葡萄酒香气是衡量葡萄酒感官质量的重要指标之一[1]。影响葡萄酒香气的因素有很多，比如品种差异、气候条件、酿造工艺等。在一定程度上，果实成熟度也会影响葡萄酒的香气[2]，选择一个最佳的葡萄采收期对于生产高品质葡萄酒是至关重要的[3]。葡萄酒的典型风味主要来源于葡萄果实中的挥发性化合物[4]。通过了解果实香气的组成，可以鉴别葡萄的成熟度及品种特性[5]。在成熟过程中，果实香气成分变化较大，所以研究者们通常希望通过果实风味物质检测来了解原料成熟度及品质变化，方便产品的质量控制[6]。
北冰红葡萄耐寒、抗病，可延迟至12月采收[7]，具有酿造红冰葡萄酒的潜质[8]。刘欢等[8]对通化地区的4种山葡萄品种进行对比研究得出，北冰红葡萄香气物质的种类和含量均最高，馥郁独特，有奶酪香、花香、果香以及油脂等香气。为了延长保鲜期、提高成熟度或酿造冰酒可以选择延迟采收，但这并不适合所有葡萄，对果实品质和生长特性有较高的要求[9]。
气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrom etry，GC-MS）方法广泛用于分离、鉴定和量化风味成分，顶空固相微萃取技术（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）是将风味成分引入GC仪器的一种相对简单的技术，适合葡萄与葡萄酒香气的表征[10]。实验选取延迟采收的几个时期，采用HS-SPME结合GC-MS的方法，并基于主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析（cluster analysis，CA）法对不同采收期北冰红葡萄果实香气成分进行分析，讨论渭北旱塬地区的北冰红葡萄延迟采收的最佳时期，以期为北冰红葡萄的推广以及优质北冰红葡萄酒的酿造提供理论参考，指导生产实践。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
北冰红葡萄，2013年引种栽培于西北农林科技大学合阳葡萄试验示范站，共10行，株行距1.0 m×2.5 m，篱形架，单干双臂树形，8月中旬成熟[11]。合阳葡萄试验示范站位于渭北旱塬地区，海拔708.8 m，属于暖温带大陆性季风气候，2017年平均气温13.16 ℃，年降水量656.27 mm，年日照2 329.93 h。实验采用对角线五点取样法进行取样，每点选取四株葡萄树，每串葡萄分上、下、左、右、前、后进行采样，每次采样500粒。采收期依次为：2017年9月20日（HT1）、10月20日（HT2）、11月20日（HT3）、12月10日（HT4），均为晴天。
没食子酸、儿茶素、芦丁（纯度均≥98%）：美国Sigma公司；2-辛醇（纯度≥98%）：上海源叶生物科技有限公司；福林酚（分析级）：北京索莱宝科技有限公司；甲醇（色谱级）：天津科密欧化学试剂有限公司；氯化钠（分析纯）：广东光华科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
固相微相萃取头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）：美国Supelo公司；GC-MS-QP2010 Ultra气相色谱-质谱联用仪，Cary-60紫外-可见光光度计：日本岛津公司；5424R离心机：德国Eppendorf 公司；KH-500DE超声波清洗机：昆山禾创超声仪器有限公司；610手持折光仪：上海淋誉贸易有限公司。
1.3 方法
1.3.1 基本理化指标测定方法
穗质量、百粒质量以及出汁率用电子天平称量得出；参考王华[12]的方法，可溶性固形物采用便携式手持折光仪测定，总酸采用NaOH 滴定法（以酒石酸计），还原糖采用斐林试剂滴定法（以葡萄糖计）；总花色苷采用pH示差法[13]，结果以mg/g花青素-3-O-葡萄糖苷表示；总酚（以没食子酸计）采用福林-肖卡法[14]；单宁（以儿茶素计）采用甲基纤维素沉淀法[15]；总黄烷-3-醇（以儿茶素计）采用P-DMACA-盐酸法[16]；总类黄酮（以芦丁计）采用NaNO3-AlCl3比色法[17]。
1.3.2 香气物质测定方法
