酱油因其味道鲜美、口感醇厚，成为人们餐桌饮食的重要调味品[1-2]。目前，国内外的酱油酿造工艺主要有低盐固态工艺和高盐稀态工艺两种[3]。低盐固态发酵工艺最初是为了改善无盐固态发酵酱油的风味而提出的，此工艺具有发酵温度高、能够抑制杂菌、原料利用率高和生产稳定的优点，并且周期较短、易于大规模生产，是我国大部分酱油生产企业主要釆用的发酵工艺。但是相较于高盐稀态发酵工艺，酶作用周期比较短，酯香味不足，生产的酱油以中低档为主[4]。高盐稀态发酵工艺是把原料经过蒸煮或焙炒、制曲后与20%左右的盐水混合成酱醪，经过发酵制成酱油。该工艺虽然周期长、原料利用率低，但是后发酵充分、味醇香浓，是厂家生产高档酱油的首选工艺[5]。但是高盐稀态酱油中较高的盐浓度（18%～22%）存在引发高血压、心血管等疾病的潜在危险，可能会影响人体健康[6]。食品法典委员会（codex alimentarius commission，CAC）建议将饮食中盐的摄入量从9 g/d减少到6 g/d[7]，世界卫生组织（world health organization，WHO）和粮食及农业组织（food and agriculture organization，FAO）建议每日盐摄取量不超过5 g/d[8]。所以食用低盐发酵酱油已成为一种趋势，提高低盐发酵酱油的品质已成为行业内亟待解决的问题。
酱油发酵是典型的混菌发酵过程，多种微生物参与其中并发挥作用，主要有曲霉、酵母菌、乳酸菌以及其他细菌，其中酵母菌和乳酸菌在酱油发酵过程中发挥重要作用。鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）、埃切假丝酵母（Candida etchellsii）和易变球拟酵母（Torulopsis versatilis）与酱油发酵的关系最为密切，其中研究和应用最多的是鲁氏接合酵母[9]。鲁氏接合酵母是酱醪中的优势微生物，主要作用于酱油发酵前期，除了能生成多种醇类，还能参与含硫化合物等风味物质的形成，带给酱油更加复杂和醇厚的香气。目前，人工添加鲁氏接合酵母的效果明显、技术成熟，并受到了一致认可[10]。乳酸菌种类多、总量大，能够发酵葡萄糖生成酸类物质，是影响酱油发酵的重要微生物[11-12]。嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）是一类参与酱油发酵的耐盐乳酸菌[13]。嗜盐四联球菌具有多种氨肽酶，能参与氨基酸的次级代谢和醇醛之间的转化[14-15]。在酱油生产过程中强化嗜盐四联球菌和酵母菌，能通过菌株间的协同作用使酱油风味更加丰富[12，16]。已有研究表明，添加两种酵母菌（Z.rouxii和皱状假丝酵母（Candida versatilis））和嗜盐四联球菌可使酱油中醇类、酯类、酸类和吡嗪类等物质含量显著增加，挥发性物质总量提高2.2倍[17]。嗜盐四联球菌对低盐酱油防腐有着一定的积极意义，其能够利用葡萄糖产生高浓度乳酸。乳酸不仅能赋予酱油柔和的酸味，而且酱油发酵过程中维持一定浓度的乳酸能有效抑制巨大芽胞杆菌（Bacillus megatherium）为主的酱油变质胀瓶污染菌，有利于成品酱油的质量安全[18-19]。另外，嗜盐四联球菌还能减少胺类危害物的含量[20]。
研究发现，酵母菌和乳酸菌在酱醪中存在通过物质代谢产生的拮抗作用，乳酸菌和酵母菌的添加需要有一定的间隔期，并且其添加量对酱醪发酵也有显著影响[21]。本研究以通过模拟低盐酱油快速发酵，在添加鲁氏接合酵母的基础上，考察嗜盐四联球菌不同添加量对酱醪理化指标、氨基酸和有机酸含量、挥发性风味物质等的影响，揭示其发酵功能，为提高低盐发酵酱油品质提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
酱油曲精（米曲霉（Aspergillus oryzae）沪酿3.042）：久味食品科技有限公司；嗜盐四联球菌R44、鲁氏接合酵母ZQ02：分离自新鲜酱醪，保存于本实验室。
1.1.2 培养基
嗜盐四联球菌培养基[22]采用MRS肉汤培养基：英国Oxoid公司。使用时添加NaCl 100 g/L，pH 7.0。固体培养基中添加琼脂20 g/L。
