南瓜是一种葫芦科蔓性植物，其营养丰富，含有人体所需的氨基酸、多糖、类胡萝卜素、矿质元素等营养物质，具有辅助降血脂、辅助降血糖、抗肿瘤、抗氧化等多种药用价值[1-5]。根据联合国粮食及农业组织统计数据库，2014年我国南瓜总产量超过3 000万t，生产面积110万hm2，南瓜资源十分丰富[6]。益生菌广泛存在于自然界中，是一类可以利用碳水化合物发酵产生大量乳酸的细菌总称[7]。益生菌具有调节胃肠道菌群平衡，改善人体消化吸收系统，降低胆固醇等生物保健功能[8-11]。现今，发酵果蔬汁饮料发展迅猛[12-13]，已有多款同类产品上市，并且深得广大消费者青睐，如豆乐奇。由于各种微生物胞内的酶系统是不同的，代谢途径和产物也不同，对环境的生存适应能力也各不同，存在明显的生理特性差异，而这些最终将影响到食品的风味和口感[14]。开发功能性益生菌发酵饮品，可以提高南瓜的精深加工附加值，丰富南瓜的产品形式。因此，从众多微生物中筛选出比较适用于南瓜发酵的菌种就显得特别有意义。本实验以南瓜为原料进行发酵，结合活菌数、产酸速率、风味和口感等方面对产品进行评价，筛选出适用于南瓜浆发酵的菌株，为开发营养价值较好的发酵南瓜产品提供一定技术借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蜜本南瓜：市售；瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus，LH），肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides，LM），嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，LA），鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnose，LR）：来自本实验室；MRS固体培养基：广州环凯生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
SZX超净工作台：苏州净化设备有限公司；WH-2微型涡流混合仪：上海泸西分析仪器厂；pHS-25型酸度计：上海精密科学仪器有限公司；JY2002型电子天平：上海舜宇恒平科学仪表公司；Genex移液器：宝予德（中国）有限公司；YX-280高压灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司；PYX-DHS隔水式保温箱：上海博泰实验设备有限公司；JMS-500胶体磨：廊坊市廊通机械有限公司。
1.3 方法
1.3.1 理化指标测定
pH值：采用pHS-25型pH计进行测定；可滴定酸度：参考GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》；活菌数：参考GB 4789.35—2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》，采用平板计数法测定；还原糖：参考GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》，采用直接滴定法，每个样品平行测定3次。
1.3.2 感官评价
参考文献[15]，并作适当修改，选择评分人员10人对发酵南瓜浆进行打分，满分5分，结果取平均值，感官评分标准见表1。
表1 发酵南瓜浆感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of fermented pumpkin pulp
1.3.3 南瓜浆发酵工艺流程及操作要点
南瓜→清洗→去皮、去囊→切片→打浆→灭菌→冷却→接种→发酵→成品
南瓜浆的制备：选择成熟度高的新鲜南瓜，用清水冲洗后，先将南瓜去皮去囊，然后切成条状，之后再切成片状；按照南瓜∶水=1∶1（g∶mL）的料液比进行打浆，过胶体磨至果肉无明显颗粒。取100 mL分装于250 mL经灭菌处理的洁净锥形瓶中，硅胶塞密封，制备32瓶。
南瓜浆加热杀菌：在90～95 ℃、10～15 min的条件下进行灭菌处理，以杀灭南瓜浆中有害微生物。
接种、发酵：将灭菌后的南瓜浆冷却至37 ℃左右，于无菌操作台分别接种LA、LM、LH、LR各8瓶，初始活菌数控制为106 CFU/mL，在37 ℃恒温条件下发酵48 h。
2 结果与分析
2.1 各菌种在南瓜浆发酵过程中活菌数的变化
根据文献资料[16-17]和实验室条件，选择LA、LM、LH和LR这4种单菌菌株在相同的条件下发酵南瓜，并进行对比分析。从接种开始计为0 h，发酵过程中间隔取样，分别测定活菌数变化，结果如图1 所示。由图1可以看出，LH发酵较快，调整期非常短，迅速就进入了对数期，菌体数目呈几何级增长，在整个对数期内，LH的活菌数对数值由最初的6.1增长至8.4，至发酵12 h后，开始进入稳定期。与LH不同，LR、LA和LM在发酵的前4 h内处于调整期，菌体数变化不大。有研究表明，调整期的长短与菌种、菌龄、培养条件等密切相关[18]。LM、LA在4～12 h处于菌体细胞数目高速增长的对数期，而后进入稳定期。从整个变化曲线来看，LR的发酵特性较其他3种表现得更有优良，在经过4 h的调整期后，菌体开始迅速增长，至发酵结束，菌体数最多，菌体数对数值增长至9.0，是初始活菌的1 000倍左右。
图1 南瓜浆发酵过程中活菌数的变化
Fig.1 Change of viable count during pumpkin pulp fermentation
2.2 各菌种对南瓜浆发酵过程中pH值的影响
