乳制品富含多种营养成分，是人们饮食结构不可或缺的部分[1]。发酵乳是最常见的乳制品之一，其中的乳酸菌不仅赋予这种美食以发酵风味，还能改善肠道微生物群落的平衡状态，抑制有害菌的生理代谢，有益于宿主健康[2]。乳酸菌制品具有抗氧化、延缓衰老的效果，甚至具有抗癌、增强免疫力的功能[3]。同时，发酵过程中原料奶的部分蛋白质分解为氨基酸，其他大分子营养物质被降解，游离脂肪酸也有所增加，因此酸奶中的蛋白和钙更易被人吸收[4]。但由于人们生活和消费水平的提高，很多消费者已经不满足于常见乳酸菌或益生菌发酵的乳制品。目前已有研发生产添加了谷物、水果以及蔬菜的功能性发酵乳的报道，如王芬等[5]研制紫米酸奶，赖盈盈等[6]研制葛根酸奶，杨露西等[7]研制藜麦酸奶。这些添加了特定成分的酸奶，在普通发酵乳功能的基础上，又被赋予了新的保健功效，但有关添加了山药和山楂的风味发酵乳的研究却鲜有报道。山药（Dioscorea oppositifolia）为薯蓣科薯蓣属植物的干燥根茎，性平味甘，补气益肾，可健脾除湿[8]，研究发现山药主要具有抗氧化、抗癌、降糖降脂、增强免疫等功能[9-10]。山楂（Crateagus pinnatifida）为蔷薇科山楂属植物的干燥成熟果实，对人体的心血管疾病有预防作用[11]，具有降血脂、血压、强心、抗心律不齐等作用，也可消食健胃、增强食欲。
本研究在鲜牛乳中加入山药浆、保加利亚乳杆菌（Lactobacillusbulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）共同发酵后，搅拌并加入山楂酱混匀，制成一款不仅风味独特，且结合了山药、山楂和酸奶三者保健功能的乳制品。对山药山楂酸奶贮藏期间的理化指标、自由基清除率以及模拟胃肠液反应后的自由基清除率情况进行测定。以期进一步探究山药山楂酸奶的贮藏特性，提供货架期的基本数据，初步探究其在模拟人体消化道环境中的抗氧化特性，并为该类产品进一步研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜牛乳：山西农业大学动物科技学院；新鲜山药、新鲜山楂、白砂糖：市售；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）：山西农业大学食品学院畜产实验室保藏。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：日本东京化成工业株式会社；2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）：北京Solarbio公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
HPP-9272电热恒温培养箱：北京东联哈尔仪器制造有限公司；723 可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；LD4-2A低速离心机：北京雷勃尔离心机有限公司；BL-50立式压力蒸汽灭菌锅：上海东亚压力容器制造有限公司；cm-5型色差仪：柯尼卡美能达有限公司；NDJ-1指针式黏度计：上海羽通仪器仪表厂。
1.3 实验方法
1.3.1 菌种活化
生鲜牛乳煮沸灭菌3 min，冷却至室温，分装于无菌试管中，分别接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的冻干粉、置于恒温培养箱中进行活化培养，反复传代，直至其符合生产发酵剂的要求。
1.3.2 山药浆和山楂酱的制备
新鲜山药去皮切块，与等体积的水混合，打浆，加热糊化，得到山药浆。鲜山楂1 kg，洗净去蒂去籽，加入500 mL水打浆，加500 g白砂糖，搅拌均匀，95 ℃水浴熬制成红褐色透明的糊状，冷却得到山楂酱，备用。
1.3.3 山药山楂酸奶的加工工艺流程及贮藏品质测定
原料乳与山药浆（添加量15%）混合搅拌→均质（70 ℃、15 MPa）→加入白砂糖（添加量7%）→杀菌（90 ℃、10 min）→冷却至20 ℃→接种3%发酵剂（保加利亚杆菌∶嗜热链球菌=1∶1）→搅拌均匀→恒温培养（42 ℃）→发酵（约4 h，直至凝乳形成）→冷却后熟（4 ℃、24 h）→加入山楂酱充分搅拌（添加量3%）→山药山楂酸奶
以不添加山药和山楂的同批鲜奶自制普通酸奶为对照，分别测定两种酸奶在4 ℃条件下贮藏1 d、7 d、14 d、21 d的酸度持水力、乳酸菌总数和抗氧化性等指标，以及模拟胃肠道环境反应后的活菌数和自由基清除率。
1.3.4 分析检测
（1）乳酸菌活菌数的测定