鲁氏接合酵母培养基[23]采用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeastextractpeptonedextrose，YPD）：北京索宝来科技有限公司。使用时添加NaCl 50g/L，pH 5.0。固体培养基中添加琼脂20 g/L。
嗜盐四联球菌计数培养基[23]采用MRS固体培养基：英国Oxoid公司。使用时添加纳他霉素0.1 g/L、NaCl 100 g/L，pH 7.0。
酵母菌计数培养基[5]采用孟加拉红固体培养基：青岛宝博生物科技有限公司。使用时添加丙酸钠5 g/L、NaCl 100 g/L，pH 5.0。
以上培养基均115 ℃灭菌30 min。
1.1.3 试剂
酵母膏、胰蛋白胨（均为生化试剂）：英国Oxoid公司；氨基酸标样、邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）（色谱纯）：美国Agilent公司；纳他霉素（纯度96%）：青岛宝博生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
867 pH计、ME204电子天平：瑞士Mettler-Toledo公司；MultiskanFC酶标仪：美国赛默飞世尔科技有限公司；Pegasus GC-HRT 4D+气相-高通量飞行时间质谱仪：美国力可公司；UV-1240紫外可见分光光度计：日本岛津公司；1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国安捷伦公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株培养
嗜盐四联球菌的培养：从甘油管中取适量嗜盐四联球菌菌液，接种至嗜盐四联球菌固体培养基，30 ℃活化培养5 d。从活化平板上挑取单菌落接种到嗜盐四联球菌液体培养基中，30 ℃静置培养60 h，按1%（V/V）的接种量接种至嗜盐四联球菌液体培养基，30 ℃静置培养至OD600nm值达到1.2（菌体浓度1.2×108 CFU/mL），备用。
鲁氏接合酵母的培养：从甘油管中取适量鲁氏接合酵母菌液，接种至鲁氏接合酵母固体培养基，30 ℃活化培养2 d。从活化平板上挑取单菌落接种到鲁氏接合酵母液体培养基中，30 ℃、220 r/min培养30 h，按1%（V/V）的接种量接种至鲁氏接合酵母液体培养基，30 ℃、220 r/min培养至OD600nm值达到4.0（菌体浓度6.4×107 CFU/mL），备用。
1.3.2 模拟低盐酱油快速发酵工艺
制曲工艺：将黄豆粉和1.2倍的水混合均匀后在121 ℃下灭菌15 min，冷却至室温后，把黄豆粉、炒熟的小麦粉（质量比为6∶4）和酱油曲精（原料总质量的1.5‰）充分拌匀。在生化培养箱中30 ℃培养48 h，适时翻曲，曲料表面长满菌丝即为成曲。
发酵工艺：将成曲用研钵碾碎，与盐水（100 g/L NaCl）以体积比1.0∶2.5混合。将混合后的酱醪分装入2 L坛子中，30 ℃发酵30 d，期间每天搅拌一次。在发酵第0、5、10、15、20、25和30天进行取样。
菌株的添加方式及添加量：模拟低盐酱油快速发酵过程菌株的添加方式及添加量见表1。发酵开始时（pH 5.2左右）添加107CFU/g鲁氏接合酵母ZQ02（Z）[1，24]。嗜盐四联球菌添加时间为发酵10 d，添加量分别为106 CFU/g（Z+T（10））、107CFU/g（Z+10×T（10））、108CFU/g（Z+100×T（10））。
表1 模拟低盐酱油快速发酵过程菌株的添加量
Table 1 Addition of strains during simulated low-salt soy sauce rapid fermentation
注：“/”表示不添加。
1.3.3 嗜盐四联球菌和酵母菌数量的测定
采用平板计数法[22-23]测定嗜盐四联球菌和酵母菌数量。称取1 g新鲜酱醪和99 mL生理盐水混匀，梯度稀释后涂布到计数培养基上，30 ℃培养3～6 d进行计数。嗜盐四联球菌为兼性厌氧菌，菌落较小，平板培养需要4～6 d。因此，MRS平板计数时可以和酱醪中优势耐盐细菌（包括魏斯氏菌（Weissella）、芽孢杆菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus））区分。本方法所计算的酵母数量包括添加的鲁氏接合酵母以及酱醪中的其他耐盐酵母，后者与前者相比数量较少，可忽略不计。