发酵过程中pH值的变化如图2所示。由图2可以看出，这4种菌的pH值变化趋势基本相同，随着发酵时间的延长，pH逐渐下降，最后则趋于平缓，这一变化与发酵过程中活菌数的变化是相互对应的，也与丘裕等[19]的研究结果相类似，可把这一过程大致分为发酵初期、发酵旺盛期和发酵末期。在发酵初期，pH值变化缓慢，发酵速度相对较慢；发酵进入旺盛期，pH值下降很快，发酵达到高峰；至发酵末期，pH值变化又趋缓。在发酵开始的前4 h内，LA、LM、LR由于处于调整期，增长缓慢，所以生成乳酸的量较少，pH值变化不明显。在发酵4 h之后，LA、LM、LR进入对数期，菌体细胞数呈几何增加，微生物开始大量消耗南瓜浆中的营养物质，利用碳水化合物发酵生成大量乳酸，使得内部环境pH值快速下降。24 h后，菌体处于稳定期，可发酵糖含量已经大量减少，微生物增殖率和死亡率趋于平衡，活菌数基本保持不变，pH值的下降趋势开始变得缓慢。LH由于处于调整期的时间短，迅速地就进入了对数期，所以，在发酵的前4 h，pH值下降速度要比其他3种益生菌快，至发酵12 h后，菌体数基本维持不变，pH值下降趋势开始变得缓慢。
图2 南瓜浆发酵过程中pH值的变化
Fig.2 Change of pH value during pumpkin pulp fermentation
2.3 各菌种对南瓜浆发酵过程中酸度的影响
图3 南瓜浆发酵过程中酸度的变化
Fig.3 Change of acidity during pumpkin pulp fermentation
发酵过程中酸度的变化如图3所示。从图3可知，一方面，随着发酵时间的延长，南瓜浆的酸度不断增大，产酸量不断增多，这一变化与pH值的不断下降是相互对应的。另一方面，不同菌种的产酸量和产酸速率并不一相同，这说明各菌种的产酸能力存在差异性，而这本身与菌种理化特性不同是有关系的。发酵前12 h内，LH产酸速度快于其他菌株，产酸量增加了近10倍（由0.037 g/100 g增加至0.33 g/100 g），发酵至32 h后，产酸量趋于稳定，这与后期pH值的变化是一致的。在发酵刚开始的前4 h内，LR、LM、LA的产酸量基本保持不变，这与它们处于调整期相吻合。发酵至8 h后，LA、LR和LM产酸速度快于LH，其中又以LA的产酸速度最快，到发酵48 h时，产酸量达到由最初的0.032 g/100 g增加至1.24 g/100 g，是最初的40倍。LH在整个发酵过程中产酸趋势与LM类似，发酵至32 h后，产酸量也趋于稳定，分别增长了25倍和19倍。而LR在整个发酵过程中产酸趋势与LA相似，到发酵结束时，产酸量增长了32倍。从整个产酸量来看，LA和LR的产酸量要高于LM和LH。
2.4 各菌种对南瓜浆发酵过程中还原糖含量的影响
糖代谢对益生菌具有重要的生理学价值，益生菌最常用的糖类就是葡萄糖和果糖[20]，多糖和葡萄糖是南瓜的主要糖类物质，而在发酵过程中大部分活性多糖能被保留下来，葡萄糖则被微生物消耗利用[21]。因此，研究发酵过程中其还原糖的变化情况显得很有必要。发酵过程中还原糖的变化结果如图4所示。从图4可以看到，在整个发酵过程中，还原糖含量随着发酵的进行是逐渐降低的，这是由于益生菌代谢消耗南瓜浆中某些糖类物质，转化成乳酸等产物所导致的结果。发酵前期，由于微生物快速增长繁殖，菌株消耗还原糖的速率加快，到了发酵后期，由于微生物数量保持不变，还原糖消耗量减少变慢。发酵前12 h内，LR还原糖的消耗量快于其他菌株，还原糖的含量下降了37.21%（由3.01 g/100 g下降至1.89 g/100 g）。发酵至24 h后，LA、LM、LR、LH还原糖含量下降趋势开始变缓，这与菌体处于稳定期是有关系的。至发酵48 h，还原糖含量分别下降了56.48%、52.82%、48.17%、44.85%。
图4 南瓜浆发酵过程中还原糖的变化
Fig.4 Change of reducing sugar during pumpkin pulp fermentation
2.5 不同菌种发酵南瓜浆的感官评定
图5 不同菌种发酵南瓜浆感官评定结果
Fig.5 Sensory evaluation results of fermented pumpkin pulp by different strains
发酵南瓜浆的感官评分结果如图5所示。从颜色和光泽方面看，LH和LR评分高于LA和LM。从组织状态方面看，4种菌株发酵的南瓜浆数据相差较小，无显著性差异。从气味方面看，LR的评分是最高的，达4.8分，其次是LH和LA，分别是4.6分和3.9分，LM的评分是最低的，只有3.6分。原因是评定员认为它没有了南瓜清香味，反而带来一股异味，令人不悦。从滋味上看，最好的是LH，其次是LR，LA和LM的评分较低。所以，从总体上来看，LH、LR较LA和LM更适合发酵南瓜。
3 结论
发酵过程中，瑞士乳杆菌调整期并不明显，接种后便迅速进入对数期，发酵速度要快于其他菌株。而鼠李糖乳杆菌在发酵过程中，其活菌数对数值最高，达9.0 lg（CFU/mL）。
发酵初期，pH值变化不是特别大；进入旺盛期，pH值下降明显；发酵末期，pH值变化趋缓。另外，在产酸量和产酸速率上不同菌株存在差异性，发酵前期，瑞士乳杆菌产酸速率和产酸量较快。至发酵结束，嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌整体产酸量要多于瑞士乳杆菌和肠膜明串珠菌。在整个发酵过程中，菌株利用还原糖的能力存在个体差异，嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌优于瑞士乳杆菌和肠膜明串珠菌。此外，活菌数、pH、还原糖含量和酸度之间的变化存在一定内在联系。
四种发酵火南瓜浆的感官评价表明，瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌总体评分高于其他两种，更适合发酵南瓜浆。所以从产酸、活菌数、感官等方面综合考虑，最终确定发酵菌种为瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌。
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