苦荞（Fagopyrum tataricum）即苦荞麦，学名鞑靼荞麦，属于蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrium）一年生草本双子叶植物，是一种食药两用的优质粮源[1-2]。其味略苦，具有耐旱、耐寒、耐酸、耐瘠、适应性强及生长期短等特点，在全世界各地都有生产和消费[3-4]。荞麦的种植历史悠久，主要分为苦荞和甜荞两大类[5]。苦荞在我国已有2 000多年的栽种历史，起源自喜马拉雅山系东侧及我国西南地区，现广泛栽培于我国西南地区，是世界苦荞的集中产地，常年播种面积在53万hm2以上[6-7]。据《本草纲目》记载：“苦荞味苦、性平寒，能实肠胃、益气力、缓精神、利耳目、降气、宽肠、健胃的作用”。黄酮类化合物是苦荞中最为重要的生物活性成分[8]，具有抗病毒、清除自由基、延缓衰老、抑菌杀菌等功效[9]。苦荞淀粉含量高于其他粮食作物，且支链淀粉含量丰富，是用于发酵酿造的理想原料[10]。苦荞麦作为一种重要的农作物，为充分利用苦荞资源，提高原料利用率，具有极高的开发价值与广阔的开发前景。
近年来，苦荞因其具有较高的营养价值和保健功能[10]，得到众多专家学者的青睐。在食品方面，苦荞被用来制作苦荞馒头、苦荞醋和苦荞茶等[11-14]。但是把苦荞作为酿酒原料来研究的国家并不多，我国就是其中之一。如徐汉卿等[15-16]对苦荞米酒的发酵工艺进行探究，以苦荞和糯米为主要原料，酿得的苦荞米酒营养丰富、口感醇厚，风味独特，是一种符合现代人健康理念的饮品；周火玲等[7]以大曲和小曲为糖化发酵剂，入池时以荷叶垫池底，入池后使用苦荞黄酒淋醅，建立了一种苦荞白酒的酿造新工艺，以此法酿制的苦荞酒，出酒率提高了7.7%，总酸、总酯含量提高了50%以上，有独特的营养价植及绝佳的口感。
本研究以苦荞为原料，小曲为糖化发酵剂，采用半固态发酵方法[17]，从不同小曲添加量、培菌糖化温度及培菌糖化时间对苦荞小曲酒培菌糖化工艺进行研究，确定其最优工艺条件，通过分析半固态发酵法苦荞小曲酒的理化指标、感官品评与挥发性风味成分，为后续苦荞小曲酒的工艺优化提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苦荞：四川省凉山彝族自治州；小曲：重庆市合川区鑫星曲药厂；酒石酸钾钠、五水硫酸铜、氢氧化钠、葡萄糖、亚铁氰化钾、盐酸、邻苯二甲酸氢钾、硫酸（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司。
1.2 仪器与设备
HWS-12电热恒温水浴锅：上海齐欣科学仪器有限公司；MB25水分分析仪：奥豪斯仪器（上海）有限公司制造；DL-1电子万用炉：北京市永光明医疗仪器有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；GZ-250-S生化培养箱：韶关市广智科技设备有限公司；AR1140电子天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；Thermo 868 pH计：热电（上海）科技仪器有限公司；TSQ8000气相色谱质谱联用（gas chromatography-mass spectrum，GC-MS）仪：美国Thermo公司。
1.3 试验方法
1.3.1 苦荞小曲酒工艺流程及操作要点
苦荞→浸泡→蒸粮→摊凉→拌入小曲→培菌糖化→加水发酵→蒸馏→苦荞小曲酒
操作要点：
浸泡：苦荞常温水浸泡4 h，料水比1∶3（g∶mL），要求浸后苦荞手捏易碎，无硬芯；
蒸粮：将浸泡好的苦荞沥去水分，于常压下蒸煮1.5 h至苦荞开小口；
摊凉：将蒸好的苦荞取出后适当加水并迅速翻粮快速降温，摊冷至品温40 ℃左右开始下曲；
拌小曲：小曲添加量按0.6%拌入，分3次加入小曲（三次加量尽量一致）；
培菌糖化：摊凉、拌曲和上箱在2 h内完成，防止杂菌感染，以免影响培菌，在糖化温度30 ℃条件下糖化25 h；
加水发酵：按料水比1∶2（g∶mL）加水发酵，于28 ℃恒温发酵7 d，发酵必须密封但要保证发酵气体能排出；
蒸馏：半固态发酵的酒醅采用液态蒸馏法，得到苦荞小曲酒。
1.3.2 培菌糖化工艺优化单因素试验
小曲添加量：分别称取500 g苦荞，按照1.3.1的工艺对苦荞进行泡粮蒸粮后，分别添加0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%的小曲，在30 ℃条件下恒温糖化24 h，测定其还原糖含量和淀粉含量。
在此基础上，依次考察糖化时间（20 h、22 h、24 h、26 h、28 h）、糖化温度（24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃）对还原糖和淀粉含量的影响。
1.3.3 糖化工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，以还原糖含量为评价指标，采用正交试验对小曲添加量（A）、糖化时间（B）和糖化温度（C）进行优化，确定苦荞小曲酒的最佳培菌糖化条件。正交试验因素与水平见表1。
表1 糖化工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for saccharification process optimization
