近年来，我国草食畜牧业发展呈现良好势头，但是生产总量和生产方式仍然明显滞后于畜牧业整体发展水平，尤其是饲草料供需缺口巨大，严重阻碍了草食畜牧业乃至整个现代畜牧业发展的步伐。进而随着我国畜牧业的快速发展，粗饲料短缺问题日渐突出，阻碍了畜牧业的可持续发展，充分合理地利用秸秆饲料是缓解环境污染和粗饲料短缺的有效途径。
农作物秸秆在自然条件下是一种劣质饲料，其特点是蛋白质含量低而且品质不佳；粗纤维含量高，其中不易被家畜消化的木质素含量较高，质地粗硬，适口性差，采食率极低[1]。因此，将玉米秸秆调制成优质青贮饲料，提高其营养价值和适口性使其过腹转化增值，对促进玉米秸秆饲料化利用具有十分重要的现实意义。同时，农作物秸秆的综合利用是当前保护生态环境与节约再生能源的迫切需要，是促进农业可持续发展的要求[2]。
目前，我国通过青贮技术处理秸秆，在一般情况下，玉米秸秆上附着的乳酸菌数量不足，自身营养成分有限，青贮早期有益菌繁殖缓慢，而有害微生物繁殖较快，导致难以获得品质优良的青贮饲料[3]。为获得更好的青贮饲料，刘子瑜[4]在青贮中添加异型乳酸菌中的布氏乳杆菌以提高青贮品质及有氧稳定性；张适等[5]研究了不同乳酸菌对全株玉米发酵品质影响，认为乳酸菌能有效降低粗蛋白损失，降低氨氮/总氮含量，显著提高青贮饲料的发酵质量；经争辉等[6]研究发现，添加复合菌可以改善玉米秸秆青贮饲料发酵品质，延长青贮玉米秸秆有氧暴露后的保存时间。市场上的青贮添加剂主要可分为同型乳酸菌类、异型乳酸菌类、同型乳酸菌和异型乳酸菌复合剂类，因此在青贮过程中添加青贮剂提高青贮饲料品质逐渐被养殖行业所接受。添加乳酸菌虽然提高青贮饲料品质，但对二次发酵的改善效果却不显著。为解决二次发酵问题，在青贮玉米秸秆上尝试复合菌剂与酸化剂配合使用，以期在保证青贮饲料品质的同时，提高青贮有氧稳定性，同时监测青贮饲料发酵过程中酵母菌、乳酸菌变化规律及发酵后产物，为今后青贮饲料制作提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌剂及酸化剂
布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosus）：山东宝来利来生物工程股份有限公司。
酸化剂制备：将己酸、苯甲酸钠、山梨酸钾、丙酸钠溶于水中制成复合酸化剂，使其每升含有11 g己酸，257 g苯甲酸钠，134 g山梨酸钾和57 g丙酸铵。
1.1.2 青贮制备
玉米籽粒2/3乳线期收割秸秆，切至2～3 cm每段，按试验设计将菌液、酸化剂均匀地喷洒在青贮原料上，填装压实并确保聚乙烯青贮袋边角充分压实，抽真空后再用收缩膜密封，25 ℃厌氧发酵3个月，得到青贮饲料。
1.1.3 试剂
己酸（分析纯）：默克Sigma-Aldrich公司；苯甲酸钠（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；山梨酸钾（分析纯）：济南青海化工有限公司；丙酸铵（分析纯）：广东翁江化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
KDN-103F自动定氮仪：上海纤检仪器有限公司；TRACETM 1300气相色谱仪：赛默飞世尔科技有限公司；HPX-9082MBE电热恒温培养箱：上海博迅实业有限公司；SW-CJ-2F超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；PB-10酸度计：德国Sartorious公司；Optima Wax色谱柱（0.25 mm×0.25 μm×30 m）：德国杜伦Macherey-Nagel公司。
1.3 方法
1.3.1 试验设计
