木薯（Manihot esculenta Crantz）属于热带和亚热带根茎作物，是全球第六大粮食作物[1-2]。华南9号木薯块根富含淀粉、维生素、膳食纤维和钾、钙、磷等矿物质元素，营养丰富且口感清甜，是一种对人体健康有益的优质杂粮[3-5]。
针叶樱桃（Malpighia glabra）原产于热带美洲，在我国于20世纪50年代引种栽培成功[6]。针叶樱桃果实中含有多种维生素、糖类、果酸、矿物质元素以及特有的抗衰老因子，其鲜果中维生素C（vitamin C，VC）含量为1 215～3 024 mg/100 g[7]，因此被誉为“天然维C果王”[8]。维生素C是维持人体生命活动不可欠缺的重要成分，可以增强机体免疫力，对预防坏血病以及抗肿瘤有一定功效[9]。新鲜的针叶樱桃水分含量高，储藏不稳定，易腐败，从而造成经济损失。因此，针叶樱桃的深加工是一种减少损失及提高其附加值的有效方式。
目前，木薯已被加工成木薯汁[1]、木薯糕、木薯酥性饼干[9]等食物，但产品较为单一且加工新技术尚未完善，从而致使木薯产值受到制约。目前碳酸饮料、果汁饮料、乳制品饮料占据国内饮料市场，而粮食饮料相对较少[10]，尤其是以谷物和水果为基础的复合型饮料产品。因此，开发木薯针叶樱桃饮料不仅可以促进木薯产业的经济发展，拓宽粮食饮料的市场，还能满足人们对健康饮食的需求。本研究以木薯和针叶樱桃为主要原料，对其饮料的发酵工艺进行优化及对发酵饮料的质量进行评价，旨在为开发功能性复合益生饮料提供理论依据，对进一步开发木薯与针叶樱桃的价值提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
华南9号木薯：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所基地；针叶樱桃：海南省定安县；植物乳杆菌（Lac-tobacillus planta rum）HCN7、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）YLC92：海南大学食品科学与工程学院实验室；耐高温α-淀粉酶（2 000 U/g）、MRS培养基、葡萄糖、果糖和乳酸标准品：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
LGJ-30F中试冷冻干燥系统：北京松源华兴科技发展有限公司；JYL-Y11高速破壁打浆机：九阳股份有限公司；YM50FGN全自动高灭菌锅：上海泸誉贸易公司；Agilent 1200高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）：安捷伦科技（中国）有限公司；BCD-201D容声冰箱：海信容声冰箱有限公司；SW-CJ-17-D型超净工作台：苏州佳宝净化工作设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌悬液的制备
从-80 ℃超低温冰箱中分别取出含有冻存菌株（植物乳杆菌HNC7和副干酪乳杆菌YLC92）的冻存管，置于室温条件下溶解，在无菌条件下吸取原菌液100 mL接入MRS液体培养基中，37 ℃培养18 h，传代2次，活化后的菌液经离心（4 000×g，4 ℃）后重悬于无菌蒸馏水，得到菌悬液。将菌悬液按1∶1混合，制得的菌悬液备用。
1.3.2 木薯针叶樱桃饮料的工艺流程及操作要点
操作要点：
木薯去皮后切成小块（2 cm×2 cm×2 cm），于-20 ℃冰箱中冷冻。冷冻的木薯块取出于室温条件下解冻，按料液比1∶6（g∶mL）加水打浆，加入耐高温α-淀粉酶进行酶解，酶解后煮沸10 min灭酶，后迅速冷却至室温后用纱布（80目）过滤木薯匀浆，再用循环水式真空泵（功率60 W，真空度0.089 MPa，抽速10 L/min）抽滤得到木薯汁[11]。
新鲜的针叶樱桃经挑选、洗净、除核后，进行真空冷冻干燥[12]并将其打粉，果粉置于4 ℃冰箱备用。按果粉与水1∶8（g∶mL）的料液比混合后抽滤得到针叶樱桃汁。
木薯汁与针叶樱桃汁以4∶1（V/V）进行调配，经灭菌（85 ℃水浴保温5 min）、冷却至37 ℃后，接入菌液进行发酵，所得饮料110 ℃杀菌15 s后迅速冷却[6]，得到产品。
1.3.3 木薯浆酶解条件优化正交试验
表1 木薯浆酶解条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for cassava pulp enzymolysis conditions optimization
依据前期试验结果[13]，以酶添加量（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）为3个因素，原料利用率[3]为考察指标，设计3因素3水平正交试验以确定最佳木薯浆酶解条件，正交试验因素与水平见表1。