1.3.4 理化指标测定[18-19]
还原糖、淀粉、固形物含量的测定：参照《酿酒分析与检测》；酒精度的测定：参考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》中的酒精计法；总酸、总酯的测定：参考GB/T 10345—2007《白酒分析方法中的总酸、总酯测定》中的指示剂法。
1.3.5 原料出酒率的计算
1.3.6 感官评定[20]
感官评价由有专业经验的白酒品评人员对试验所得的原酒进行感官评定，感官评定按照食品安全地方标准DBS52/005—2014《小曲清香型白酒》中的方法进行，评分标准见表2，满分100分。
表2 苦荞小曲酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu
1.3.7 苦荞小曲酒挥发性风味成分分析[21]
苦荞小曲酒中挥发性风味成分测定采用GC-MS法。
气相色谱（GC）条件：TG-WaxMS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度250 ℃；载气为高纯氦气（He），流速1.0 mL/min；进样量1 μL，分流比30∶1；程序升温：初始柱温40 ℃，保留3 min，以5 ℃/min升至70 ℃，保留0 min，再以8 ℃/min升至180 ℃，保留0 min，再以20 ℃/min升至250 ℃，保留5 min。
质谱（MS）条件：离子源为电子电离（electronic ionization，EI）源；离子化电子能量70 eV；采集模式为全扫描；接口温度230 ℃；离子源温度280 ℃，传输线温度260 ℃，质量范围30～550 amu。
定性定量方法：将经过分析得到的总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索并与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）数据库中的标准质谱图核对，对各挥发性成分进行定性，按峰面积归一化法计算各风味成分的相对含量。
2 结果与分析
2.1 糖化工艺优化单因素试验
2.1.1 小曲添加量的确定
在泡粮与蒸粮工艺都相同的条件下，小曲接种量分别采用0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%的条件下进行培菌糖化24 h，分别测定粮醅的还原糖与淀粉含量，结果见图1。
图1 不同小曲添加量对还原糖和淀粉含量的影响
Fig.1 Effect of different Xiaoqu addition on reducing sugar and starch contents
不同大、小写字母分别表示淀粉、还原糖含量的差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1可知，随着小曲添加量在0.3%～1.5%范围内的增加，淀粉含量呈先下降，后上升的趋势，在小曲接种量达到0.6%时淀粉含量达到最低，为10.59%，小曲添加量为1.2%与1.5%时差异性不明显（P＞0.05），其余各组之间均存在显著性差异（P＜0.05）；粮醅中还原糖含量呈先上升再下降的趋势，在小曲接种量达到0.6%时还原糖含量达到最高，为10.99%，并且五组变量之间均呈现显著性差异（P＜0.05）。李大和等[22]研究的川法小曲白酒用曲量一般为0.30%～0.55%，并且经实践生产证明随着酒曲添加量增加，发酵过于猛烈，酒出现苦味。因此，确定最佳小曲添加量为0.6%。
2.1.2 糖化时间的确定
由图2可知，随着糖化时间在20～24 h范围内的的增加，还原糖含量呈明显的上升趋势且慢慢趋于平稳，淀粉含量呈下降趋势。培养到24 h时，还原糖含量为11.0%，若继续培养，此时淀粉含量呈下降趋势，但还原糖含量基本保持不变，其原因可能是淀粉酶活力增长缓慢甚至不增长，并且根霉、酵母等微生物的生长繁殖过多的消耗淀粉分解的还原糖[3]。而且培养时间过长容易出现老箱，还原糖含量高，发酵升温快，对发酵不利。因此，确定最佳糖化时间为24 h。
图2 不同糖化时间对还原糖和淀粉含量的影响
Fig.2 Effect of different saccharification time on reducing sugar and starch contents
2.1.3 糖化温度的确定
由图3可知，不同的糖化温度对还原糖含量的影响较大，糖化温度在30 ℃时，还原糖含量最高，达到11.23%，此时淀粉含量最低，为10.68%。当温度＜30 ℃时，还原糖含量低，其原因可能是根霉生长缓慢，酶活力较低。当温度达到30 ℃后，随着温度的升高，可能造成根霉和曲霉的繁殖速度加快，导致中心温度升高，箱内有闷气，使得微生物的生长繁殖受到抑制同时使分解淀粉转化为还原糖的能力也降低，故在30 ℃后，淀粉含量上升，还原糖含量下降。因此，确定最佳发酵温度为30 ℃。
图3 不同糖化温度对还原糖和淀粉含量的影响
Fig.3 Effect of different saccharification temperature on reducing sugar and starch contents
2.2 糖化工艺优化正交试验
