核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取和纯化是分子生物学研究的基础内容，在进行体外反转录、RNA序列分析、基因克隆等研究时都需要完整性好、纯度高的RNA。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为重要的模式生物，也是最早被研究的生物之一[1]，它的RNA提取实际上是酵母菌细胞壁和细胞膜破裂后释放出其中的营养物质[2]，通过不同的方法去除细胞中的其他内含物，如糖类、脂类和蛋白质等杂质，最后得到高质量RNA的过程。然而酿酒酵母细胞壁呈甘露聚糖-蛋白质-葡聚糖的三明治结构[3-4]，成分复杂，细胞壁坚韧且厚[5]，如果破壁效果不佳，胞内产物就不能完全释放，从而干扰RNA的提取。细胞壁的破碎方法有很多[6-9]，按是否存在外加作用力，分为两种：机械法[10-12]（超声破碎法、磁珠法、高压均质化法等）和非机械法[13-15]（酶解法[16]、反复冻融法、自溶法、碱法等），无论哪种方法，都有自身的局限性和不足。目前人们用酶法对酵母细胞壁优化条件的研究很多，但用酶法提取酵母总RNA最优条件的选择还在探索之中。商安全等[17]选用改良TRIzol试剂破壁法及溶菌酶破壁法提取白假丝酵母菌的总RNA，结果显示改良TRIzol试剂破壁法提取获得的白假丝酵母菌总RNA浓度及纯度均显著高于溶壁酶（lyticase）破壁法（P＜0.05）。张金桃等[18]通过加入2.5%蜗牛酶并伴随超声波混合处理4 h，以去除酵母菌细胞壁。许甘霏等[19]使用TRIzol试剂裂解联用研磨珠破碎法、单酶酶解法、双酶酶解法、液氮研磨法4种细胞壁破碎方法提取表皮葡萄球菌总RNA，结果显示双酶酶解法和液氮研磨法提取的总RNA完整性好，质量高。
虽然有研究利用酵母破壁酶和蜗牛酶辅助破壁来提高RNA的提取效率[20-21]，尚鲜见将两者放在同一体系下进行比较。本研究采用酵母破壁酶和蜗牛酶辅助破壁，并对这两种酶在不同提取温度、提取时间、加酶量进行优化，再利用TRIzol试剂法提取总RNA，通过对提取的总RNA进行浓度和纯度分析，比较酶处理条件对酵母菌总RNA提取的影响，为酵母菌总RNA的提取提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GGSF16：广西科技大学发酵工程研究所。
1.1.2 试剂
蜗牛酶（破壁率90%），酵母破壁酶溶液：北京索莱宝科技有限公司；TRIzol试剂：赛默飞世尔科技公司；焦炭酸二乙酯（分析纯）：上海吉至生化科技有限公司；β-巯基乙醇（分析纯）：上海索莱宝生物科技有限公司；山梨醇（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。
1.1.3 培养基及试剂配方
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，115 ℃灭菌20 min。
0.1%焦炭酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）处理水：取1 mL DEPC溶液，用超纯水定容至1 L，处于振荡状态下过夜放置，121 ℃灭菌40 min。
1 mol/L山梨醇缓冲液：取1.8217 g山梨醇溶于10 mL 0.1%DEPC处理水中，用0.45 nm的滤膜进行过滤。
蜗牛酶溶液的配制：取相应质量的蜗牛酶溶于1 mL 1 mol/L山梨醇溶液中。
1.2 仪器与设备
H2100R低温高速离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；HH系列数显恒温水浴锅：金坛市科析仪器有限公司；B-500超微量分光光度计：上海元析仪器有限公司；JY02S紫外分析仪：北京君意东方电泳设备有限公司；ZWYR-C2402C叠式恒温调速摇床：上海智诚分析仪器制造有限公司；DYY-6D电泳仪：北京市六一仪器厂；BHC-1300 IIA2生物安全柜：阿尔泰实验室设备（北京）有限公司；LDZH-100KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂。
