疲劳是指机体在生理过程中，不能维持其机能的特定水平或器官原有的运动强度时呈现的生理现象。长期处于疲劳状态造成的机体免疫功能紊乱和器官损伤，会严重威胁人类健康[1-2]。长久以来，国际上在缓解疲劳治疗中的主流对策为药物治疗，一方面药物治疗起效迅速，效果显著；但另一方面常规药物治疗所带来的副作用、成瘾性和依赖性，极大地限制了其临床应用范围[3-4]。中医药长期临床研究表明，许多传统中药对缓解和治疗疲劳有积极作用，并表现出低毒副作用等优势，受到国内外学者的广泛重视[5]。
金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）为兰科石斛属多年生附生草本植物，味甘、淡，性属微寒，是历版《中国药典》所记载的名贵中药材，被国际药用植物界称为“药界大熊猫”，现代药理学研究表明，金钗石斛中含有的主要活性成分包括倍半萜类、黄酮类、多糖类以及相关衍生物[6]。因其具备的较高药用价值，金钗石斛已被广泛地开发成种类繁多的药品和保健食品，产品功效主要包括抗氧化、增强免疫力、缓解体力疲劳、清咽润喉等[7-9]。然而，单味中药作用较为单一，中医药常以整体论治，通常认为复方中药相比起单味药材可以从多靶点多角度缓解疲劳。根据中医理论，研究将补虚扶正和祛疲安神作为出发点[10]，以金钗石斛配伍人参、黄芪、五味子、茯苓四味中药组成复方，五药配合，意在益气生津，补阴助阳。同时，研究以白酒作为复方溶媒，能够极大程度地将药材中的多酚类、倍半萜类等醇溶性成分溶出，增强药理活性[11-12]，最终成品可兼具口感好、功效强、稳定性好等优点。
根据卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知（卫法监发[2002]51号）附件1及附件2中名单中的原料及其他保健食品可用原料，组方中人参、黄芪、茯苓为药食同源中药，石斛和五味子为可用于保健食品的中药。基于中医药理论以及现代药理研究，本研究依据《保健食品功能学评价程序和检验方法》对复方金钗石斛保健酒进行缓解体力疲劳功效验证，为开发天然、无毒副作用的缓解体力疲劳类保健食品提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
无特定病原体（specific pathogen free，SPF）昆明种雄性小白鼠：体质量18～22 g，雄性，由西南医科大学实验动物中心提供。生产许可证号：SCXK（川）2013-17，使用许可证号：SCXK（川）2013-065。实验动物饲养于西南医科大学实验动物中心，室温22～24 ℃，湿度65%～80%。给药期间，动物分笼以全价颗粒饲养，自由饮水。
尿素氮试剂盒、全血乳酸检测试剂盒：上海酶联生物科技有限公司；肝糖原测定试剂盒：南京建成生物工程检验所；金钗石斛药材（经西南医科大学生药教研室税丕先教授鉴定为兰科石斛属植物金钗石斛）：采自泸州合江金钗石斛种植基地；人参饮片、五味子饮片、黄芪饮片、茯苓饮片：泸州百草堂中药饮片有限公司；浓香型白酒（52%vol）：由泸州老窖提供。
1.2 仪器与设备
UV-I800PC 紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；Multiskan FC型酶标仪：赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；FA2204B电子天平：上海精科天美科学仪器有限公司；HHS.21-4恒温水浴锅：常州诺基仪器有限公司；BPX-272恒温培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3 方法
1.3.1 复方金钗石斛保健酒的生产工艺流程及操作要点
人参、金钗石斛、黄芪、五味子、茯苓→打粉→浸润→渗漉→收集→提取液检验→计量称质量→配液→初滤→精滤→灌装→封口→灯检→包装→检验
操作要点：
药材前处理：将药材粉碎至65～80目的药粉，按人参∶金钗石斛∶黄芪∶五味子∶茯苓（9∶6∶6∶2∶2）的比例混合。
浸润：按照药材粉∶白酒=1∶9（g∶mL）的比例加入酒精度为52%vol的浓香型白酒，在室温（25～28 ℃）条件下浸润18h。