将100 g葡萄去籽放入研钵中，加入液氮冷冻后迅速手工研磨成粉，置于50 mL离心管中，静置，4 ℃、10 000 r/min离心5 min，取上清液。在20 mL样品瓶中加入1.5 g NaCl、5 mL上清液、10 μL 0.230 g/L 2-辛醇内标液，待用[18]。
色谱柱：DB-wax色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；升温程序：起始温度从40 ℃开始，保留4 min，再以4 ℃/min的速度升温至120 ℃，以6 ℃/min的速度升至240 ℃，保留11 min；载气：氦气（He）；不分流进样；电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70eV；离子源温度230℃，接口温度为230 ℃；质谱扫描范围为35～350 amu。
将检测出的挥发性成分在美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）14谱库、wiley及香精香料谱库检索比对，并结合保留指数进行定性分析[19]。采用内标法[20]进行半定量分析。
1.3.3 数据分析
试验数据采用SPSS22.0统计软件进行方差分析和主成分分析（PCA）[21]，每份样品3个重复，取平均值，数据以“平均值±标准差”表示。采用Duncan 新复极差法进行显著性分析，显著差异P＜0.05，采用Origin 2018软件进行绘制柱状图和主成分分析载荷图，采用Excel 2010软件绘制表格，采用R语言pheatmap软件绘制聚类热图。
2 结果与分析
2.1 不同采收期对北冰红葡萄理化指标的影响
表1 不同采收期北冰红葡萄的基本理化指标
Table 1 Basic physical and chemical index of Beibinghong grape with different harvest time
注：不同小写字母代表差异显著（P＜0.05）。下同。
从表1可以看出，北冰红葡萄果实的各类基本理化指标具有显著性差异（P＜0.05）。其中，随采收期推迟，百粒质量呈先增后减趋势，穗质量和出汁率呈逐渐减小的趋势，原因可能在于挂果时间过长果实脱水造成；可溶性固形物、还原糖的含量呈逐渐增加的趋势，滴定酸含量逐渐减小。此外，四个采收期的糖酸比均大于20。
对果实中多酚物质含量进行监控非常重要[22]。从表1亦可以看出，除总单宁外，北冰红葡萄的总酚、总类黄酮、总黄烷醇、总花色苷含量均呈先增后减的趋势，并在11月20日达到峰值，依次为40.94 mg/g、31.70 mg/g、1.16 mg/g、15.94 mg/g。
2.2 不同采收期对北冰红葡萄香气成分的影响
由表2可知，渭北旱塬地区北冰红葡萄共检测出50种香气物质，可分为6类，其中酯类物质种类最多，C6化合物总含量最高，与前人研究结果一致[23]。对比四个时期香气物质含量可以得出，随采收期的推迟，香气物质总含量总体呈减少的趋势，这种变化与成熟过程中天气、温度以及品种本身特性有很大的关系[24]。
表2 不同采收期北冰红葡萄的香气成分
Table 2 Aroma components of Beibinghong grape with different harvest time
续表
注：“-”表示未检测到。
图1 不同采收期北冰红葡萄香气成分种类（A）及含量（B）
Fig.1 Aroma components types (A) and contents (B) of Beibinghong grape with different harvest time
由图1可知，酯类物质是葡萄果香和花香的主要贡献者[25]。随采收期推迟，酯类物质种类和含量均呈先增后减的趋势，存在显著差异。醇类物质是葡萄香气中比较重要的一类物质[26]。随着采收期的推移，醇类物质的种类和含量均呈现递减的趋势。翟婉丽等[27]对杨凌地区媚丽葡萄采收期确定进行研究，计算香气数据可知，随采收期推迟，酯类物质种类含量呈先增后减趋势，醇类物质种类含量均呈递减趋势，本实验研究结果与其变化规律一致。醛酮类物质是葡萄中重要的羰基化合物。酮类物质能带给葡萄花香、果香、油脂味等气味。醛类物质在葡萄中存在较多，在酒中会被还原成醇，不能稳定存在[28]。不同采收期醛酮类物质的种数和含量基本处于稳定状态，变化不大，该类物质的种类和含量理论上无法为确定最佳采收期提供参考。C6化合物和苯衍生物在葡萄和葡萄酒中的含量很高[29]。其中C6化合物对葡萄香气成分的贡献较大[30]，是重要的风味化合物[31]。本实验的C6化合物主要是指C6醇和C6醛。随采收期推迟，C6化合物含量总体呈递减的趋势，苯衍生物的含量呈先减后增的趋势。此外，还检测到了一些C13-降异戊二烯类物质以及萜烯类物质。萜烯类化合物是感官评价的重要物质，具有典型性，可作为葡萄的品种特征香气[32]。C13-降异戊二烯类物质主要由类胡萝卜素降解产生[33]，气味阈值极低，极易被感知出来，是重要的风味物质。