试验设对照组（CK，无添加）、布氏乳杆菌试验组（L1，菌添加量105 CFU/g青贮原料）、植物乳杆菌试验组（L2，菌添加量105CFU/g青贮原料）、戊糖片球菌菌试验组（L3，菌添加量105CFU/g青贮原料）、复合菌剂试验组（L4布氏乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌等比例添加，总添加量105 CFU/g青贮原料）、复合菌剂+酸化剂试验组（L5在复合菌剂试验组基础上额外添加复合酸化剂10 mL/kg），每个聚乙烯青贮袋里填充4 kg玉米秸秆青贮饲料，每个处理设8个重复，抽真空后密封，在25 ℃条件下进行青贮，分别在15 d、30 d、45 d、60 d、90 d取样（在取样时间点取样后弃用以防污染）测定pH、乳酸菌活菌数、酵母菌活菌数。青贮90 d完成后，开袋测定粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、乳酸、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯等指标，并在有氧条件下暴露，每12 h分别取样分析有氧稳定性。
1.3.2 干物质量测定[7]
取100 g青贮鲜样，置于65 ℃的烘箱中烘至质量恒定，冷却后称质量，干物质含量计算公式如下：
1.3.3 pH值测定
根据青贮饲料理化品质评定标准[8]用pH计测定pH值。
1.3.4 发酵产物测定
采用凯氏定氮法进行粗蛋白的测定；利用范氏法测定中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量[9]，乳酸乙酯和乙酸乙酯采用气相色谱测定[10]。
青贮中有机酸的测定[11]：称取5 g待测试样品置于离心管中，加入30 mL超纯水并加入H2SO4酸化使pH＜2，盖紧盖子，于4 ℃浸提24 h，然后用气相色谱法[12]测定乳酸、乙酸含量。
1.3.5 活菌数的测定
取10 g青贮饲料样品加入含有90 mL无菌水的三角瓶中，放入220 r/min摇床30 min，利用平板计数方法测定乳酸菌、酵母菌活菌数。
1.3.6 有氧稳定性测定[13]
青贮饲料有氧稳定性：每个重复中取出500 g样品放入聚乙烯塑料袋，用牙签扎出孔隙，放置于恒温隔热的塑料泡沫箱内，将温度记录仪插入青贮样品中心，每30 min记录一次。青贮有氧稳定性为青贮饲料中心温度比室温高2 ℃所需要的时间。
2 结果与分析
2.1 青贮过程中乳酸菌含量动态变化
青贮原料乳酸菌菌数为1.86×105 CFU/g，不同时间及不同处理条件下乳酸菌含量的动态变化结果见图1。由图1可知，与CK相比，在青贮中添加乳酸菌菌剂（L1、L2、L3、L4、L5试验组）可以使青贮初期乳酸菌含量迅速增加，15 d以后各组乳酸菌含量变化趋于平缓，45 d以后L1、L2、L3、L4、L5试验组乳酸菌菌数明显高于CK。30 d和90 d时，复合菌剂试验组（L4）乳酸菌菌数显著高于CK组、布氏乳杆菌试验组（L1）、植物乳杆菌试验组（L2）、戊糖片球菌试验组（L3）（P＜0.05），与复合菌剂＋酸化剂试验组（L5）差异不显著（P＞0.05），可见相比较于添加单一菌株，添加复合菌株更有利于青贮玉米秸秆中乳酸菌生长繁殖，同时酸化剂的添加也未起到消极作用。这可能是由于不同乳酸菌具有不同的功能，当不同类型乳酸菌复配在一起时，其协同作用更有利于形成适宜乳酸菌生存环境。
图1 玉米秸秆青贮过程中乳酸菌数变化
Fig.1 Change of lactic acid bacteria number during corn straw silage
2.2 青贮过程中酵母菌含量
青贮原料酵母菌菌数为6.46×106 CFU/g。不同时间及不同处理条件下酵母菌含量变化结果见图2。
图2 玉米秸秆青贮过程中酵母菌数变化
Fig.2 Change of yeast number during corn straw silage
