圆叶葡萄（Vitis rotundifolia）为葡萄科（Vitaceae）圆叶葡萄亚属，起源于美国东南部地区[1]。圆叶葡萄引种至我国，已在广西、浙江、成都[2-3]等地栽植成功，且可实现一年两熟。圆叶葡萄品种颜色有绿色、铜色、红色、黑色等，果实具有特殊的芳香和风味，既可鲜食，又可加工成果酒、果汁、果脯、果酱等[4]。圆叶葡萄具有良好的抗氧化、抗菌、消炎、抗癌等功效[5-7]，这些都得益于其含有的多种酚类物质。圆叶葡萄的果皮和种子中含有大量的儿茶素、表儿茶素及其多聚体，还含有鞣花酸、没食子酸、山柰酚、槲皮素等[8]。
原花色素（proanthocyanidins，PAs）是植物中广泛存在的一大类多酚化合物的总称，由儿茶素、表儿茶素单体和不同数量的儿茶素或表儿茶素聚合体组成[9]，能够抗氧化、清除自由基，已广泛应用于食品、医药、化妆品等领域[10]。葡萄籽中的原花色素，是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂[11]。葡萄籽中所含多酚类物质占整个葡萄果实酚类物质的60%左右，葡萄籽中酚类物质原花色素含量高达90%以上，因此提取原花色素的最好原料为葡萄籽[12]。
本研究对诺贝尔（Noble）圆叶葡萄籽所提取的原花色素的稳定性及抗氧化性进行研究，以期为圆叶葡萄进一步开发和综合利用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
圆叶葡萄籽：取自发酵后的诺贝尔（Noble）圆叶葡萄皮渣中，葡萄产地为广西都安县。
原花青素标准品（葡萄籽提取物，含原花色素95%）：上海源叶生物科技有限公司。
1,1-二苯-1-苦基苯肼（1,1-dipheny1-2-picryhydrazy1，DPPH）（分析纯）：美国Sigma公司；硫酸亚铁、三氯化铁、香草醛、抗坏血酸（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；铁氰化钾（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；三氯乙酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；石油醚、过氧化氢（均为分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；浓盐酸（分析纯）：廉江市爱廉化试剂有限公司；无水乙醇、甲醇（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；水杨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠、氯化镁（均为分析纯）：天津博迪化工股份有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-1801紫外/可见分光光度计：北京瑞利分析仪器有限公司；HH-S4数显恒温水浴锅：江苏金怡医疗仪器厂；FA2004N分析天平：上海明桥精密科学仪器有限公司；TG16-WS台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；雷磁pH-3C酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 圆叶葡萄籽中原花色素提取
把葡萄籽粉碎后，加一定量的石油醚浸泡脱脂，干燥。以料液比1∶20（g∶mL）加入体积分数70%的乙醇溶液超声波浸提20 min后，50 ℃水浴80 min，得到原花色素提取液，3 000 r/min离心10 min后置于4 ℃条件下保存备用[13-14]。
1.3.2 圆叶葡萄籽原花色素的光谱特性
取一定量的原花色素提取液，用UV-1801紫外/可见分光光度计在波长350～700 nm范围内测定其吸光度值，绘制特征吸收光谱。
1.3.3 原花色素含量的测定
采用香草醛-盐酸法[15]：准确称取原花青素标准品配制成质量浓度为0.6 mg/mL的对照品标准溶液，分别取1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL定容至10 mL。各取1.00 mL（另取1.00 mL甲醇液为空白液）于比色管中，分别加入5.00 mL显色剂，摇匀后在30 ℃避光水浴30 min，然后测定A500nm值，绘制标准曲线，得到回归方程为y=0.773 3x+0.007 2（其中y为吸光度值，x为原花色素质量浓度，R2=0.999 1）。
1.3.4 圆叶葡萄籽原花色素稳定性的研究
温度对原花色素稳定性的影响：量取一定的原花色素提取液，分别于20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、95 ℃条件下避光保温，每隔0.5 h取样冷却后，测定其吸光度值。