参考GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》中的乳酸菌计数法，测定乳酸菌活菌总数。
（2）酸度
根据GB/T 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的测定》中的方法[12]测定。
（3）黏度
采用黏度计直接测定。
（4）色差
使用色差仪测定酸奶样品的色值（明亮度L*值，红绿a*值和黄蓝b*值），总色差ΔE*=（Δa*2+Δb*2+ΔL*2）1/2，ΔE*＞2时的颜色变化容易被人眼观察到。
（5）持水力
取一定质量（M1）的酸奶于离心管；4 000 r/min离心10 min，弃上清液，称剩余物质质量（M2）[13]。持水力好的酸奶在贮藏过程中不易析出乳清。持水力计算公式如下：
（6）自由基清除率测定
DPPH自由基清除率参考WU X等[14]的方法测定；ABTS自由基清除率参考LIANG L H等[15]的方法测定。
1.3.5 模拟胃肠液的制备及消化模拟反应
参考谢海军等[16]的方法，制备模拟胃液、肠液。山药山楂酸奶和对照酸奶进行胃肠环境模拟反应后，测定DPPH及ABTS自由基清除率。
1.3.6 数据处理
运用SPSS 17.0进行单因素方差分析，计量资料采用Duncan's多重比较检验，使用SigmaPlot 10.0作图。
2 结果与分析
2.1 山药山楂酸奶贮藏期间活菌数的变化
酸奶作为含有活菌的发酵乳品，其中的乳酸菌对人体健康有着特殊的作用，如果活菌数量不达标，则难以发挥其在人体内的功效[17]。山药山楂酸奶及对照酸奶中的乳酸菌活菌数在4 ℃下贮藏21 d的变化情况见图1。
图1 两种酸奶贮藏期间活菌数的变化情况
Fig.1 Changes of the viable bacteria number of two kinds of yoghurt during storage period
由图1可以看出，山药山楂酸奶乳酸菌活菌数在1～7 d时较高且无明显差异（P＞0.05），14 d、21 d时下降；对照酸奶随着贮藏时间的延长，活菌数逐渐降低。在1 d时，山药山楂酸奶的活菌数显著高于普通酸奶（P＜0.05），分别为8.61 lg（CFU/g）、8.48 lg（CFU/g）。山药山楂酸奶在储藏的21 d内，乳酸菌活菌数均高于对照酸奶，可能是由于山药中的低聚糖对乳酸菌的生长起到了促进作用[18]。不仅如此，在试验期间，山药山楂酸奶的活菌数一直保持在7.92 lg（CFU/g）以上，超过国标规定的发酵乳货架期乳酸菌活菌数≥6.00 lg（CFU/g）的要求。
2.2 山药山楂酸奶贮存期间酸度变化
酸度会对酸奶的口感，乳酸菌的生长代谢有一定的影响[19]。山药山楂酸奶及对照酸奶在4 ℃下贮藏21 d的滴定酸度变化情况见图2。
图2 两种酸奶贮藏期间滴定酸度的变化情况
Fig.2 Changes of titration acidity of two kinds of yoghurt during storage period
从图2可以看出，在贮藏21 d内山药山楂酸奶和对照酸奶滴定酸度均有所上升，贮藏1 d时山药山楂酸奶的滴定酸度为80.50°T，显著高于对照酸奶的74.75°T（P＜0.05）；贮藏7 d时，对照酸奶的滴定酸度为98.01°T，显著高于山药山楂酸奶的92.10°T（P＜0.05）。贮藏14 d和21 d时，两种酸奶滴定酸度差异不显著（P＞0.05）。
2.3 山药山楂酸奶贮存期间持水力和黏度变化
持水性好的发酵乳在贮存期间不易析出乳清，黏度适中的发酵乳口感更好。山药山楂酸奶及对照酸奶在4 ℃下贮藏21 d持水性、黏度的变化情况见图3。
由图3a可知，两种酸奶在储存期间的持水性都呈现下降趋势，可能是由于冷藏期间pH的变化以及凝胶结构的变化导致[20]。在整个实验的四次测定中，山药山楂酸奶的持水力均显著低于对照酸奶（P＜0.05）。原因可能是添加了山药浆及山楂酱破坏了酸奶由酪蛋白颗粒构成的凝胶结构，降低了蛋白质分子之间的亲和力，导致蛋白质胶体结合水的含量有所减少[21]，造成酸奶的持水力降低。另外，酸奶的持水力还与酪蛋白浓度有关[22]，由于加入的山药浆在制备过程中加入了水，造成原料乳中酪蛋白浓度下降，使其持水力低于对照酸奶。由图3b可知，两种酸奶的黏度都在贮藏1～14 d时降低，贮藏21 d有所提高，但山药山楂酸奶的变化趋势相对缓和。贮藏1 d时，对照酸奶的黏度为2 341.67 mPa·s，显著高于山药山楂酸奶的2 000.03 mPa·s（P＜0.05）。对照酸奶在第7天的黏度迅速下降，贮藏7 d、14 d、21 d时山药山楂酸奶的黏度均显著高于对照酸奶（P＜0.05）。