1.3.4 酱醪理化指标的测定
取100 g酱醪，12 000 r/min离心30 min，用孔径为0.22 μm的滤膜过滤上清液后进行测定。酱醪pH值采用精密pH计测定。总酸含量采用酸度计法测定[25]。还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸法（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）测定[26]。氨基酸态氮含量采用甲醛滴定法测定[26]。
1.3.5 酱醪游离氨基酸的测定
游离氨基酸采用高效液相色谱法测定，采用OPA进行柱内衍生化，具体测定方法参照文献[27]。
1.3.6 酱醪有机酸的测定
有机酸采用高效液相色谱法测定，具体方法参考文献[28]。
1.3.7 酱醪挥发性风味物质的测定
挥发性风味物质采用顶空固相微萃取（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）联合气质联用技术（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）进行测定，具体方法参考文献[1]。测定后将样品质谱图与美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）2.0标准谱库比对鉴定，根据保留指数（retention index，RI）对挥发性物质进行定性，根据内标2-辛醇（83.36 μg/L）的峰面积对挥发性物质进行半定量分析。
1.3.8 数据处理方法
利用Excel 2012、SPSS 19.0对数据进行处理分析，利用Origin 8.5、R语言和Adobe illustrator CS6对数据可视化。所有试验均重复3次，结果采用“均值±标准差”的形式展示。
2 结果与分析
2.1 酱油发酵过程中嗜盐四联球菌和酵母菌数量的动态变化
模拟低盐酱油快速发酵过程中，鲁氏接合酵母和嗜盐四联球菌数量的动态变化见图1。由图1可知，嗜盐四联球菌在第10天添加后，数量呈先降低后增加的趋势，发酵中后期可保持在105～106 CFU/g。单独添加鲁氏接合酵母，酱醪中鲁氏接合酵母的数量在发酵0～14 d有少量减少，发酵15 d后开始生长并在第30天达到4.7×106 CFU/g。嗜盐四联球菌的添加对鲁氏接合酵母的生长有一定的影响，使酱醪中酵母的数量降低了2.8～3.0个数量级。这种现象可能是因为它们的增值速率不同，且存在对营养物质的相互竞争，也可能受到各自代谢产物的抑制等。例如乳酸菌产生的乙酸、苯乳酸、环肽等化合物都能抑制酵母的生长[11]。只添加鲁氏接合酵母的酱醪中，也检测到了嗜盐四联球菌（3×103～9×103 CFU/g），这可能是酱醪体系中含有的嗜盐四联球菌。
图1 模拟低盐酱油快速发酵过程中嗜盐四联球菌（a）和酵母菌（b）数量的动态变化
Fig.1 Dynamic changes in cell numbers of Tetragenococcus halophilus(a) and yeast (b) during simulated low-salt soy sauce rapid fermentation
2.2 酱油发酵过程中酱醪理化指标的动态变化
对酱油发酵过程中酱醪的基本理化指标（pH、总酸、还原糖和氨基酸态氮含量）进行测定，结果见图2。
由图2可知，酱油发酵前5 d，酱醪的pH值及还原糖含量急剧下降，发酵5 d后，pH值略微上升，还原糖含量趋于稳定。添加嗜盐四联球菌后使酱醪pH值略有下降，发酵终点时酱醪pH值约为4.6～4.9；还原糖含量略有升高。酱油发酵过程中，酱醪中总酸、氨基酸态氮含量均呈现上升趋势，且添加嗜盐四联球菌后，酱醪中总酸和氨基酸态氮含量显著增加（P＜0.01）。在考察的4种添加方式中，发酵开始添加鲁氏接合酵母并在10 d添加106 CFU/g嗜盐四联球菌的酱醪样品中总酸和氨基酸态氮含量最高，发酵30 d后分别比只添加鲁氏接合酵母的样品提高了22.5%和30.2%。
图2 模拟低盐酱油快速发酵过程中酱醪的理化指标分析