在单因素试验基础上，以还原糖含量为评价指标，进行3因素3水平正交试验设计，正交试验结果与分析见表3，方差分析见表4。
表3 糖化工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for saccharification process optimization
由表3可知，苦荞小曲酒培菌糖化工艺对还原糖含量的影响因素主次顺序为A＞C＞B，即小曲添加量＞糖化温度＞糖化时间，得出A2B3C2为最优组合，即小曲添加量0.6%，糖化时间25 h，糖化温度30 ℃。在此最佳条件下进行3次平行验证试验，苦荞小曲酒还原糖含量为11.33%。
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results
注：F0.05（2，2）=19，F0.01（2，2）=99，“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
由表4可知，小曲添加量对糖化过程中还原糖含量有显著性的影响（P＜0.05），而糖化时间和糖化温度对还原糖含量的影响不显著（P＞0.05）。
2.3 糖化过程中各指标变化
由图4可知，在正交试验所得最佳工艺条件下糖化，即小曲添加量0.6%，糖化时间25 h，糖化温度30 ℃。在培菌糖化过程中，淀粉含量整体呈下降趋势，在18 h前下降比较明显，然后就缓慢下降。主要原因是小曲中的主要成分是根霉，在苦荞经过蒸煮后淀粉糊化，然后加入小曲进行糖化，根霉菌吸收糊化了的淀粉为养料生长繁殖，在繁殖过程中又将淀粉转化为还原糖，所以淀粉含量呈逐渐减少的趋势；还原糖含量在前12 h变化不明显，在12 h后明显增加，在25 h还原糖含量达到最大值，然后逐渐平稳。在糖化前期主要是根霉菌和酵母菌的生长繁殖，到中期后才开始产生大量的还原糖，到了后期淀粉原料基本消耗完，所以还原糖含量在后期基本不再增加；温度整体呈现先下降后上升的趋势，在后期有少许的下降。由于拌曲温度范围在36～37 ℃左右，所以前期温度会从拌曲温度慢慢降至糖化温度，随后微生物也开始生长繁殖同时释放热量，所以温度在中期持续上升，到后期营养物质耗尽微生物几乎停止生长也就不再继续释放热量，温度就稍有下降。
图4 糖化过程中温度、还原糖含量和淀粉含量的变化
Fig.4 Changes of temperature,reducing sugar contents and starch contents during saccharification process
2.4 苦荞小曲酒理化指标分析
在研究确定的最佳糖化工艺条件下进行小试试验，取3批次发酵的基酒进行出酒率、总酸、挥发酸及总酯的测定，结果见表5。由表5可知，半固态苦荞小曲酒酒精度为51.3%vol，平均出酒率为57.25%，总酸含量为0.536 g/L，总酯含量为1.95 g/L，感官评分为83分。酿出的苦荞小曲酒清亮透明，具有乙酸乙酯为主体的复合香气，伴有苦荞米特有的清香，不暴辣、不冲鼻、入口绵柔醇和、香味较协调。符合小曲固态法白酒中各项指标的要求[23]。
表5 苦荞小曲酒品质指标分析结果
Table 5 Analysis results of quality indexes of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu
2.5 苦荞小曲酒挥发性风味成分分析
由表6可知，利用GC-MS对半固态苦荞小曲酒挥发性风味成分进行检测，其中挥发性物质主要为有机酸、酯类、醇类、羰基化合物，其中酯类含量最多，且主要以乙酯的形式存在。半固态发酵法酿造苦荞小曲酒共检出31种挥发性物质，其中酯类14种，其中醇类9种，酸类3种，其他类5种。结果表明，酯类化合物是构成小曲酒挥发性香气的重要物质，主要以乙酯的形式存在，它们赋予小曲酒水果香、花香的感官特征。醇类化合物中，除乙醇外含量较高的是异戊醇、异丁醇、苯乙醇、2-丁醇、正丙醇，其中异丁醇、正丙醇略有葡萄酒香，苯乙醇是玫瑰香味的典型代表。另外，异丁醇、异戊醇是杂醇油的主要成分，含量过高会使头痛、头晕等[24]。异丁醇、异戊醇等高级醇含量偏高是影响小曲酒酒质的重要问题，杂醇油形成量及其各高级醇所占百分比例，可能与酵母菌株种类、发酵温度等因素有关，有待进一步从发酵工艺上研究改进。
表6 苦荞小曲酒挥发性风味成分测定结果
Table 6 Determination results of volatile flavor components of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu
3 结论
本试验以苦荞为原料，以小曲为糖化发酵剂，采用半固态发酵法酿造苦荞小曲酒，最优糖化工艺为：小曲添加量0.6%，糖化时间为25 h，糖化温度为30 ℃。在此条件下半固态发酵法酿造苦荞小曲酒酒精度为51.3%vol、平均出酒率为57.25%、总酸含量为0.536 g/L、总酯含量为1.95 g/L，感官评分83分。苦荞小曲酒挥发性成分共检出31种，其中醇类9种，酸类3种，其他类5种。本研究仅仅对糖化工艺进行了优化，后续还可以对发酵工艺进行优化及风味物质生成规律等进行研究，为半固态法苦荞小曲酒的生产和研发提供理论依据和技术参考。
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