环境下生长，是导致泡菜生花的主要污染微生物之一[14]，在异常发酵后，泡菜中库德里阿兹威毕赤酵母数量成倍增加[15]，在米酒酿造过程中也经常发生野生毕赤酵母、异常汉逊酵母的污染[16]。MOON S H等[17]研究报道，库德里阿兹威毕赤酵母是泡菜中产膜醭的主要腐败菌，导致泡菜的不良风味、质地软化；SAEZ J S等[18]研究发现，毕赤酵母属是导致葡萄酒异常发酵的原因之一。
图3 基于16S rDNA基因序列细菌（A）和基于18S rDNA基因序列真菌（B）的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of bacteria (A) based on 16S rDNA gene sequence and fungi (B) based on 18S rDNA gene sequence
2.4 异常发酵微生物在不同培养条件下的生长特性
培养温度、pH和酒精度对异常发酵微生物生长特性的影响见图4。由图4a可知，产膜醭的真菌菌株Z-1、Z-2、金黄色葡萄球菌X-2、蜡状芽孢杆菌X-4在26～40 ℃较广的温度区间都有较快的生长速度，而类芽孢杆菌X-1、表皮葡萄球菌X-3的生长速度要慢得多，仅在32 ℃生长较好。玫瑰醋酿造主要依靠夏季高温，使醋酸菌处于较为适宜的条件下将酒精转化为醋酸，当温度低于28～30 ℃时，醋酸菌（醋酸杆菌属（Acetobacter sp.）A和葡糖杆菌属（Gluconobacter sp.）G）的生长速度显著变慢[19-20]，而产膜醭的真菌和蜡状芽孢杆菌X-4快速生长和繁殖，液体表面大量酵母膜醭的形成阻挡了液面上醋酸菌跟空气的接触，从而使膜醭上的酵母迅速成为优势菌，而醋酸菌逐渐停止生长[21]。由图4b可知，酸度提高对真菌Z-1、Z-2的生长影响有限，而腐败细菌均无法在pH低于2.8的酸性条件下正常生长。玫瑰醋异常发酵大多数发生在玫瑰醋发酵的中期，这时候醪液的pH值大约在pH3.5左右，金黄色葡萄球菌X-2和蜡状芽孢杆菌X-4都能以一定的速度生长繁殖，并使醪液的pH值适当上升，给不耐酸的腐败菌提供生存条件[22]。敖晓琳等[23]报道毕赤酵母属在酸性食品表面形成膜状结构，还能氧化有机酸，从而为不耐酸的腐败菌提供生存条件。由图4c可知，库德里阿兹威毕赤酵母Z-1、盔形毕赤酵母Z-2和金黄色葡萄球菌X-2在酒精浓度低于5% vol的基质中生长良好，而类芽孢杆菌X-1、表皮葡萄球菌X-3和蜡状芽孢杆菌X-4不易在高浓度酒精条件下生长。由于玫瑰醋发酵中期醪液内有一定浓度的酒精2.0% vol～5.0% vol（冲缸放水后20～40 d的发酵中期）[24]，这为酒精耐受的杂菌繁殖和生长创造了条件。
图4 培养温度（a）、pH值（b）和酒精度（c）对异常发酵微生物生长的影响
Fig.4 Effect of culture temperature (a),pH (b) and alcohol content (c) on the growth of abnormal fermentation microorganisms
2.5 异常发酵微生物的作用途径及控制方法探究
玫瑰醋发酵过程中大米的淀粉通过糖化、发酵最终转变为醋酸，这个过程完全依赖环境空气中的微生物自然发酵完成。虽然空气中各种有益菌、有害菌混杂，生产中大米原料却能有序接受霉菌分泌的淀粉酶进行糖化，即生产上俗称“发花”。“冲缸放水”后糖分选择性地被酿酒酵母发酵转化成酒精，随后酒精被生长于液面上的醋酸菌氧化成乙酸。这些微生物的选择与调控的成败取决于生产中两个重要环节的掌控：①大米的浸米时间长达7～10 d，使得饭坯pH约3.5左右，在这较低的pH下，霉菌可以生长，而其他杂菌很难在饭粒表面繁殖；②投料时间从立夏到芒种，“冲缸放水”前期（6月份）的气温保持在25～29 ℃，适宜于酵母菌的生长，后期（7月、8月）气温保持在28.5～32 ℃，适宜于醋酸菌的生长[25]。