pH值对原花色素稳定性的影响：量取一定的原花色素提取液，配制成pH值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的溶液，混匀后室温避光放置4 h、8 h、12 h、24 h、48 h后，测其吸光度值。
金属离子对原花色素稳定性的影响：量取一定的原花色素提取液，分别加入浓度相等的K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+溶液，混匀后室温避光放置，设对照，按2 h、24 h、48 h取样测定其吸光度值。
还原剂、氧化剂对原花色素稳定性的影响：量取一定的原花色素提取液，分别加入质量分数为0.1%、0.5%、1.0%的抗坏血酸溶液和过氧化氢溶液，混匀后室温避光放置，设对照，每天取样测定其吸光度值。
光照对原花色素稳定性的影响：量取一定的原花色素提取液，置于室内避光、室内自然光条件下，每5天取样测定其吸光度值。
1.3.5 圆叶葡萄籽原花色素体外抗氧化活性的测定
DPPH自由基（DPPH·）清除率的测定[16]：取不同浓度样品各0.2 mL倒入试管，加入3.8 mL质量浓度为80 mg/L DPPH·的无水乙醇溶液，摇匀，室温条件下黑暗处放置30 min，于波长517 nm处分别测定吸光度值Ai；另取不同浓度样品各0.1 mL倒入试管，加入3.9 mL无水乙醇，于波长517 nm处分别测定参比吸光度值Ab；再取0.1 mL无水乙醇，加入3.9 mL 80 mg/L的DPPH·无水乙醇溶液，于波长517 nm处测定空白吸光度值A0，计算DPPH·清除率，其计算公式如下：
羟基自由基（·OH）清除率的测定[16]：取不同浓度样品各2 mL倒入试管，加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液，再加入6 mmol/LH2O2溶液，摇匀，静置10 min后，加入2 mL 6 mmol/L水杨酸溶液，摇匀，静置30 min。于波长510 nm处分别测定其吸光度值Ai；另用蒸馏水代替水杨酸溶液重复上述试验，测得参比吸光度值Ab；另用蒸馏水代替样品溶液重复上述试验，测得空白吸光度值A0，计算·OH清除率，其计算公式如下：
还原力（铁离子还原能力）的测定[17]：将5 mL原花色素溶液、1 mL、pH 6.6、0.2 mol/L的磷酸钠缓冲液和1.0 mL 1%的铁氰化钾混匀，于50 ℃水浴反应20 min后急速冷却。然后在上述溶液中加入1.0 mL 10%的三氯乙酸溶液，3 000 r/min离心10 min，取上清液2.0 mL。在上清液中加入2.0 mL蒸馏水及0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀，10 min后于波长700 nm处测定其吸光度值。吸光度值越高说明样品的还原能力越强。
1.3.6 数据处理
采用Office 2010统计和处理各数据，试验重复3次，采用Origin 8.5作图。
2 结果与分析
2.1 圆叶葡萄籽原花色素的光谱特性
圆叶葡萄籽原花色素在波长350～700 nm之间有一最大吸收峰，该峰峰值在波长500 nm处，因此选定500 nm作为最佳吸收波长。
2.2 圆叶葡萄籽原花色素稳定性的研究
2.2.1 温度对圆叶葡萄籽原花色素稳定性的影响
图1 温度对原花色素稳定性的影响
Fig.1 Effect of temperature on the stability of proanthocyandin
由图1可知，温度为20 ℃、40 ℃、60 ℃时，原花色素溶液吸光度值随时间的延长，无显著变化。温度为80 ℃时，其原花色素溶液吸光度值相较于20 ℃、40 ℃、60 ℃缓慢升高，但增幅不大。在95 ℃条件下，随着加热时间的延长，原花色素溶液吸光度值则显著上升，颜色由橘黄色变为褐色，吸光度值明显变大。这可能是由于高温条件下葡萄籽原花色素受热分解为其他物质所致[18]。由此可说明圆叶葡萄籽原花色素在温度低于80 ℃时具有良好的稳定性，但更适合于低温条件下保存和应用。
2.2.2 pH值对圆叶葡萄籽原花色素稳定性的影响
图2 pH值对原花色素稳定性的影响
Fig.2 Effect of pH on the stability of proanthocyandin
由图2可知，不同pH对原花色素的影响差异较大，特别是pH≤3、pH≥9时，原花色素溶液吸光度值随着时间的推移而显著变小，而当pH为4～8时，原花色素溶液吸光度值下降不明显，稳定性较好。由此可见，酸性或碱性过强都会破坏原花色素的结构，在弱酸、弱碱性（pH4～8）条件下其相对比较稳定。
2.2.3 金属离子对圆叶葡萄籽原花色素稳定性的影响
图3 金属离子对原花色素稳定性的影响
Fig.3 Effect of metal ions on the stability of proanthocyandin
