1933年，日本首次报道丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum），由宫入近治博士发现，因此命名为宫入菌[1]。该菌是一种严格厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，培养后期可以变为阴性菌，属于梭菌属，对不良环境有很强的抵抗力。作为一种新型微生态制剂，丁酸梭菌能够产生有机酸、淀粉酶等物质，改善肠道环境、增强机体免疫，在2013年将其纳入《中国饲料添加剂品种目录（2013）》的《附录二》[2-4]。有研究表明，丁酸梭菌在生产中能够耐受高温环境，经过80 ℃、30 min和90℃、10min热处理后不会失去活性，最适生长温度为36℃[5]。另外，丁酸梭菌储存性能比较稳定，对胃酸、消化酶和胆汁具有足够的抵抗能力，耐受多种抗生素。同时，又能在厌氧环境下产生乳酸、丁酸，兼具了芽孢杆菌与乳酸菌的优点[6-7]，不仅可以促进动物生长，还可以有效降低抗生素产品的使用，减少药物残留[8-9]，对降低动物细菌的耐药性和保障动物健康方面有着重要的意义。然而，目前市场上丁酸梭菌产品众多，产品性能也大有不同，且研究重点主要集中于丁酸梭菌的筛选以及对动物疾病的治疗方面，而对不同丁酸梭菌之间的评价研究较少。本研究对7株丁酸梭菌从贮存稳定性、热耐受性、人工胃液耐受性、抗生素抗性以及产丁酸酸能力方面进行比较研究，以期为有关丁酸梭菌的生产及使用提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验样品
7种丁酸梭菌（编号D1～D7）：市售。
1.1.2 培养基及人工胃液
胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
碳酸钙培养基：葡萄糖3%、蛋白胨2%、牛肉膏1.5%、碳酸钙2%、调至pH 7.0±0.2，121 ℃高压灭菌30 min，备用，固体培养基添加琼脂1.5%。
人工胃液：9.5%～10.5%盐酸16.4 mL，加去离子水稀释，使pH达到2.0，装入250 mL盐水瓶中，121 ℃灭菌15 min，冷却至50 ℃以下，每100 mL液体中加入1 g胃蛋白酶，混匀后，待用。
1.2 仪器与设备
SIL-20A高效液相色谱仪：日本岛津公司；YXQG-04 B型手提式压力蒸汽灭菌器：山东新华医疗器械股份有限公司；MS105DU电子分析天平：天津宏中电子衡器科技有限公司；SW-CJ-2F双人双面（垂直）净化工作台：江苏通净净化设备有限公司；DHP-9082电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；GZX-9140MBE电热鼓风恒温干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；THZ-C恒温振荡器：苏州市培英实验设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 丁酸梭菌的分离纯化以及发酵液的制备
分别称取0.5 g丁酸梭菌菌粉，置于250 mL碳酸钙液体培养基中，37 ℃静置厌氧培养24 h后，用接种环蘸取菌液在碳酸钙琼脂培养基上划线，37 ℃厌氧培养24 h，挑取典型的单菌落接种于250 mL无菌碳酸钙液体培养基中，37 ℃静置培养24 h，备用。
1.3.2 贮存稳定性
将丁酸梭菌分别于室温和-20 ℃条件下进行保存，共保存240 d，并每隔30 d进行活菌计数，与菌粉最初活菌计数结果进行比较，计算存活率。
1.3.3 耐热特性
分别称取1.5 g丁酸梭菌菌粉置于称量纸上，摊开薄薄的一层，于恒温干燥箱中分别在70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃、120 ℃条件下处理10 min，取出后，准确称取1.000 0 g菌粉到含有99 mL灭菌生理盐水的三角瓶中，进行活菌计数，计算存活率。
1.3.4 人工胃液耐受性
称取不同质量的丁酸梭菌菌粉分别置于100 mL pH 2.0的人工胃液中，使其初始活菌数均为1.0×107 CFU/mL，混匀后37 ℃静置，并分别于0、0.5 h、1.0 h和2.0 h进行活菌计数。
1.3.5 抗菌药敏感性
本试验采用药敏纸片扩散法[10-11]，分别称取丁酸菌粉1.000 0 g加入到含有99 mL无菌生理盐水的三角瓶中，37 ℃振荡30 min，梯度稀释至108 CFU/mL，取100 μL涂布于胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基表面，用镊子将不同抗生素试纸贴在上述平板上，于37 ℃厌氧培养12 h，通过测量抑菌圈直径判断各个菌株对于不同抗菌药的敏感性。
1.3.6 丁酸含量测定
接种丁酸梭菌于250 mL无菌碳酸钙液体培养基中，37 ℃静置培养24 h、48 h，按照参考文献[12]的方法测定丁酸含量。
1.3.7 数据统计与分析
通过Excel 2020对数据进行统计，并计算活菌数的存活率。利用SPSS 19.0软件进行方差分析，当存在显著差异时，用Duncan氏多重比较法检测组间差异性，0.01＜P＜0.05，表示差异显著；P＜0.01，表示差异极显著。结果用平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 各菌粉贮存稳定性比较
室温条件贮存结果见表1，-20 ℃条件贮存结果见表2。
表1 室温贮存条件下各菌粉存活率
Table 1 Survival rate of each bacterial powder under room temperature storage
表2 -20 ℃贮存条件下各菌粉存活率