对表1中的50种香气物质进行特征香气分析。一般认为气味活度值（odor activity value，OAV）＞1的香气物质可能为该品种的特征香气或主体香气成分。根据OAV，即香气浓度与香气阈值的比值[34]，可以计算得出OAV＞1的香气物质有20种。其中辛酸乙酯、β-大马士酮、己醛等香气物质的阈值较低或含量较高，它们的OAV远高于其他物质，是重要的呈香物质。
2.2.1 聚类分析
图2 不同采收期北冰红葡萄香气成分聚类热图
Fig.2 Clustering heat map of aroma components of Beibinghong grape with different harvest time
由图2可以看出，不同采收期北冰红葡萄的香气主要可以聚为四类。其中，第Ⅰ类的香气物质（乙酸乙酯、月桂酸乙酯等）在HT3时期表现突出，说明这类香气物质含量随采收期的推迟呈先增后减的趋势，在11月达到最大值，结合表2感官特征可知，它们主要带给北冰红葡萄果香味；第Ⅱ类的香气物质比较复杂，乙酸己酯、橙花醇等在HT2时期比较突出，赋予北冰红葡萄果香、花香等味道，反-2-壬烯醛、反-3-己烯醇等在前三个时期的含量均高于HT4时期，它们主要带来青草的香味；第Ⅲ类香气物质（癸酸乙酯、棕榈酸乙酯等）则相反是在HT4时期含量比较高；第Ⅳ类香气物质的含量在HT1时期最高，有香叶基丙酮、1-辛烯-3-醇等，赋予北冰红葡萄花香等味道。从四个时期来看，HT2和HT3两个时期的香气轮廓更为接近，与HT4距离最远，差异较大。
2.2.2 主成分分析
由图3可知，HT2和HT3时期的香气物质位于前两个主成分的正向端，香气复杂馥郁，根据数据点和处理点之间的距离以及数据点和处理点分别与原点构成矢量之间的夹角可知，这两个时期的香气主要为乙酸乙酯、水杨酸甲酯、丁酸乙酯、异戊醇等十余种物质，且这些物质均与这两个时期呈正相关关系。同时这些物质也恰好位于聚类热图中的前两类，亦说明主成分分析与聚类分析结果一致。对比HT2、HT3时期来看，HT1时期位于第二主成分的负向端，HT4位于第一主成分负向端，处理点与香气数据点之间距离都比较远，且香气成分简单，总体表现不太突出，对于酿造香气馥郁的葡萄酒，不建议在这两个时期采收。综上所述，渭北旱塬地区的北冰红葡萄建议根据天气情况选择在HT2或HT3时期采收。
图3 不同采收期北冰红葡萄香气物质主成分分析载荷图（A）及得分图（B）
Fig.3 Loading diagram (A) and score plot (B) of principal component analysis of aroma components of Beibinghong grape with different harvest time
3 结论
实验以渭北旱塬地区4个不同时期采收的北冰红葡萄为样本，测定了相关基本理化指标和香气成分，通过比较各类香气物质总量，并结合聚类分析和主成分分析方法分析了各时期香气成分特征。结果表明，HT2和HT3时期的香气物质更复杂馥郁，赋予北冰红葡萄浓郁的果香和花香味道；同时参考基本理化指标等相关数据来看，HT3时期北冰红葡萄的各类酚类物质含量均最高，有利于酿造优质葡萄酒。HT4时期北冰红葡萄香气的种类和数量均明显少于其他几个时期，这可能与葡萄干缩和天气骤冷等变化有关，香气物质会随果实干化程度不断变化，但这可能不是北冰红葡萄HT4时期香气物质种类含量降低的主要原因，而气温变化可能为影响因素之一。综上所述，渭北旱塬地区北冰红葡萄的建议最佳采收期为11月中下旬。
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