渗漉：以5 mL/（min·kg）的流速渗漉至料液比为1∶12（g∶mL）。
配液：以浓香型白酒为基础将提取液调配成酒精度为38%vol。
厂家推荐成人（体质量以60 kg计），每日摄入量为100 mL/60 kg。根据前期研究测定[13]，金钗石斛复方保健酒的功效成分及含量为石斛碱183.37 mg/L、总黄酮219.74 mg/L。
1.3.2 剂量设计
参照《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）保健酒缓解体力疲劳实验。将小鼠随机分为5组，每组10只，分别为样品低剂量组（LD）、中剂量组（MD）、高剂量组（HD），溶媒基酒组（BC），空白对照组（NC）。灌胃给药0.2 mL/10 g，每天1次，连续30 d，实验期间小鼠自由饮水、摄食，称量体质量。各组给药如下：实验组低、中、高剂量组小鼠灌胃给予剂量相当于人体给药量的5倍、10倍、20倍，即8.4 mL/kg、16.7 mL/kg、33.4 mL/kg；溶媒对照组小鼠灌胃给予：等体积15%vol浓香型白酒；空白对照组小鼠灌胃给予：等体积生理盐水。
1.3.3 小鼠体质量增长测定
小鼠连续灌胃30 d，每日1次。分别在小鼠灌胃0 d、15 d、30 d时称量小鼠体质量。
1.3.4 小鼠负重游泳实验
小鼠连续灌胃30 d，末次给试样24 h后将小鼠负体质量5%的铅皮，放入水深30 cm，水温（25±0.5）℃的游泳箱内，记录小鼠自放入游泳开始至死亡的时间（以小鼠头部沉水后8 s无法上浮，放于平面无法完成翻正反射作为力竭判断标准）。
1.3.5 小鼠血乳酸（blood lactic acid，BLA）实验
连续灌胃30 d，末次灌胃给予受试酒24 h后尾静脉采血50 μL，采血后在温度为30 ℃的水中游泳10 min后停止，立即采血50 μL，休息20 min后眼球再采血50 μL。静置3 h后分离得血清，按照试剂盒方法测血乳酸含量。并根据下式计算出血乳酸曲线下面积：
式中：S表示血乳酸曲线下面积；H0表示游泳前血乳酸值，mmol/L；H1表示游泳后0 min血乳酸值，mmol/L；H2表示游泳后休息20 min血乳酸值，mmol/L。
1.3.6 小鼠血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）实验
连续灌胃30 d，末次给受试物24 h后分别将各组小鼠无负重分别放入水温30 ℃水中游泳90 min，休息60 min后采眼球血0.5 mL，放置3 h后分离血清，用酶法试剂盒测定尿素氮。
1.3.7 小鼠肝糖原实验
精确称取肝脏100 mg，生理盐水洗净滤纸吸干多余水分，按照试剂盒方法将样本与碱液按1∶3加入试管，沸水浴20 min，流水冷却，将肝糖原水解液配制成1%检测液，配制空白与标准，混匀，沸水浴5 min，冷却，于波长620 nm处比色，按照肝糖原测定试剂盒操作说明书计算肝糖原含量。
1.3.8 小鼠肝肾组织病理学检查
连续灌胃30 d，末次给受试物24 h后取出肝和肾，放于10%甲醛溶液中。经HE染色制作病理切片。
1.3.9 数据处理
采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，所有数据均以表示。利用T检验，首先检验方差齐性，再对组间分析，P≤0.05则差异有统计学意义，P≤0.01差异有显著统计学意义。
2 结果与分析
2.1 复方金钗石斛保健酒对小鼠体质量的影响
灌胃30 d期间，小鼠无异常反应，皮毛光亮，精神状态较好。由表1可知，各组小鼠初始体质量均衡（P＞0.05），中期和末期各组小鼠的体质量差异均无统计学意义（P＞0.05），说明样品对小鼠的生长无不良影响。
表1 复方金钗石斛保健酒对小鼠体质量的影响
Table 1 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on mice body mass
2.2 复方金钗石斛保健酒对小鼠负重游泳的影响
由表2可知，基酒组与空白组对比差异无统计学意义（P＞0.05）；中剂量组小鼠游泳时间显著长于空白组和基酒组（P＜0.05）。