1.3.4 木薯针叶樱桃饮料发酵条件优化单因素试验
分别考察发酵剂接种量（1%、2%、3%、4%、5%），发酵温度（33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃），发酵时间（6 h、12 h、18 h、24 h、30 h）对木薯针叶樱桃饮料感官评分的影响。
1.3.5 木薯针叶樱桃饮料发酵条件优化响应面试验
在发酵单因素试验基础上，以发酵剂接种量（D）、发酵温度（E）、发酵时间（F）为试验因素，感官评分（Y）为响应值。根据Box-Behnken中心组合原理，设计响应面优化试验以确定木薯针叶樱桃饮料的最佳发酵工艺，其因素与水平设计见表2。
表2 木薯针叶樱桃饮料发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface experiments for cassava-acerola cherry juice fermentation conditions optimization
1.3.6 感官评价方法
感官评价：由10名食品科学与工程学院老师及同学组成评鉴小组，参考GB/T 31121—2014《食品安全国家标准果蔬汁类及其饮料》[14]，对产品进行单项与综合评分，评价标准见表3。
表3 木薯针叶樱桃饮料感官评分标准
Table 3 Sensory evaluation standards of the cassava-acerola cherry beverage
1.3.7 理化指标测定
可溶性固形物：用便携式折光仪测定；pH：用酸度计测定；总酸：滴定酸法测定[15]；乳酸、葡萄糖和果糖：采用高效液相色谱法测定[16]；抗氧化性：按照参考文献[17]的方法测定；菌落总数：采用平板计数法测定[18]；大肠杆菌：采用大肠菌群计数法测定[19]；维生素C：按照参考文献[20]的方法测定。
2 结果与分析
2.1 木薯浆酶解条件优化正交试验
由表4可知，各因素对木薯汁原料利用率的影响大小顺序为酶解温度＞酶解时间＞酶添加量。木薯浆最佳酶解条件为A3B2C2，即酶添加量为100 U/g、酶解温度85 ℃、酶解时间2 h，在此条件下，木薯汁的原料利用率最高达84.63%。
表4 木薯浆酶解条件优化正交试验结果与分析
Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for cassava pulp enzymolysis condition optimization
注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
2.2 饮料发酵条件优化单因素试验结果
2.2.1 发酵剂接种量对木薯针叶樱桃饮料感官品质的影响
图1 发酵剂接种量对木薯针叶樱桃饮料感官品质的影响
Fig.1 Effect of starter inoculum on sensory quality of the cassava-acerola cherry beverage
由图1可知，随着接种量的增加，木薯针叶樱桃饮料的感官评分及乳酸含量均呈先升高后降低的趋势。接种量为3%时，感官评分最高为96分，乳酸含量最高为4.6 g/L。当接种量＞3%后，乳酸含量随之降低导致饮料的乳酸风味不足，感官评分降低。因此，选择木薯针叶樱桃饮料的最佳接种量为3%。
2.2.2 发酵温度对木薯针叶樱桃饮料感官品质的影响
图2 发酵温度对木薯针叶樱桃饮料感官品质的影响
Fig.2 Effect of fermentation temperature on sensory quality of the cassava-acerola cherry beverage
由图2可知，随着发酵温度的升高，木薯针叶樱桃饮料的感官评分及乳酸含量均呈先升高后降低的趋势。发酵温度为37 ℃时，感官评分最高为91分，乳酸含量最高为4.47 g/L。发酵温度高于或者低于37 ℃时，感官评分均较低。因此，选择木薯针叶樱桃饮料的最佳发酵温度为37 ℃。
2.2.3 发酵时间对木薯针叶樱桃饮料感官品质的影响
图3 发酵时间对木薯针叶樱桃饮料感官品质的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on sensory quality of the cassava-acerola cherry beverage
由图3可知，随发酵时间的延长，木薯针叶樱桃饮料的感官评分呈先升高后降低的趋势，乳酸含量随发酵时间延长而逐渐升高。发酵时间为24 h时，感官评分最高为94分，乳酸含量为5.38 g/L。发酵时间短会导致乳酸菌数少，从而不能完全发酵营养物质。当发酵时间为30 h时，感官评分最高为84分，乳酸含量为5.60 g/L。与发酵24 h相比，饮料发酵30 h后，其感官评分下降较多而乳酸含量增加不明显。因此，选择木薯针叶樱桃饮料的最佳发酵时间为24 h。