由图3可知，在含有K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+金属离子的溶液中，原花色素的吸光度值随时间变化不明显，与对照组变化相似，对原花色素稳定性影响不大。而当原花色素遇Cu2+时，溶液颜色立刻转变为棕绿色，吸光度值明显减小；加入Fe3+后溶液颜色立刻转为绿褐色，并带有轻微浑浊现象，吸光度值减小，常温放置24 h后有絮状沉淀产生。由此可以看出Cu2+、Fe3+对原花色素有明显的破坏作用。
2.2.4 还原剂、氧化剂对原花色素稳定性的影响
图4 抗坏血酸对原花色素稳定性的影响
Fig.4 Effect of ascorbic acid on the stability of proanthocyandin
由图4可知，与对照相比，抗坏血酸对原花色素的影响不明显。0.1%抗坏血酸对原花色素几乎无影响，而0.5%和1%抗坏血酸随着时间的延长，引起原花色素溶液吸光度值小幅下降。因此，还原剂抗坏血酸对圆叶葡萄籽中原花色素无明显的破坏作用。
由图5可知，与对照相比，0.1%与0.5%过氧化氢溶液对原花色素稳定性影响较小，而1.0%过氧化氢溶液对原花色素影响较大，吸光度值明显下降，表明氧化剂浓度越高，对原花色素溶液破坏越大。
图5 过氧化氢对原花色素稳定性的影响
Fig.5 Effect of hydrogen peroxide on the stability of proanthocyandin
2.2.5 光照对圆叶葡萄籽原花色素稳定性的影响
图6 光照对原花色素稳定性的影响
Fig.6 Effect of light on the stability of proanthocyandin
由图6可知，在室温条件下，圆叶葡萄籽原花色素易受光照影响，随着时间的延长，原花色素的吸光度值逐渐下降。避光条件下原花色素的稳定性明显较好，其降解速度较慢，在使用和保存时应该避光处理。
2.3 圆叶葡萄籽原花色素体外抗氧化活性分析
2.3.1 圆叶葡萄籽原花色素对DPPH·的清除作用
原花色素分子中含有大量的酚羟基，使其具有强大的抗氧化和自由基清除能力[19]。
图7 原花色素对DPPH自由基的清除作用
Fig.7 Scavenging effect of proanthocyandin on DPPH free radical
由图7可知，当原花色素溶液质量浓度在0.01～0.1mg/mL范围内，圆叶葡萄籽原花色素对DPPH自由基具有清除作用，随着原花色素质量浓度的增加，DPPH自由基的清除能力逐渐增强，并且在原花色素用量很低的情况下，清除率仍可高达90%以上，由此得出，葡萄籽原花色素具备一定的清除DPPH自由基的能力。
2.3.2 圆叶葡萄籽原花色素对·OH的清除作用
H2O2与Fe2+反应生成的羟基自由基能与水杨酸产生有色物质，可由溶液颜色的变化程度，来评价原花色素物质抗氧化活性的高低[20]。
图8 原花色素对·OH的清除作用
Fig.8 Scavenging effect of proanthocyandin on hydroxyl radical
由图8可知，在选定的质量浓度范围内，原花色素溶液对羟基自由基有较好的清除作用，其清除效果与原花色素溶液的添加量呈正相关。当原花色素质量浓度为0.1 mg/mL时，其清除率达到59.12%。葡萄籽原花色素具备一定的清除羟基自由基的能力。
2.3.3 圆叶葡萄籽原花色素的铁离子还原能力
图9 原花色素的铁离子还原能力
Fig.9 Iron reducing power of proanthocyandin
由图9可知，圆叶葡萄籽原花色素具有一定的还原能力，当质量浓度＜0.08 mg/mL时，随质量浓度增加，吸光度值增加幅度明显，原花色素还原力逐渐增强，还原能力显示出一定的量效关系；当质量浓度＞0.08 mg/mL时，随质量浓度增大，吸光度值变化趋缓，原花色素还原能力增加缓慢。
3 结论
通过温度、pH、金属离子、氧化剂还原剂、光照五个因素对圆叶葡萄籽原花色素的稳定性影响进行研究，结果表明，圆叶葡萄籽原花色素在温度低于80 ℃时具有良好的稳定性，pH 4～8范围内该原花色素较稳定；金属离子K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+对原花色素的稳定性影响不明显，而Cu2+、Fe3+有明显的破坏作用；抗坏血酸对原花色素无明显影响，过氧化氢则显著降低其稳定性；较长时间的光照对其稳定性不利。抗氧化试验表明，圆叶葡萄原花色素对DPPH·、·OH有明显的清除效果，并具有一定的还原能力。
综上，圆叶葡萄籽原花色素的加工储藏过程中应在避光、低温、弱酸环境中进行，并应避免与氧化剂及铁、铜器皿的接触。
[1]魏征，赵雅娇，黄羽，等.响应面试验优化超声波辅助提取圆叶葡萄鞣花酸和总酚工艺[J].食品科学，2015，36（12）：29-35.