由图2可知，添加乳酸菌试验组酵母菌含量均显著低于CK处理（P＜0.05）；90 d时，各处理酵母菌数为L5＜L4＜L1＜L2＜L3，且30 d后L5处理酵母菌数量显著小于其他处理（P＜0.05），充分说明在青贮中添加复合菌剂及酸化剂可以更好抑制酵母生长繁殖，酸化剂也明显促进对酵母菌的抑制作用。
2.3 青贮过程中pH值动态变化
图3 玉米秸秆青贮过程中pH值变化
Fig.3 Change of pH value during corn straw silage
由图3可知，随着青贮过程的进行，各处理pH不断降低，特别是L5处理由于酸化剂的添加，初始pH就低于其他处理，而且在0～90 d青贮过程中，L5处理的pH大体上小于其他处理；虽然各处理pH均处于下降趋势，但各处理仍未能很好的抑制酵母菌。
2.4 青贮90 d发酵产物
青贮原料干物质含量为35.25%，为进一步评定干物质损失，测定了90d时各处理青贮玉米秸秆干物质量，结果见表1。由表1可知，通过计算可得，发酵90 d时CK、L1、L2、L3、L4、L5处理干物质损失率分别为12.76%、7.57%、10.29%、11.25%、3.37%、5.19%，添加复合菌剂降低干物质损失效果最为显著（P＜0.05）。添加复合菌剂更能促进青贮前期乳酸发酵，加速青贮内环境的酸化，进而抑制有害微生物的活性，从而减少干物质损失。
表1 青贮玉米秸秆发酵90 d化学成分分析结果
Table 1 Results of chemical composition analysis of silage corn straw after fermentation 90 d
注：同行不同小写字母表示不同处理间差异显著（P＜0.05），下同。
青贮玉米秸秆发酵90 d时L1、L2、L3、L4、L5处理组粗蛋白、乳酸、乙酸含量较CK均有显著提高（P＜0.05），但酸性洗涤纤维差异不大（P＞0.05）；与CK相比，L1、L2、L3、L4、L5处理明显降低了中性洗涤纤维、乳酸乙酯、乙酸乙酯含量（P＜0.05）。与单一菌剂相比，添加复合菌剂明显降低中性洗涤纤维含量（P＜0.05），说明不同乳酸菌之间的协同作用增强了对纤维素的降解能力；另外，添加复合菌剂及酸化剂试验组（L5）比添加单一菌株试验组（L1、L2、L3）粗蛋白含量均有显著提升（P＜0.05），仅添加复合菌剂处理（L4）与L1、L2处理差异不显著（P＞0.05），说明酸化剂的添加对减少青贮蛋白损失起到积极作用，但L5处理的粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、乳酸指标与L4处理无显著差异（P＞0.05），说明了酸化剂对青贮的粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、乳酸含量影响不大。与CK相比，L2、L4、L5处理乳酸乙酯、乙酸乙酯含量显著降低（P＜0.05），L1处理仅降低了乳酸乙酯含量；L5处理乳酸乙酯、乙酸乙酯含量明显低于L4处理，说明添加酸化剂大大限制了乳酸乙酯、乙酸乙酯在青贮中的积累。
2.4 青贮饲料有氧稳定性
不同处理有氧稳定性结果如图4所示，有氧暴露后青贮pH变化如图5所示。由图4可知，添加菌剂处理的有氧稳定性均高于CK处理，其中L5处理有氧稳定性最强，差异达显著水平（P＜0.05），L4处理与L1、L2处理之间差异不大（P＞0.05），说明与单一菌剂相比，复合菌剂对提升青贮有氧稳定性效果不明显（P＞0.05），但添加酸化剂后提升效果显著（P＜0.05）。由图5可知，在青贮与空气接触后，0～3 d时各处理pH变化趋于平缓，3 d后pH开始快速上升，其中L5处理在0～11 d过程中pH均处于最低水平，在到达11 d时pH显著低于其他处理（P＜0.05），添加酸化剂可将有氧暴露0～11 d内青贮的pH保持在5以下，有助于抑制酵母菌、霉菌等腐败菌生长繁殖。
图4 各处理组青贮饲料有氧稳定性结果
Fig.4 Results of aerobic stability of silage of each treatments group