2.3 饮料发酵条件优化响应面试验
以发酵剂接种量（D）、发酵温度（E）、发酵时间（F）为试验因素，感官评分（Y）为响应值进行Box-Behnken试验，试验结果与分析见表5，模型方差分析见表6。
表5 木薯针叶樱桃饮料发酵条件优化响应面试验设计与结果
Table 5 Design and results of response surface experiments for cassava juice enzymolysis conditions optimization
通过Design Expert 8.0.6软件对试验数据进行分析，从而得到木薯针叶樱桃饮料感官评分（Y）的回归方程：
Y=89.8+0.88D-0.37E-6.5F-DE-2.25DF+3.25EF-8.15D2-9.65E2-15.40F2
表6 模型方差分析结果
Table 6 Results of variance analysis of model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01），“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
由表6可以看出，回归模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.128 0＞0.05），表明木薯针叶樱桃饮料数据模型的选取具有合理性。模型的决定系数R2=0.979 8，校正决定系数R2adj=0.953 8，变异系数（coefficient of variation，CV）=3.48%，表明试验模拟较好，可以用该模型对木薯针叶樱桃饮料的加工工艺参数进行可靠的预测。由F值大小可以得出各因素对木薯针叶樱桃饮料的感官品质的影响大小顺序为F＞D＞E。一次项F及二次项D2、E2、F2的P值均小于0.01，表明其对饮料感官品质的影响极显著，交互项EF的P＞0.05，表明其对饮料感官品质的影响显著。综上所述，该模型能较好地反映接种量、发酵温度、发酵时间与饮料感官品质之间的关系。
图4 发酵剂接种量、发酵温度、发酵时间交互作用对木薯针叶樱桃饮料感官评分影响的响应面及等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between starter inoculum,fermentation temperature and time on sensory scores of cassava-acerola cherry beverage
发酵剂接种量、发酵温度和发酵时间的交互作用响应面及等高线图见图4。响应面图和等高线图能较为直观的反映两两因素对试验结果的影响，响应面的坡度越陡表明因素间的交互作用越显著[21]。由图4可以看出，发酵温度和发酵时间的响应面曲面较陡，这说明二者的交互作用对饮料的感官评分的影响较大，而其余两两因素的交互作用影响较小，与方差分析结果较为一致。
通过Design Expert 8.0.6软件对回归模型进行预测得到的饮料最佳加工工艺为：接种量3.089%、发酵温度36.88 ℃、发酵时间22.65 h，饮料感官评分的预测值为90.578分。考虑到实际操作的可行性，将饮料的加工工艺条件调整为接种量3%，发酵温度37 ℃，发酵时间23 h。在此优化加工工艺条件下进行3次平行试验，得到饮料感官评分的均值90.2分，与预测值相近，说明本实验采用的回归模型具有实际指导意义。
2.4 木薯针叶樱桃发酵饮料产品品质分析
木薯针叶樱桃发酵饮料的可溶性固形物含量为5.83%；pH为3.17；乳酸含量为5.38 g/100 mL；总酸含量为60.53 g/L；葡萄糖含量为1.30 g/L；果糖含量为0.06 g/L；抗氧化性为78.39%；维生素C含量为346.7 mg/100 mL；菌落总数＜100 CFU/mL；大肠杆菌总数＜3 MPN/100 mL，未检测出致病菌，各项指标均在国家标准规定的范围内。
3 结论
本研究在单因素试验基础上，分别采用正交试验和Box-Behnken响应面法对木薯酶解条件及饮料的发酵工艺进行优化，并对发酵饮料的理化指标进行测定。结果表明，木薯浆最佳酶解条件为耐高温α-淀粉酶添加量100 U/g、酶解时间2 h、酶解温度85 ℃；木薯针叶樱桃饮料的最佳发酵条件为乳酸菌接种量3%，发酵时间23 h，发酵温度37 ℃。根据最佳条件制得的发酵饮料的感官评分为90.2分，具有针叶樱桃特有果香及一定的抗氧化活性，且富含维生素C。本研究得出的最佳发酵工艺具有较好的实际应用价值，能促进新型发酵木薯产品的开发。木薯针叶樱桃发酵饮料作为一种非乳制品功能饮料，尤其适用于具有乳糖不耐症的人群。
[1]刘畅，刘宇，刘石生.甜木薯饮料加工工艺研究[J].食品工业，2014，35（10）：139-142.