[2]李涛，陆文科，杨培丽，等.4 个圆叶葡萄品种在桂中地区引种表现及栽培技术[J].河北果树，2018（6）：32-33.
[3]王秀，梁东，王进，等.美国圆叶葡萄在成都地区的避雨栽培表现[J].中外葡萄与葡萄酒，2017（6）：45-47.
[4]郭泽西，管敬喜，黄竟，等.不同圆叶葡萄品种产期调节技术研究[J].中国南方果树，2020，49（3）：112-114.
[5]魏征，郭文峰，黄羽，等.圆叶葡萄种子发育过程中多酚积累特性[J].食品科学，2018，39（4）：154-164.
[6]XU C,YAGIZ Y,HSU W,et al.Antioxidant,antibacterial and antibiofilm properties of polyphenols from muscadine grape(Vitis rotundifolia Michx.)pomace against selected foodborne pathogens[J].J Agr Food Chem,2014,62(28):6640-6649.
[7]BURTON L J,RIVERA M,HAWSAWI O,et al.Muscadine grape skin extract induces an unfolded protein response-mediated autophagy in prostate cancer cells:a TMT-based quantitative proteomic analysis[J].PloS One,2016,11(10):e0164115.
[8]PARK M K,OH J H.Antioxidant and antimicrobial activities of muscadine grape extracts[J].J Korean Soc Food Sci Nutrn,2015,22(1):12-18.
[9]朱学伸，赵文，林淑鑫，等.黑豆种皮中原花青素的提取和纯化研究[J].现代食品科技，2018，34（1）：154-160.
[10]张慧文，张玉，马超美.原花青素的研究进展[J].食品科学，2015，36（5）：296-304.
[11]金华，刘志刚，曾晓丹，等.超声提取葡萄籽原花青素工艺的优化及其抗氧化活性研究[J].中国调味品，2014，39（4）：102-107.
[12]张兵兵.葡萄籽原花青素的提取、精制及性质研究[D].广州：华南理工大学，2017.
[13]苏芳，顾明广，冯献起.超声波辅助提取葡萄籽中原花青素工艺的研究[J].中国酿造，2015，34（12）：113-116.
[14]陈晓景，蔺志平，王春丹.葡萄籽原花青素的超声提取条件优化研究[J].科学大众，2017（4）：186-187.
[15]焦天慧，芦宇，叶琳琳，等.超声波辅助提取红树莓籽中原花青素及其抗紫外活性评价[J].中国食品学报，2019，19（6）：98-105.
[16]陈月英，王彦平，孙瑞琳，等.葡萄皮渣原花青素微波辅助提取工艺的优化及其抗氧化活性研究[J].北方园艺，2016（11）：123-126.
[17]徐洁.酿酒葡萄籽中原花青素的提取和抗氧化性研究[D].扬州：扬州大学，2011.
[18]王文君，邓镇涛，向灿辉，等.紫番薯原花青素的稳定性和抗氧化性研究[J].食品工业，2012，33（6）：105-109.
[19]赵丹，曾新安，徐中岳.不同聚合度葡萄皮原花青素的抗氧化活性[J].食品与发酵工业，2012，38（4）：104-107.
[20]赵旭彤.蓝莓加工废弃物中花青素提取纯化及抗氧化活性研究[D].长春：吉林大学，2015.