生香酵母又名产酯酵母，主要是假丝酵母属（Candida）和汉逊酵母属（Hansenula），在白酒生产中汉逊酵母应用最多[1]。生香酵母在白酒酿造中主要产生乙酸乙酯以增酯提香[2-3]，其代谢产物中的醇类、酸类、羰基化合物等物质对于协调酒体味道也有重要作用[4-5]。生香酵母发酵过程中水解和酯化反应有助于协调酒液中的酸、醇和酯水平[6]，有利于维持酒体中物质的平衡。
清香型白酒以乙酸乙酯为主体香，其口味清香、醇厚，但我国清香型白酒的生产是以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、根霉（Rhizopus）等为主体进行发酵，酒液中酯类含量较低，需要提高酒体口味和品质[7]。液态发酵法生产白酒是我国生产白酒的组成部分，杨强等[8]从酒曲中通过液态发酵法分离出一株高产乙酸乙酯的酵母菌种Y29，较对照的乙酸乙酯产量显著提高，且出酒率等未受影响。液态发酵酿酒技术具有工艺简单、出酒率高、成本低等优点，但酒的品质差[9]，因此，探究生香酵母发酵产酯代谢特点，将其应用于高品质的清香型白酒的生产有重要意义。
目前，针对生香酵母的产酯工艺优化大多是从发酵糖度、溶液酸碱度、温度等方面进行优化[10-12]，对于生香酵母菌株的生长情况以及产酯发酵过程中的调控考虑较少，对于生香酵母产酯工艺的过程仍需调整优化。因此，本研究通过均匀试验设计优化生香酵母产酯工艺，针对生香酵母产酯的过程进行分阶段调控，确定生香酵母产酯代谢各阶段的时间，优化出最佳的生香酵母产酯工艺，为生产高质量的清香型白酒提供思路，为提高液态发酵白酒的品质提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种汉逊酵母属（Hansenula）生香酵母H1：分离自安琪生香酵母酒曲，实验室保藏。
1.1.2 试剂
盐酸羟胺、氢氧化钠、乙酸乙酯（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；无水乙醇（分析纯）：重庆川东化工有限公司；酚酞指示剂：成都市科龙化工试剂厂。
1.1.3 培养基
酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）琼脂培养基：蛋白胨20.0 g、酵母膏10.0 g、葡萄糖20.0 g、琼脂20.0 g、蒸馏水1 L，pH为6.0，115 ℃高压湿热灭菌15 min。YEPD液体培养基中不添加琼脂。
产酯发酵培养基[13]：葡萄糖161 g、酵母膏0.10 g、磷酸二氢钾0.10 g、磷酸氢二铵0.25 g，氯化镁0.10 g，5.0%豆芽汁1 L，pH为5.0，115 ℃高压湿热灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
L-550台式离心机、TGL-16M高速台式冷冻离心机：长沙湘仪离心机有限公司；ZHWY-2102C振荡培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司；BSP-100生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；FE20实验室pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；UV-2450分光光度仪：岛津国际贸易有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 生香酵母H1产酯发酵工艺
根据生香酵母产酯代谢特点[13-14]，其产酯过程可概括为酵母生长阶段、乙醇发酵阶段、产酯阶段，本研究通过此三阶段对生香酵母产酯工艺进行优化。取适量菌液划线于YEPD琼脂培养基，28 ℃条件下培养48 h。挑取单菌落接种于200 mL YEPD液体培养基中，28 ℃条件下培养36 h，制备种子液。按10%（V/V）的接种量将种子液接种于产酯发酵培养基，装液量为100 mL/250 mL，28 ℃、180 r/min条件下培养，设置三组平行试验。按照均匀试验设计表进行试验。如第1组，接种培养4 h后取出锥形瓶，进行密封，于28 ℃生化培养箱中静置培养，进入乙醇发酵阶段。发酵72 h之后，解除密封状态，进入产酯发酵阶段。发酵88 h后取出发酵瓶，测定总酯和乙酸乙酯含量。