表2 复方金钗石斛保健酒对小鼠负重游泳的影响
Table 2 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on the loaded-swimming of mice
注：与空白组比较“**”表示影响极显著（P＜0.01），“*”表示影响显著（P＜0.05）；与基酒组比较“△△”表示影响极显著（P＜0.01），“△”表示影响显著（P＜0.05）。下同。
2.3 复方金钗石斛保健酒对小鼠血乳酸含量的影响
由表3可知，游泳前5组小鼠血乳酸含量差异不显著（P＞0.05）；游泳10 min后中剂量组小鼠的血乳酸含量显著低于空白组、基酒组（P＜0.05），高剂量组小鼠的血乳酸含量极显著低于空白组、基酒组（P＜0.01）；游泳结束后20 min，5组小鼠血乳酸含量差异不显著（P＞0.05）。经计算，中剂量组、高剂量组小鼠的血乳酸曲线下面积极显著低于空白组、基酒组（P＜0.01）。复方金钗石斛保健酒可以通过降低小鼠运动后血乳酸堆积缓解体力疲劳。
表3 复方金钗石斛保健酒对小鼠血乳酸的影响
Table 3 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on the blood lactic acid of mice
2.4 复方金钗石斛保健酒对小鼠血清尿素氮的影响
运动过程中机体蛋白质和氨基酸分解，含氮物质在体内堆积，小鼠BUN含量升高。由表4可知，基酒组小鼠的血清尿素氮含量显著低于空白组（P＜0.05），低剂量组、中剂量组以及高剂量组小鼠的血清尿素氮含量均极显著低于基酒组（P＜0.01）。说明酒精会减慢尿素氮在血液中的代谢分解速率，而复方金钗石斛保健酒可以加快尿素氮的代谢从而降低小鼠运动后体内的尿素氮含量。
表4 复方金钗石斛保健酒对小鼠血清尿素氮的影响
Table 4 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on the blood urea nitrogen of mice
2.5 复方金钗石斛保健酒对小鼠肝糖原的影响
肝糖原为机体可以利用的糖储存，糖原储存水平直接影响运动耐力水平。由表5可知，五组小鼠肝糖原含量差异不显著（P＞0.05），说明复方金钗石斛保健酒不能通过增加小鼠肝糖原的储存达到缓解体力疲劳的效果。
表5 复方金钗石斛保健酒对小鼠肝糖原的影响
Table 5 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on the hepatic glycogen of mice
2.6 复方金钗石斛保健酒对小鼠肝、肾组织的影响
由图1A～图1E可知，小鼠肝小叶结构正常，肝索排列整齐，呈放射状。空白组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的肝细胞大小一致，核呈圆形，核仁清晰，可见肝细胞浆粉染，无肿胀和空泡，汇管区无炎细胞浸润，细胞核明显，细胞之间边界清晰。而溶媒组出现轻微细胞空泡现象。由图1F～图1J可知，肾皮质髓质分界清晰，肾被膜未增厚，肾小球结构正常，未见增生萎缩或纤维化，肾小管上皮细胞呈立方形，细胞排列紧密，管腔未见异常管。其中基酒组肾脏切片，均有不同程度的中性粒细胞炎性浸润。以上结果表明酒精对肾组织有损伤作用，而复方金钗石斛保健酒对肝、肾无损伤作用。
图1 复方金钗石斛保健酒对小鼠肝、肾组织的影响
Fig.1 Effect of compound Dendrobium nobile health wine on pathological section of liver and kidney tissue in different dose groups
A～E分别为：肝组织切片空白、基酒、低、中、高剂量组放大200倍；F～J分别为：肾组织切片空白、基酒、低、中、高剂量组放大200倍。
2.7 讨论