1.3 方法
1.3.1 实验器材预处理
在本次实验中，所有实验器材均用含有0.1%DEPC水过夜浸泡，121 ℃灭菌40 min。在整个实验操作中始终佩戴一次性手套，并及时更换，以避免RNA污染。
1.3.2 酿酒酵母的种子液活化及生长曲线绘制
从YPD平板上挑取酿酒酵母GGSF16单菌落到YPD培养基中，30 ℃、160 r/min培养10 h，按10%接种量接种至YPD培养基中，30 ℃、160 r/min继续培养至OD600nm值为1.0，此为酵母菌菌悬液。
1.3.3 酶处理条件优化
取750μL酵母菌菌悬液，12 000 r/min、4 ℃条件下离心2 min，弃去上清液，保留菌体。
（1）提取温度
①酵母破壁酶：向菌体中加入25 μL酵母破壁酶，470 μL山梨醇缓冲液，5 μL β-巯基乙醇，用移液枪轻轻吹打均匀后，分别置于27 ℃、30 ℃、33 ℃、37 ℃恒温水浴锅中处理45 min，期间每隔15 min上下颠倒混匀。
②蜗牛酶：向菌体中加入250μL30mg/mL蜗牛酶，2.5μL β-巯基乙醇，用移液枪轻轻吹打均匀后，分别置于33 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃恒温水浴锅中处理1 h，期间每隔15 min上下颠倒混匀。
（2）提取时间
①酵母破壁酶：向菌体中加入25 μL酵母破壁酶，470 μL山梨醇缓冲液，5 μL β-巯基乙醇，用移液枪轻轻吹打混匀，选取酵母破壁酶的最适提取温度，置于恒温水浴锅中分别处理15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，期间每隔15 min上下颠倒混匀。
②蜗牛酶：向菌体中加入250 μL 蜗牛酶，2.5 μL β-巯基乙醇，用移液枪轻轻吹打混匀，选取蜗牛酶的最适提取温度，置于恒温水浴锅中分别处理30 min、45 min、60 min、75 min、90 min，期间每隔15 min上下颠倒混匀。
（3）加酶量
①酵母破壁酶：向菌体中分别加入0、12.5 μL、25.0 μL、37.5 μL酵母破壁酶，对应加入495 μL、482.5 μL、470.0 μL、457.5 μL山梨醇缓冲液，再各加5 μL β-巯基乙醇，选取酵母破壁酶最适提取温度及最适提取时间。
②蜗牛酶：向菌体中分别加入250μL10mg/mL、20mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL蜗牛酶，再加2.5 μL β-巯基乙醇，选取蜗牛酶最适提取温度及最适提取时间。
1.3.4 RNA提取
分别向酵母破壁酶及蜗牛酶处理后的样品中加入750μL TRIzol试剂，按商品提供的说明书抽提总RNA。
1.3.5 分析检测
（1）总RNA浓度及纯度检测
利用超微量分光光度计测定总RNA溶液的质量浓度及在波长260 nm、280 nm处的吸光度值，以A260nm/A280nm（评估蛋白质污染），A260nm/A230nm（评估有机溶剂残留）的大小判断RNA样品的纯度。
（2）总RNA完整性检测
取1 μL提取得到的RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳（180 V、10 min），用紫外分析仪观察RNA浓度及降解情况。
2 结果与分析
2.1 酿酒酵母GGSF16生长曲线
为探究酿酒酵母GGSF16的生长情况，选取最佳的接种时间，使用分光光度计测定样品在波长600 nm处的吸光度值，结果见图1。
图1 酿酒酵母GGSF16的生长曲线
Fig.1 Growth curve of Saccharomyces cerevisiae GGSF16
由图1可以看出，酿酒酵母GGSF16在6～16 h处于对数生长期，选取10 h的菌体进行扩大培养。