1.3.2 生香酵母H1产酯发酵工艺优化均匀试验设计
以总酯含量（Y1）和乙酸乙酯含量（Y2）为评价指标，选取菌株生长时间（A）、乙醇发酵时间（B）、产酯发酵时间（C）为考察因素，进行3因素13水平的均匀设计优化试验，因素与水平见表1[15]。
表1 生香酵母H1产酯发酵工艺优化均匀试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of uniform test design for ester production process optimization of aroma-producing yeast H1
1.3.3 测定方法
总酸、总酯含量的测定：参照国标GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[16]。
乙酸乙酯含量的测定[17]：乙酸乙酯可以与盐酸羟胺乙醇溶液及三氯化铁反应，生成一种洋红色的络合物，这种洋红色的络合物在波长530 nm处有特征吸收峰，采用紫外-可见光分光光度计对其含量进行测定。
1.3.4 均匀试验设计数学建模
对试验数据进行分析处理，采用逐步递进回归分析法[18]建立发酵液中总酯含量、乙酸乙酯含量与酵母生长时间、乙醇发酵时间、产酯发酵时间的数学模型，采用网格法[19]对生香酵母H1发酵液中的总酯含量、乙酸乙酯含量的回归方程拟定出最优组合。
1.3.5 验证试验
对回归分析优化后的结果进行验证，并与模拟结果进行比对分析，确定生香酵母产酯发酵的最优生产工艺。
2 结果与分析
2.1 生香酵母H1产酯发酵工艺优化均匀试验设计与结果
表2 生香酵母H1产酯发酵工艺优化均匀试验设计与结果
Table 2 Design and results of uniform test for ester production process optimization of aroma-producing yeast H1
续表
生香酵母代谢复杂，与发酵培养时间、温度、供氧情况等多种因素相关[20]。有研究发现，温度可以影响氧气和二氧化碳的溶解度，进而对酵母代谢产生影响[21]，过高的温度会积累较多的乙醇，产生细胞毒性[22]。因此，本研究在28 ℃条件下研究生香酵母H1产酯发酵工艺条件 [23]，利用均匀试验设计对生香酵母H1发酵产酯工艺进行优化，结果见表2。
由表2可知，乙酸乙酯含量和总酯含量变化趋势相同，且每组试验中乙酸乙酯含量均高于总酯含量的60%，说明生香酵母H1主要产生乙酸乙酯，为其在生产清香型白酒中的应用奠定基础。当总酯含量达到最大值（2.090 g/L）时，发酵液中的总酸含量达到最低值（1.680 g/L），总酸含量与酯类物质的含量呈现相反的变化趋势，表明发酵液中酸参与了生香酵母的产酯代谢过程，并作为合成酯的前体物质被发酵利用。
酵母生长时间不足会影响酵母代谢产物的积累，影响白酒的质量。由表2可知，当酵母生长时间仅为4 h 时，总酯含量为1.085 g/L，总酸的含量较高为2.437 g/L。由于酵母在发酵初期需要生长积累数量，为后续发酵保证有足够数量的“发酵工厂”，因此，当酵母的生长时间过短时，对于酸的利用较少，总酯的积累受到限制。发酵过程中的酯类物质含量受乙醇发酵时间的影响较大，乙醇发酵阶段过长，乙醇过多产生可能导致细胞毒性，影响酯的积累，如乙醇发酵时间为104 h时，总酯含量（1.399 g/L）比乙醇发酵时间为64 h的总酯含量（2.090 g/L）低，表明需要合理控制乙醇发酵时间，并对该阶段工艺进行优化。此外，产酯时间也是影响酯积累的重要因素。当产酯发酵时间为8 h时，总酯含量仅为0.554 g/L。但如果菌体数量积累过大，发酵时间过长，也会导致营养物质匮乏，产酯量降低[24]，如当发酵产酯时间为104 h时，其总酯含量仅为1.187 g/L，提示在生产工艺的控制中，需要选择合适产酯发酵时间，以保证白酒的生产质量。此外，结果显示，总酯及乙酸乙酯含量最高的一组（4号），其产酯发酵时间仅为16 h，表明酵母产酯发酵时间是影响酵母产酯的重要因素，需要进行优化。在酒液中，酸、醇、酯等物质对于白酒口味的协调非常重要，因此，本研究针对酵母生长时间、乙醇发酵时间、产酯发酵时间三个阶段进行优化合理，利于提高白酒的质量，有助于白酒酿造工艺的发展。