复方金钗石斛保健酒运用传统中医药理论配伍组方，兼顾了滋阴和补气两大抗疲劳治法。组方中金钗石斛一直以来是中医药用于治疗“虚损羸弱”的常用药材，因其明确独特的功效，近年来被广泛研究，但药理活性主要集中在抗肿瘤和降血糖等方面[14]，关于金钗石斛缓解体力疲劳的研究报道较少，梁钧淞等[15]提取金钗石斛中的碱溶性多糖，发现提取物能够通过提高血糖和甘油三酯含量、增加脂肪利用并延缓乳酸和氨积累等功效机理达到缓解体力疲劳的效果。组方其他四味药材在不同程度上均有一定的缓解体力疲劳活性[16-19]。复方金钗石斛保健酒作为复合醇提物，缓解体力疲劳的药理活性非五种药材的机理相叠加，多种成分互相作用改变了各自原有的缓解体力疲劳作用途径，甚至可能会产生毒副作用[20]。因此本研究对小鼠进行了负重游泳实验以及血乳酸、血清尿素氮、肝糖原三个相关生化指标的检测，以达到阐明复方金钗石斛保健酒对小鼠缓解体力疲劳机理的目的；同时对肝、肾组织进行病理学检查，观察复方金钗石斛保健酒对肝、肾这两个主要代谢组织是否有毒副作用。
长时间重复的体力劳动会导致疲劳，引起一系列内分泌系统改变，运动耐力的下降是疲劳最主观的表现形式和最客观的指标[21]，因此负重游泳实验是评价小鼠缓解体力疲劳能力最好的模型。在本次研究中，中剂量的复方金钗石斛保健酒能延长小鼠游泳时间（P＜0.05）。为了更进一步研究复方金钗石斛保健酒对小鼠的抗疲劳机理，测定了几种疲劳生化指标说明作用途径。剧烈运动时机体相对缺氧，糖酵解加快，产生大量乳酸，使肌肉中H+浓度上升pH值下降，乳酸大量堆积后，会降低肌肉反应度，使肌肉负荷和运动能力大大降低，产生疲劳感[22-23]。因此，加快乳酸分解或减少其产生都能缓解疲劳，BLA水平能反应疲劳程度。较长时间运动后，机体蛋白质与氨基酸分解代谢加强，血尿素氮明显增加，身体对负荷的适应性减弱，产生的尿素氮增加，BUN含量能反应机体负荷能力[24]。糖是肌肉活动时能量的主要来源，长时间的运动，体力和糖原的耗竭会同时发生[25]，糖原的含量高低能说明疲劳的深浅程度。实验发现，中、高剂量的复方金钗石斛保健酒能够减少运动后堆积在小鼠体内的BLA（P＜0.01）；低、中、高剂量的复方金钗石斛保健酒能减少小鼠血清中的BUN堆积（P＜0.01）；肝糖原水平未发生变化。这说明在负重游泳实验中，耐力的增强和减少BLA、BUN的堆积这两种机理有关，而非通过提高糖原储存来达到缓解体力疲劳效果。
数据表明，小鼠运动后基酒组BUN含量高于空白对照组（P＜0.05），这说明酒精的损伤作用，导致机体不能及时清除BUN，使身体负荷能力变差。为了进一步探究酒精作用机理，对小鼠的肝和肾进行HE染色切片观察。结果显示空白组和三个剂量组小鼠肝、肾组织未发生病变。基酒组的肝细胞的轻微空泡可能为脂肪肝，机体长期摄入乙醇，乙醇脱氢酶使乙醇脱氢氧化，此过程影响三羧酸循环从而导致脂肪代谢减弱，脂肪堆积于肝中形成脂肪肝，在病理切片中体现为细胞空泡。肾组织有炎性浸润，基酒中的醇类属于水溶性外源物质，进入体内后除部分被胃吸收，容易在肾脏细胞和间质内沉积，对肾造成肿胀、损伤、炎症反应等不同程度的损害，造成机体氧化应激产生炎症反应[26]。复方金钗石斛中的成分与基酒中不易被吸收的物质缔合，削弱了纯基酒对肝、肾的损伤，与纯基酒对比复方金钗石斛保健酒对肝肾的毒副作用不明显。
3 结论
通过动物实验对小鼠缓解体力疲劳活性进行考察，结果表明复方金钗石斛保健酒对体重不产生明显影响。中剂量（16.7 mL/kg）复方金钗石斛保健酒能显著增加小鼠游泳时间（P＜0.05），给予中（16.7 mL/kg）、高剂量（33.4 mL/kg）复方金钗石斛保健酒能极显著降低运动后小鼠BLA水平（P＜0.01）。低（8.4mL/kg）、中（16.7mL/kg）、高剂量（33.4mL/kg）可极显著降低运动后小鼠BUN含量（P＜0.01），但复方金钗石斛保健酒不能通过改变小鼠肝糖原缓解体力疲劳（P＞0.05）。各剂量组肝和肾细胞完整清晰，均未受损伤。根据《保健食品检验与评价技术规范》，负重游泳结果为阳性，且血乳酸、血清尿素和肝糖原三项生化指标中任意两项为阳性，可判定复方金钗石斛保健酒具有缓解小鼠体力疲劳的功效，研究结果为开发安全有效的缓解体力疲劳保健食品提供了参考。
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