Fig.2 Analysis of physicochemical indexes of soy sauce mash during simulated low-salt soy sauce rapid fermentation
2.3 嗜盐四联球菌添加对酱油中氨基酸含量的影响
嗜盐四联球菌是耐盐乳酸菌，已有研究证实酱醪来源的嗜盐四联球菌具有多种寡肽酶活性。因此，在酱油发酵过程中强化嗜盐四联球菌可能会增加酱油中游离氨基酸的含量。采用HPLC对模拟低盐酱油快速发酵不同时期酱醪中16种氨基酸进行定量分析，结果见图3，模拟低盐快速发酵酱油样品中呈味氨基酸含量变化见图4。
图3 模拟低盐酱油快速发酵过程中酱醪氨基酸含量变化
Fig.3 Change of amino acids contents in soy sauce mash during simulated low-salt soy sauce rapid fermentation
图4 模拟低盐快速发酵酱油样品中呈味氨基酸含量的测定结果
Fig.4 Determination results of tasty amino acids contents in simulated low-salt rapid fermented soy sauce samples
“**”表示差异极显著（P＜0.01）。
由图3可知，添加嗜盐四联球菌能显著提高游离氨基酸含量（P＜0.01）。发酵终点时，发酵开始添加鲁氏接合酵母并在10 d添加108CFU/g嗜盐四联球菌的酱醪中氨基酸总量最高，达到28.7 g/L，比只添加鲁氏接合酵母的酱醪样品（19.9 g/L）高43.8%。为进一步分析嗜盐四联球菌对酱油中游离氨基酸的贡献，比较了强化嗜盐四联球菌对酱油中鲜味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）和甜味氨基酸（甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸和丝氨酸）含量的影响。由图4可知，添加嗜盐四联球菌使酱油中鲜味氨基酸和甜味氨基酸的含量显著增加（P＜0.01）。其中发酵开始添加鲁氏接合酵母并在10 d添加108 CFU/g嗜盐四联球菌发酵的酱油中鲜味和甜味氨基酸含量最高，分别达到8.5 g/L和4.9 g/L，比只添加鲁氏接合酵母的酱油样品（6.3 g/L和3.8 g/L）分别高33.7%和29.8%。
2.4 嗜盐四联球菌添加对酱油中有机酸含量的影响
酱油中由乳酸菌产生的有机酸不仅是酱油风味物质的重要组成部分，也起到抑制酱醪中腐败菌或杂菌生长的作用[19]。采用HPLC对模拟低盐快速发酵酱油样品中的有机酸进行定量分析，结果见表2。
表2 模拟低盐快速发酵酱油样品中有机酸含量分析
Table 2 Analysis of organic acids contents in simulated low-salt rapid fermented soy sauce samples
由表2可知，通过HPLC从模拟低盐快速发酵酱油样品中共检测到6种主要有机酸，包括柠檬酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸和丙酸。其中，乳酸、乙酸和丙酸的含量相对较高，是酱油中含有的主要有机酸。添加嗜盐四联球菌可使酱油中苹果酸、乳酸、乙酸和丙酸含量增加，这对于改善酱油风味和抑菌防腐具有积极的意义。发酵开始添加鲁氏接合酵母并在10 d添加108 CFU/g嗜盐四联球菌的酱油中有机酸总量最高，达到15.3 g/L，比只添加鲁氏接合酵母（9.8 g/L）高55.6%；其中苹果酸和丙酸的含量几乎达到不添加嗜盐四联球菌的2倍。
2.5 嗜盐四联球菌添加对酱油中挥发性风味物质的影响
利用SPME-GC-MS对模拟低盐快速发酵酱油样品中的挥发性风味物质进行检测并分析，结果见表3。由表3可知，采用不同菌株添加方式发酵的酱油中所检测到的挥发性风味物质种类差异较大。其中发酵开始添加鲁氏接合酵母并在10 d添加108 CFU/g嗜盐四联球菌的酱油中挥发性物质种类最多，达到63种；只添加酵母菌的酱油中挥发性物质种类最少，仅为44种。此外，共同添加嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母进行发酵的酱油中风味物质种类都高于单独添加鲁氏接合酵母发酵的酱油，说明嗜盐四联球菌与酵母菌协同作用有助于显著提高酱油中挥发性风味物质的种类。