图5 有氧暴露后青贮饲料pH值变化
Fig.5 pH change of silage after aerobic exposure
3 讨论
青贮发酵是一个复杂的生物化学过程。同型乳酸菌代谢产物主要为乳酸，能迅速降低青贮饲料的pH，但其发酵产生的挥发性脂肪酸较少不能对青贮中的腐败菌产生良好的抑制效果[14-15]。异型乳酸菌虽然消耗底物更多，但可以产生大量乙酸抑制真菌生长繁殖，从而提高青贮有氧稳定性，减少二次发酵营养损失。鉴于此，复合菌剂为我国青贮生物添加剂研究提供新思路。万江春等[16]研究发现，添加同型/异型乳酸菌与单一菌种相比，虽然对发酵品质影响不大，但显著增加了乳酸、乙酸含量，有效抑制酵母菌的种类和数量。苗芳等[17]采用隶属函数法综合各项指标进行评价，结果发现异型乳酸菌菌剂布氏乳杆菌处理优于复合同、异型乳酸菌处理。ARRIOLA K G等[18]研究发现，单独添加布氏乳杆菌比添加戊糖片球菌和布氏乳杆菌更能提高玉米青贮品质。李晓玲等[19]研究表明，在青贮中添加单一和复合乳酸菌添加剂的作用效果尚无明确判定，且不同乳酸菌种类及复配比例下的复合乳酸菌添加剂作用与效果也不同。本研究中，在青贮中添加植物乳杆菌、布氏乳杆菌、戊糖片球菌3种菌株的复合菌剂与添加单一菌剂布氏乳杆菌或植物乳杆菌相比，干物质量、粗蛋白、乳酸、乳酸乙酯、有氧稳定性等指标差异不明显，说明与单一菌剂相比，在青贮中添加复合菌剂在青贮发酵品质上未表现出突出优势。可见，不同发酵类型的乳酸菌按不同的方式混合添加，其协同作用各不相同[20-21]，但菌株之间是如何协同作用还需要更多研究证实。虽然在本研究中复合菌剂与布氏乳杆菌、植物乳杆菌之间差异未达显著水平，但复合菌剂与酸化剂配合使用显著提高青贮粗蛋白含量，有效提高青贮有氧稳定性。
国外有研究表示，青贮饲料中挥发性有机物不仅可能会产生异味，有造成空气污染的风险[22]，还不利于反刍动物的采食量及新陈代谢[23]。在青贮中添加复合菌剂和酸化剂，与复合菌剂处理相比，虽然在干物质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗蛋白、乳酸指标上无显著差异，但显著降低了乳酸乙酯、乙酸乙酯含量。添加酸化剂有效抑制乙酸乙酯、乳酸乙酯的积累，预防环境污染风险，提高青贮适口性。
有氧稳定性也是评价饲料的一个重要指标，提高有氧稳定性，可以防止进一步的干物质和能量损失。复合菌剂和酸化剂组合的处理有氧稳定性显著高于其他处理且显著抑制酵母菌生长，从青贮过程pH变化也可以看出复合菌剂＋酸化剂，可以更快速降低pH，在发酵15 d时就显著低于其他处理，有氧暴露后0～11 d内pH也是低于其他处理的，说明添加酸化剂可以有效延长青贮饲料有氧暴露后的保存时间。究其原因，己酸具有两亲性结构，该结构可溶解细菌细胞膜并由于对电子传输链的干扰而扰乱氧化磷酸化过程，因而具有抗菌作用[24]；苯甲酸钠具有广谱抗微生物作用，其杀菌、抑菌效力会随着介质酸度的增加而增强；山梨酸钾有很强的抑制腐败菌和霉菌的作用，在酸性介质中能充分发挥防腐作用；丙酸铵在酸性条件下产生游离丙酸，对各类霉菌、革兰氏阴性杆菌有较好的抑菌效果。
4 结论
无论是单独添加布氏乳杆菌或植物乳杆菌，还是混合添加布氏乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌，均可显著提高青贮饲料的发酵品质。添加复合菌剂＋酸化剂与单独添加布氏乳杆菌或植物乳杆菌相比，复合菌剂＋酸化剂的添加有效抑制酵母生长，显著提高了青贮饲料有氧稳定性，延长了青贮储藏时间，而且酸化剂的添加不仅未对青贮饲料品质产生消极影响，还明显提高青贮饲料中粗蛋白含量。综合考虑发酵品质及有氧稳定性，复合菌剂＋酸化剂具有推广利用的潜质，在生产实践上可深入研究。
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