玫瑰醋发酵过程中不人为添加菌种，发酵所需的菌种基本来自于草缸盖和空气。当南方梅雨季节时，草缸盖无法得到定期晾晒，杂菌容易繁殖生长。夜间温度降低同样会造成玫瑰醋中的醋酸菌生长速度变慢。而毕赤酵母在空气中大量存在，最佳生长温度为25～30 ℃，生长速度快、耐酸、好氧、能在液面上快速形成膜。玫瑰醋发酵中表面如若被异常毕赤酵母形成的膜璞覆盖，醋酸菌接触不到氧气，醋酸菌生长缓慢甚至停止。人工定期“翻缸”等操作过程中也会混入各种微生物，一旦醋醅酸度不再上升，一些耐低酸的细菌（如腊状芽孢杆菌）就会慢慢地活跃起来。从回接实验结果可知，类芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌生长时分解蛋白质使醪液pH值上升，pH值向中性变化导致更多杂菌的繁殖。有些芽孢杆菌类杂菌分解糖类产二氧化碳使缸中醪液后期返浑，蜡状芽孢杆菌类杂菌分解蛋白质会使缸内醪液产生臭味。可见，毕赤酵母是导致玫瑰醋异常发酵的首要腐败菌，而具有一定耐酸能力的蜡状芽孢杆菌类细菌是导致玫瑰醋进一步返浑、发臭的辅助腐败菌[26]。
从多家玫瑰醋厂的生产实践，结合对异常发酵玫瑰醋微生物的分离、鉴定与生理特性研究，可以推测异常醋发酵过程见图5。由图5可知，环境温度降低、醋酸菌生长缓慢→污染的酵母和芽孢菌优势生长→表面膜璞形成、醋酸菌停止生长→其他细菌异常发酵。可见，温度管理是控制玫瑰醋发酵中期产生异常发酵醋的关键因素，因为液面形成大量致密的膜璞，行业中称这种异常醋为“桐油醋”，在较高的温度下野生酵母等杂菌不可能获得生长优势。根据异常发酵玫瑰醋的微生物鉴别和成因分析，一旦玫瑰醋发生异常，应该在污染的早期及时采取如下措施：及时翻缸，破坏表面由野生酵母产生的膜璞；及时升温，使醋醅温度恢复到醋酸菌适宜的温度范围；把正常醋缸中的一定量醪液（含有大量醋酸菌）并入表面开始形成膜璞的醋缸。
图5 玫瑰醋异常发酵过程模式图
Fig.5 Diagram of abnormal fermentation process of rosy vinegar
3 结论
从异常发酵浙江玫瑰醋的表面膜醭分离获得4株革兰氏阳性细菌（X1～X4）和2株真菌（Z1～Z2）。回接实验结果显示，6株菌株均有异常发酵特征，其中接种菌株X-4的醋样出现明显的发酵臭味，而接种真菌Z-1和Z-2的醋样表面形成膜醭。通过菌体形态观察和分子生物学技术鉴定4株细菌分别为类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），2株真菌分别为库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）和盔形毕赤酵母（Pichia manshurica）。低温抑制醋酸菌的生长，而对异常发酵菌的生长影响较小；低酸和低酒精度下，异常发酵细菌无法正常繁殖，而不影响异常发酵真菌。低温是异常发酵微生物成为优势菌的前提条件，毕赤酵母产生的膜醭阻断了醋酸菌的氧气供应是导致醋酸异常发酵的主要因素。根据异常发酵玫瑰醋的微生物鉴别和成因分析，一旦玫瑰醋发生异常，应该在污染的早期及时翻缸，破坏表面由野生酵母产生的膜璞；及时升温，使醋醅温度恢复到醋酸菌适宜的温度范围；把正常醋缸中的一定量醪液（含有大量醋酸菌）并入表面开始形成膜璞的醋缸。
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