表3 模拟低盐快速发酵酱油样品中挥发性风味物质的种类
Table 3 Types of volatiles in simulated low-salt rapid fermented soy sauce samples
进一步对模拟低盐快速发酵酱油中挥发性物质含量进行分析，结果见图5。由图5可知，不同发酵方式的酱油样品中挥发性风味物质含量有明显差异。在发酵过程中共同添加嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母，由于两菌的协同作用，显著提高了酱油中挥发性风味物质的含量。发酵开始添加鲁氏接合酵母并在10 d添加107 CFU/g或者108 CFU/g嗜盐四联球菌酱油样品中挥发性物质含量比单独添加酵母菌酱油的样品分别高1.7倍和2.4倍。
图5 模拟低盐快速发酵酱油样品中挥发性风味物质含量的比较
Fig.5 Comparison of volatiles contents in simulated low-salt rapid fermented soy sauce samples
为进一步揭示嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母通过协同作用对酱油风味的贡献，通过文献总结，对酱油中主要风味物质[29-31]进行聚类分析来鉴别与所强化菌株相关的风味物质合成，结果见图6。由图6可知，模拟低盐快速发酵酱油样品中含量较多的醇类化合物主要有乙醇、异丁醇、异戊醇、1-辛烯-3-醇、2-十一醇、苯乙醇等，嗜盐四联球菌的添加量对这些醇类含量的增加起到重要作用（图6a），其中发酵开始添加鲁氏接合酵母并在10 d添加107 CFU/g或者108 CFU/g嗜盐四联球菌酱油样品中1-辛烯-3-醇含量比单独添加酵母菌分别提高了6.4倍和8.9倍。嗜盐四联球菌可以和酵母菌相互作用显著提高乙酸含量，添加108 CFU/g嗜盐四联球菌酱油样品中的乙酸含量比单独添加酵母提高了26.4倍（图6b）。添加嗜盐四联球菌可以显著提高乙酸乙酯、乳酸乙酯等含量（图6c）。发酵开始添加鲁氏接合酵母并在10 d添加108 CFU/g嗜盐四联球菌的酱油样品的酚类物质总含量最多，愈创木酚含量比单独添加酵母菌提高了11.1倍（图6d）。3-甲基丁醛、己醛、糠醛、苯甲醛和苯乙醛等相对含量显著高于其他发酵方式的酱油样品（图6e）。酮类和呋喃物质含量分别比单独添加酵母菌提高了14.5倍和3.2倍（图6f）。
图6 模拟低盐快速发酵酱油样品中主要风味物质聚类分析
Fig.6 Clustering analyse of major volatiles in simulated low-salt rapid fermented soy sauce samples
a：醇类；b：酸类；c：酯类；d：酚类；e：醛类；f：其他。
3 结论
嗜盐四联球菌是参与酱油发酵的重要乳酸菌，在提高酱油风味方面具有一定的积极作用。本研究揭示了模拟低盐酱油快速发酵过程中嗜盐四联球菌与鲁氏接合酵母协同提高酱油品质的相关作用，对将它们用于改善低盐发酵酱油品质具有重要意义。添加嗜盐四联球菌会使酱醪pH略有下降，总酸和氨基酸态氮含量提高。最适宜提高酱油品质的菌株添加方式是发酵开始接入鲁氏接合酵母并在第10天添加108 CFU/g嗜盐四联球菌。与只添加鲁氏接合酵母酱油比较，总氨基酸含量提高43.8%，其中鲜味和甜味氨基酸分别提高33.7%和29.8%；有机酸总量提高55.6%，且苹果酸、乙酸、乳酸和丙酸等有机酸含量显著增加；挥发性风味物质种类增加了19种，总含量提高了2.4倍，其中香气物质愈创木酚和1-辛烯-3-醇含量分别提高11.1倍、8.9倍。虽然嗜盐四联球菌对鲁氏接合酵母的生长有一定的抑制作用，但是通过协调两个菌的添加时间，可使它们在增加酱油中挥发性风味物质种类和提高风味物质含量方面发挥作用。本研究阐明了模拟低盐酱油快速发酵过程中嗜盐四联球菌的发酵功能，日后可通过选育耐高温的鲁氏接合酵母和嗜盐四联球菌，为开发提高低盐酱油品质的发酵技术提供参考。
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