[2]张箭.木薯发展史初论[J].中国农史，2011（2）：19-30.
[3]黄洁，单荣芝，李开绵，等.优质鲜食木薯新品种华南9 号[J].中国热带农业，2006（5）：47-48.
[4]古碧，李健，龙罡，等.生长期对广西产地华南9 号木薯品质特性的影响[J].热带农业科学，2014，34（4）：13-18.
[5]段春芳，熊贤坤，任树琴，等.几种食用木薯品种生长发育及产量性状分析[J].西南农业学报，2017，30（12）：2764-2768.
[6]鞠雪莉，谭海生，杨劲松，等.响应面法优化针叶樱桃黄酒的发酵工艺[J].热带作物学报，2019，40（5）：987-994.
[7]钟义红，孙杰，李世芬，等.针叶樱桃提取物增强小鼠细胞与体液免疫功能[J].食品研发与开发，2014，34（12）：76-80.
[8]MEZADRI T,VILLANO D,FERNANDEZ-PACHON M S,et al.Antioxidant compounds and antioxidant activity in acerola (Malpighia emarginata DC.)fruits and derivatives[J].J Food Compos Anal,2008,21(4):282-290.
[9]谢辉，何艾，窦志浩，等.木薯营养酥性饼干的研制[J].食品工业，2013（6）：4-7.
[10]李祥印，谭道亮，王晓.甘薯饮料生产工艺应用研究[J].山东农业科学，2004（2）：42-43.
[11]曹盼.燕麦果汁复合饮料的研制[D].无锡：江南大学，2012.
[12]SONG B,TAN H,YANG J.Effect of three drying methods on the drying kinetics and quality of acerolacherry[J].J Food Process Preservat,2020,44(9):1-10.
[13]魏爱丽，张学武.木薯淀粉酶解工艺的优化[J].现代食品科技，2008，24（12）：1250-1253.
[14]国家食品药品监督管理总局.GB/T 31121—2014 果蔬汁类及其饮料[S].北京：中国标准出版社，2014.
[15]国家食品药品监督管理总局.GB/T 12456—2008 食品中总酸的测定[S].北京：中国标准出版社，2008.
[16]WOJDYŁO A,NOWICKA P,
P.Phenolic and carotenoid profile of new goji cultivars a nd their anti-hyperglycemic,anti-aging and antioxidant properties[J].J Funct Food,2018,48:632-642.
[17]HASHEMI S M B,KHANEGHAH A M,BARBA F J,et al.Fermented sweet lemon juice(Citrus limetta)using Lactobacillus plantarum LS5:Chemical composition,antioxidant and antibacterial activities[J].J Funct Food,2017,38:409-414.
[18]国家食品药品监督管理总局.GB 4789.2—2016 食品微生物学检验菌落总数测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[19]国家食品药品监督管理总局.GB 4789.3—2016 食品微生物学检验大肠菌群计数[S].北京：中国标准出版社，2016.
[20]国家食品药品监督管理总局.GB 5009.86—2016 食品中抗坏血酸的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[21]PENG B,LEI Y,ZHAO H,et al.Response surface methodology for optimization of fermentation process parameters for improving apple wine quality[J].Food Sci Technol,2015,52(11):7513-7518.