图3 两种酸奶贮藏期间持水力（a）及黏度（b）的变化情况
Fig.3 Changes of water holding capacity (a) and viscosity (b) of two kinds of yoghurt during storage period
2.4 山药山楂酸奶贮存期间色差的对比
山药山楂酸奶及对照酸奶在4 ℃下贮藏21 d的颜色变化情况见表1。
由表1可知，在贮藏期间，两种酸奶的L*值都呈现上升的趋势；山药山楂酸奶的a*值在贮藏1～7 d下降，贮藏14～21 d保持相对稳定，对照酸奶的a*值在贮藏1～14 d下降，贮藏14 d与21 d的a*值相同。贮藏期间，山药山楂酸奶的b*值总体上升，但在贮藏14 d时有所下降，对照酸奶的b*值平稳上升。1 d时对照酸奶的L*值为67.1，显著高于山药山楂酸奶的63.57（P＜0.05），表明其颜色相对偏白，可能是山楂中色素的存在以及山药氧化变色导致的这一差异。
由表1可知，贮藏1～7 d，7～14 d，14～21 d时山药山楂酸奶的总色差ΔE*的变化值分别为4.53、1.49、2.88；对照酸奶的总色差ΔE*的变化值分别为0.26、2.54、1.51，山药山楂酸奶的颜色变化较为明显。LAGO-VANZELA E S等[23]研究发现，总酚含量和黄酮含量都会对a*值、b*值产生一定的影响，山药中的酚类物质以及山楂中的黄酮对山药山楂酸奶的颜色变化产生了影响。
表1 两种酸奶样品在贮藏期间色差的对比
Table 1 Comparison of color difference of two yogurt samples during storage period
注：大写字母表示同一贮藏时间下两种酸奶差异显著（P＜0.05），小写字母表示同一样品不同贮藏时期差异显著（P＜0.05）。
2.5 山药山楂酸奶贮存期间及胃、肠液模拟后自由基清除率变化
山药山楂酸奶及对照酸奶在4 ℃下贮藏21 d的DPPH、ABTS自由基清除率见表2和表3。
表2 两种酸奶样品在贮藏期间的DPPH自由基的清除率对比
Table 2 Comparison of DPPH free radical scavenging rate of two yogurt samples during storage period
注：大写字母为两种酸奶及其胃肠液模拟反应后清除率差异显著（P＜0.05），小写字母为不同贮藏时期的清除率差异显著（P＜0.05）。下同。
表3 两种酸奶样品在贮藏期间的ABTS自由基的清除率对比
Fig.3 Comparison of ABTS free radical scavenging rate of two yogurt samples during storage period
由表2和表3可知，两种酸奶冷藏过程中DPPH自由基的清除率变化规律相似，都随贮藏时间的延长而呈先下降后保持稳定的趋势，而ABTS自由基清除率在前低温（4 ℃）贮藏14 d呈现略微上升的趋势，低温（4 ℃）贮藏21 d时有所下降。总体上看，未经过胃肠液处理的情况下，山药山楂酸奶在贮藏过程中对两种自由基清除率均显著高于对照酸奶（P＜0.05）。可能是由于其中山药浆中的多糖、酚类等抗氧化成分发挥了作用，以及乳酸菌的活菌数较高，乳酸菌发酵会生成含有传递质子能力的化合物，使自由基清除率升高[24]。另外，山楂含有的多糖成分是一种供氢物质，能与自由基相结合而形成稳定的物质，阻止了自由基链式反应进一步延续[25]。
进一步分析可知，经过胃液模拟反应和和肠液模拟反应后，都会导致两种酸奶的DPPH和ABTS自由基清除能力下降，下降程度有所不同。原因可能是由于乳酸菌受到胃液肠液环境胁迫，导致活性大大降低，也可能是酸奶中的抗氧化物质在胃肠液环境下被分解，特别是一些活性肽。不仅如此，在低温（4 ℃）贮藏1 d时，山药山楂酸奶经过胃肠液模拟反应后的ABTS自由基清除率，和未处理的普通酸奶的清除率差异不显著（P＞0.05），充分体现了山药山楂酸奶在模拟人体消化实验中的抗氧化能力的优势。
3 结论
在低温贮藏期间（4 ℃、21 d），山药山楂酸奶相比于对照酸奶的乳酸菌活菌数更高，pH较低，黏度随贮藏时间延长而缓慢下降，变化趋势更稳定，DPPH、ABTS自由基清除率显著高于对照酸奶。两种酸奶在冷藏过程中的自由基清除能力均有所降低；在模拟胃、肠液环境反应后，两者的自由基清除率虽有不同程度的下降，但山药山楂酸奶的自由基清除率仍显著高于对照酸奶，一定程度上说明了山药山楂酸奶可以在人体消化道内更好的发挥抗氧化作用。
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