2.2 不同提取温度对酵母总RNA提取的影响
取750 μL酿酒酵母培养液，按1.3.3所述的方法分别提取酵母总RNA，并进行浓度、纯度和电泳分析，结果分别见表1和图2。
表1 不同提取温度获得的RNA浓度和纯度
Table 1 RNA concentration and purity obtained at different extraction temperature
酵母破壁酶是蜗牛酶、纤维素酶等多种酶的混合酶。根据酵母破壁酶的说明书，建议在不超过5×107的酵母培养物离心后加入25 μL酵母破壁酶，30 ℃处理1～2 h，因此，设置酵母破壁酶的温度为27～37 ℃。由图2可以看出，泳道1，2，3均有两条明显的28S rRNA和18S rRNA条带，但也伴有轻微的小片段RNA弥散带，泳道4的两条条带几乎不可见，RNA降解严重。综合表1可以看出，用酵母破壁酶处理后提取的RNA质量浓度较高，均在800 ng/μL以上，A260nm/A280nm均在2.0左右，说明蛋白质或酚类物质污染小，RNA的纯度较高。根据核酸的质量浓度，当提取温度为27 ℃时，核酸质量浓度最高为1 526.128 ng/μL。综合图2和表1，酵母破壁酶的最适提取温度为27 ℃。
图2 不同提取温度提取酵母总RNA电泳图
Fig.2 Electrophoretogram of total RNA extracted from yeast with different extraction temperature
泳道1～4：酵母破壁酶温度分别为27 ℃，30 ℃，33 ℃，37 ℃；泳道5～8：蜗牛酶温度分别为33 ℃，37 ℃，40 ℃，43 ℃。
蜗牛酶是蜗牛消化液中的一种混合酶制剂，主要含有纤维素酶、蛋白水解酶和果胶酶等二、三十种酶。根据蜗牛酶的说明书，建议每克细胞经30～40 mg酶在37 ℃保温1 h即可溶解酵母细胞壁，因此，设置蜗牛酶的处理温度为33～43 ℃。由表1可以看出，蜗牛酶处理后的核酸浓度很高，在2 000 ng/μL左右，A260nm/A280nm在2.0以下，说明有蛋白质污染，A260nm/A230nm在2.0范围，说明几乎没有其他盐类或杂质的污染。综合图2的电泳图可以看出，泳道5中RNA降解严重，仅能看到28S rRNA，泳道6可以看到较为清晰的28S rRNA和18S rRNA条带，但也出现了降解现象，泳道7，8仅出现了5S rRNA，说明温度太高，RNA已经完全降解。综合图2和表1，蜗牛酶的最适提取温度为37 ℃。
2.3 不同提取时间对酵母总RNA提取的影响
取750 μL酿酒酵母培养液，按1.3.3所述的方法分别提取酵母总RNA，并进行浓度、纯度和电泳分析，结果分别见表2和图3。
根据酵母破壁酶说明书，酵母破壁酶的最佳温育时间为1～2 h，而在预实验中发现当设置为45 min～2 h时，RNA浓度变化不大，但随着时间的延长，RNA降解严重。因此，适当调整温育时间为15～75 min。从表2可以看出，经酵母破壁酶处理后，不同酶处理时间下提取的RNA浓度均很高，在1 500 ng/μL以上，A260nm/A280nm和A260nm/A230nm均在2.0左右，说明基本无蛋白质或其他盐类等杂质污染。综合图2，泳道1，2，3均有亮度较高，条带较好的28S rRNA和18S rRNA条带，而泳道4，5可能由于酶处理时间太长，RNA降解，从而导致电泳图中几乎无条带出现。由于延长酶处理时间可能会使RNA降解，综合图3和表2，当酵母破壁酶处理15 min时RNA浓度和纯度均很高，因此，酵母破壁酶的最适提取时间为15 min。
表2 不同提取时间获得的RNA浓度和纯度
Table 2 RNA concentration and purity obtained with different extraction time
图3 不同提取时间提取酵母总RNA电泳图
Fig.3 Electrophoretogram of total RNA extracted from yeast with different extraction time