2.2 均匀试验设计数学建模回归分析
2.2.1 总酯含量模型回归分析
通过均匀试验设计软件对表2总酯含量的试验数据进行分析，采用逐步递进法回归分析后得到了发酵液中总酯含量（Y1）与生香酵母的生长时间（A）、乙醇发酵时间（B）、产酯发酵时间（C）的数学模型：
采用网格法对发酵过程中总酯的回归方程搜索最优化组合，结果表明，当生香酵母H1的生长时间为18 h，乙醇发酵时间为74 h，产酯发酵时间为20 h时，预期最优总酯含量可达到2.260 g/L，显著性水平α=0.100 0；剩余标准差s=0.084 7；复相关系数R2=0.996 7；决定系数R2=0.993 3。
2.2.2 乙酸乙酯含量模型回归分析
发酵液中乙酸乙酯含量变化趋势和总酯含量变化趋势相同，因此，对于总酯和乙酸乙酯的数学模型的优化结果较一致，通过均匀试验设计软件对表2中乙酸乙酯含量的试验数据进行分析，采用逐步递进法回归分析后得到了发酵液中乙酸乙酯含量（Y2）与生香酵母生长时间（A）、乙醇发酵时间（B）、产酯发酵时间（C）的数学模型：
采用网格法对发酵产生乙酸乙酯的回归方程搜索最优化组合，结果表明，当酵母菌体生长时间为16 h，乙醇发酵时间为69 h，产酯发酵时间为18 h时，预期最优乙酸乙酯含量可达到1.933 g/L，显著性水平α=0.100 0；剩余标准差s=0.078 8；复相关系数R2=0.996 6；决定系数R2=0.993 1。
2.2.3 验证试验
总酯中含量最多的为乙酸乙酯，因此，在进行验证试验时根据总酯含量的数学模型优化结果进行验证试验，对发酵液中总酯、乙酸乙酯含量进行分析。结果表明，当生香酵母H1生长时间为18 h、乙醇发酵时间为74 h、产酯发酵时间为20 h时，发酵液中最终的总酯含量可达2.463 g/L，比预期试验结果（2.260 g/L）提高8.980%；乙酸乙酯含量为2.164 g/L，比预期试验结果（1.933 g/L）提高11.95%。在此最优发酵工艺下，发酵液中总酯及乙酸乙酯含量均高于表2中4号试验组。因此，确定生香酵母H1产酯的最优发酵工艺为菌株生长时间18 h、乙醇发酵时间74 h、产酯发酵时间20 h。优化后的生香酵母H1的生长时间为18 h，此时的酵母细胞新陈代谢旺盛，对环境变化适应能力强，酵母细胞积累适量，培养基营养物质充裕，此时进入乙醇发酵阶段，充裕的营养物质可以为乙醇的积累提供保障。总酯模型中含有乙醇发酵时间（B）的优化项较多，表明乙醇发酵时间是影响生香酵母产酯发酵的重要因素。生香酵母乙醇发酵能力大多较酿造型酵母低，可能需要花费较长的时间进行乙醇的积累，而乙醇作为酯类物质合成的重要物质，乙醇的积累对于总酯、乙酸乙酯的积累量有重要的作用。优化后的乙醇发酵时间为74 h，符合实际，优化合理。产酯发酵阶段是利用前期积累的前提物质进行酯类物质的合成，但如果产酯时间过长，产酯的前体物质消耗殆尽，总酯不再积累，甚至伴随着氧气供给酯酶活力恢复，导致发酵液总酯含量下降，符合优化目的。验证试验结果表明优化后的工艺符合并优于预期试验结果，表明数学模型建立成功，优化后的工艺组合可靠，达到实验目的。
3 结论
以生香酵母菌种H1进行产酯发酵研究，通过均匀试验设计优化、数学建模回归分析后确定其产酯最优发酵工艺为菌株生长时间18 h，乙醇发酵时间74 h，产酯发酵时间20 h。在此最优发酵工艺下，发酵液中总酯含量为2.463 g/L，乙酸乙酯含量为2.164 g/L，与预期结果相符，表明数学模型建立可靠、数据可信度高。优化生香酵母产酯发酵条件，对于提高白酒品质有重要意义，也为液态发酵酿酒技术提供了参考，具有较高的应用价值。
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