Table 2 Survival rate of each bacterial powder under -20 ℃storage
由表1可知，在室温条件下贮存，7种菌粉存活率随贮存时间延长而降低，其中菌株D2存活率最好，在贮存240 d时仍可达到50%；由表2可知，在-20 ℃条件下贮存，7种菌粉存活率随贮存时间延长而降低，且与室温条件相比，-20 ℃条件下存活率整体下降趋势较平缓，存活率更高。其中菌株D2存活率最好，在贮存240 d时仍可达到59.00%。综合来看，菌株D2在两种条件下长期存放时，稳定性较其他菌粉更好。
2.2 各菌粉热耐受性比较
饲料加工过程中，往往要经过高温处理的过程，而微生态制剂能否在这个过程中存活下来更是直接关系到其应用范围，因此耐热性考察是非常重要的[13]。研究将菌粉分别置于不同高温环境中进行处理，比较7种菌粉的耐热特性，存活率结果见表3。
表3 7种菌粉在不同温度处理后存活率
Table 3 Survival rate of 7 bacterial powders treated at different temperature
由表3可知，随着处理温度升高，7种菌粉存活率均呈下降趋势。70～100 ℃热处理10 min后，菌株D2存活率均保持在100%；110 ℃、120 ℃热处理10 min后，菌株D2存活率分别为48.49%和37.00%。因此说明菌株D2在耐热方面较其他菌粉性质更好，更适合加工过程中的高温环境。
2.3 各菌粉人工胃液耐受性比较
丁酸梭菌想要在肠道内定植和发挥作用，就必须耐受过胃液环境，动物胃液的pH值一般在2.5～3.0[14]，而食物在胃中的停留时间为1～2 h[15]，因此，胃液耐受性研究是丁酸梭菌应用潜力的重要考察指标。试验将各菌粉在模拟胃液中保持2 h，比较菌粉间人工胃液耐受性差异，耐受性结果见图1。
图1 7种丁酸梭菌在人工胃液中处理2 h的存活率
Fig.1 Survival rate of 7 strains of Clostridium butyricum treated by artificial gastric juice for 2 h
由图1可知，7种菌粉对pH 2.0的人工胃液耐受性有一定差别，经处理2 h后，除菌株D3外，其余菌粉存活率均高于80%，说明人工胃液耐受性都较好，其中样品D2存活率高于其他菌粉，耐受性最好[16]。
2.4 各菌粉抗生素抗性比较
在动物生产中，饲料中常常会添加一定量的抗生素来达到抗病和促进动物生长的作用，这在一定程度上影响了益生菌的使用效果[16]。因此，益生菌制剂对各种常用药物的配伍禁忌和敏感性成为了添加剂选择的重点，同时，抗生素等抗菌药物的残留问题也越来越受人们的重视[17]。本试验通过菌粉对青霉素类、四环素类、喹诺酮类，大环内酯类及头孢类抗生素的敏感性进行比较，7种丁酸梭菌菌粉对18种常见抗菌药敏感性结果见表4。
表4 7种丁酸梭菌对抗菌药敏感性比较
Table 4 Comparison of the sensitivity of 7 strains of Clostridium butyricum to antibacterial drugs
注：“S+++”表示极度敏感，抑菌圈直径＞20 mm；“S++”表示高度敏感，抑菌圈直径为15～20 mm；“S+”表示中度敏感，抑菌圈直径为10～14 mm；“S”表示低度敏感，抑菌圈直径＜10 mm；“R”表示不敏感，无抑菌圈。
由表4可知，7种菌粉对大多数抗菌药表现出敏感性，但对链霉素、甲氧嘧啶均表现出抗性，个别菌株表现出对卡那霉素、庆大霉素、多粘菌素B和磺胺异噁唑也具有抗性。由此表明，丁酸梭菌对大多数氨基糖苷类抗生素具有抗性，可与部分抗生素联合使用。
2.5 菌株发酵菌液中丁酸含量比较
丁酸梭菌在动物肠道中可产生多种氨基酸、B族维生素、丁酸等营养物质，为动物提供良好的营养来源，对机体具有保健作用，而丁酸梭菌的代谢产物有丁酸、乙酸、乳酸、丁醇等[18]。其中，代谢产物丁酸是丁酸梭菌许多益生作用的根本原因，它是一种短链脂肪酸，对动物肠道发挥着重要的作用[19]，保持一定水平的丁酸能够使结肠细胞保持稳定，为肠道上皮组织细胞的再生和修复提供营养物质，对肠道上皮组织的再生和修复有着重大意义[20-21]。因此，为维持动物肠道健康，提高饲料利用率，研究丁酸梭菌的代谢产物及能力是非常必要的。本研究中，采用高效液相色谱法对7株丁酸梭菌进行代谢产物分析，丁酸含量结果见表5。
表5 7种丁酸梭菌发酵液不同时间产丁酸含量
Table 5 Contents of butyric acid produced by 7 strains of Clostridium butyricum fermentation broth at different time
注：不同小写字母表示结果差异显著（P＜0.05）。
由表5可知，7株丁酸梭菌产丁酸能力上存在较大差异，菌株D2在碳酸钙培养基中发酵24 h和48 h之后丁酸含量最高，为8.31 g/L和8.26 g/L。
3 结论
本试验通过对7株丁酸梭菌的温度、人工胃液和抗生素耐受性、贮存稳定性及丁酸产量的比较得出：对人工胃液和链霉素、甲氧嘧啶7种产品均具有很好的抗性；7种菌株的贮存稳定性存在较大差异，室温或-20 ℃存放240 d，菌株D2存活率较其他菌粉更高，为50.00%和59.00%；菌株D2耐热性更好，120℃处理10min后存活率明显高于其他菌株，为37.00%；7株丁酸梭菌的产丁酸能力对比差异显著（P＜0.05），菌株D2在发酵24 h、48 h后丁酸含量为8.31 g/L和8.26 g/L。说明菌株D2具有更优良的益生特性，可进一步研究。
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