泳道1～5：酵母破壁酶时间分别为15 min，30 min，45 min，60 min，75 min；泳道6～10：蜗牛酶时间分别为30 min，45 min，60 min，75 min，90 min。
根据蜗牛酶的说明书，蜗牛酶温育1 h即可溶解酵母细胞壁，因此，设置蜗牛酶的温育时间为30～90 min。由表2可以看出，蜗牛酶处理后的核酸浓度很高，当提取时间＞45 min时，核酸质量浓度在2 000 ng/μL以上，但A260nm/A280nm和A260nm/A230nm却不理想，均在2.0以下，说明有蛋白质或其他盐类等杂质污染，导致泳道7～10只有5S rRNA条带。当蜗牛酶的处理时间为30 min时，虽然核酸浓度相对较小，为1 108.209 ng/μL，但泳道6有28S rRNA和18S rRNA条带，只不过条带中伴随有小片段RNA的弥散带，可能是由于A260nm/A230nm在2.0以下，有其他裂解液杂质的残留造成的。综合图3和表2，蜗牛酶的最适提取时间为30 min。
2.4 不同加酶量对酵母总RNA提取的影响
取750 μL酿酒酵母培养液，按1.3.3所述的方法分别提取酵母总RNA，并进行浓度、纯度和电泳分析，结果见表3和图4。
表3 不同加酶量获得的RNA浓度和纯度
Table 3 RNA concentration and purity obtained with different enzyme addition
图4 不同加酶量提取酵母总RNA电泳图
Fig.4 Electrophoretogram of total RNA extracted from yeast with different enzyme addition
泳道1～4：酵母破壁酶用量分别为0，12.5 μL，25.0 μL，37.5 μL；泳道5～8：蜗牛酶用量分别为10 mg/mL，20 mg/mL，30 mg/mL，40 mg/mL。
根据酵母破壁酶的说明书，建议在不超过5×107的酵母培养物离心后加入25 μL酵母破壁酶即可溶解酵母细胞壁，因此，设置酵母破壁酶的用量为0～37.5 μL。由图4可以看出，泳道2，3，4有28S rRNA和18S rRNA两条条带，且泳道4的条带相对较亮，综合表3可以看出，随着酵母破壁酶用量的增加，核酸的浓度也在不断的增大，A260nm/A280nm基本在2.0左右，说明无蛋白质或酚类物质污染，而A260nm/A230nm除了酶用量在37.5 μL时为2.0左右，其他酶用量下均在2.0以下，说明只有酵母破壁酶用量在37.5 μL时，基本无其他裂解液杂质的污染。综合图4和表3，酵母破壁酶的最适加酶量为37.5 μL。
根据蜗牛酶的说明书，建议每克细胞经30～40 mg酶处理即可溶解酵母细胞壁，因此，设置蜗牛酶的用量为10～40mg/mL。由图4的电泳图可以看出，泳道5，6的两条28SrRNA和18S rRNA条带基本降解完全，泳道8只有5S rRNA条带，提取效果不佳，而泳道7可以看出，有较为明显的28S rRNA和18S rRNA条带，综合表3，当蜗牛酶的用量为30 mg/mL时，核酸质量浓度达到最大值为1 673.394 ng/μL，此时的A260nm/A280nm为1.99，说明RNA中基本无蛋白质污染。因此，蜗牛酶的最适加酶量为30 mg/mL。
3 结论
在本次实验中酵母破壁酶的最佳提取条件为加酶量37.5 μL，提取温度27 ℃，提取时间15 min；蜗牛酶的最佳提取条件为加酶量30 mg/mL，提取温度37 ℃，提取时间30 min。这次实验表明利用酵母破壁酶辅助破壁可以提取到高质量的酵母总RNA，而利用蜗牛酶辅助破壁只能提取到高浓度的RNA而并不能提取到高质量的RNA，说明蜗牛酶可以较好的破除酵母细胞壁，但不适合利用蜗牛酶辅助破壁提取酵母总RNA，可能不同来源的蜗牛酶及其酶活力，操作过程中酶的添加顺序等都会影响酵母总RNA的提取。
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