酿造米酒是我国一种传统的酒精饮品，酒精度一般在5%vol～14%vol，颜色呈淡黄色或乳白色，除具有独特的香气、清爽的口感外，还含有丰富的营养成分[1]。米酒中含有适量的麦芽糖等易于吸收的小分子糖类、多种氨基酸（包括8种人体不可缺少的必需氨基酸）、有机酸、矿物质、维生素等[2-5]。传统中医学认为米酒具有消食健脾、温寒补虚、提神解乏、解渴消暑等功效。动物实验发现，米酒能明显增加腹腔巨噬细胞的吞噬能力，从而提高免疫能力，还可通过抗氧化作用抑制衰老症状[6-7]。随着人们生活水平的提高，米酒越来越受到消费者的青睐。
我国米酒的酿造具有悠久的历史，产地分布广泛。近年来国内对米酒的研究主要集中在对某些特定原料及地域性米酒品质的分析[8-12]、米曲微生物群落结构的研究及相关微生物的分离鉴定[13-16]、新型米酒产品的开发等方面[17]。对米酒生产工艺的研究仅限于利用酒曲发酵及对香气成分的影响[18-19]，而以米曲霉、酿酒酵母等微生物酿造米酒的发酵工艺条件研究鲜见报道。
米酒种类较多，由于受地域性、工艺技术、生产原料等因素的影响，传统米酒是用蒸熟的米饭拌上米曲经发酵、过滤而成，受米曲中微生物菌群的影响，造成米酒品质参差不齐，同一企业的产品质量也不稳定。以米曲霉为糖化剂、酵母为发酵剂的米酒生产新工艺可对发酵工艺过程进行控制，以稳定其质量，从而开发出口感协调、香气较好、质量稳定的米酒。本研究以米曲霉（Aspergillus oryzae）及酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为发酵菌株，采用两步发酵法研制酿造米酒，通过测定酿造米酒的酒精度、总糖、总酸、风味物质和感官评价等指标，确定最佳的酿造米酒发酵工艺条件，为酿造米酒产业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
大米、麸皮：市售；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）LB-05、米曲霉（Aspergillus oryzae）YM-16：本实验室筛选，均来源于米曲；传统米酒：本实验室以酒曲为糖化发酵剂酿造[18]。
1.1.2 化学试剂
酵母粉、蛋白胨、琼脂粉（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限公司；葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、酒石酸钾、苯酚、亚硫酸钠、氢氧化钠（均为分析纯）：成都科龙化学试剂厂；白酒色谱混合标样：郑州谱析科技有限公司。
1.1.3 培养基
酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%，121 ℃灭菌20 min。
麸皮培养基：麸皮∶水=1.0∶0.8（g∶mL），121 ℃灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2FD超净工作台：苏州合飞净化设备有限公司；LDZX-75KBS高温蒸汽灭菌锅：上海申安有限公司；HHW21-600S恒温水浴锅：江苏省金坛市正基仪器有限公司；MJ-250-H恒温恒湿培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；LRH-250恒温培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；HEIVAPPRE-CISION旋转蒸发仪：上海贤德实验仪器有限公司；7890A气相色谱分析仪：美国安捷伦科技有限公司；LZP-930色谱柱（50 m×0.25 mm×0.25 μm）：中科院兰州化学物理研究所；MX-301离心机：日本Tomy公司。
1.3 方法
1.3.1 酿造米酒工艺流程及操作要点
操作要点：
大米浸泡、蒸煮：大米淘洗2～3遍后，加3倍水于常温条件下浸泡1 h，滤掉水分，于蒸锅上蒸煮约1 h，至全部熟透用手捏富有弹性且不粘手时为止。
霉菌孢子悬浮液制备：霉菌菌种接种于麸皮培养基上，每24 h摇动一次，28 ℃培养72 h后加入200 mL灭菌水摇匀，用灭菌后的双层纱布过滤，滤液即为孢子悬浮液，孢子浓度为105～106个/mL。
米曲制备：大米经除杂清洗、浸泡、蒸煮，冷却至30～40 ℃左右，分装在搪瓷盘中，按原料米质量的1%加入孢子悬浮液。控制温度为38 ℃、相对湿度为95%。培养48 h后，摊开混合均匀再堆积，在32 ℃和95%相对湿度条件下培养24 h。最后控制温度至40 ℃，相对湿度50%，保持12 h，干燥后得到米曲[20]。
酒母制备：取酵母菌于YPD液体培养基内，在25 ℃恒温条件下培养，每日摇动混匀1～2次，2～3 d后至酵母数（1.0～1.5）×108个/mL，即得酿造米酒所需酒母。
第一次发酵：称取米曲82.5 g放入1 000 mL三角瓶中，加入100 mL灭菌水，再加入酒母1 mL，混合均匀后，置于25℃恒温箱中培养3d，每天摇动一次，进行米酒的一次发酵。
第二次发酵：取250 g大米，经除杂清洗、浸泡、蒸煮，冷却后加入一次发酵后的三角瓶中，并加入450 mL无菌水。在恒温箱中进行二次发酵，每天摇动一次，过滤后的清液即得酿造米酒[21]。
1.3.2 酿造米酒发酵条件的优化
分别使酵母接种量为原料大米量的0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%，在21 ℃、23 ℃、25 ℃、27 ℃、29 ℃条件下进行发酵1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、13 d、15 d、17 d。考察接种量、发酵温度及发酵时间对酿造米酒品质的影响。
1.3.3 不同方法酿造米酒的品质特性
分析两步发酵方法和传统方法生产的米酒中酒精度、总糖、总酸、风味物质等理化指标，并进行感官品评，比较不同方法酿造米酒的品质。
1.3.4 分析方法
酒精度：采用气相色谱法测定[21]；总酸含量：采用酸碱滴定法测定[22]；总糖含量：采用DNS法测定[23]。
米酒中的风味物质含量采用气相色谱法检测。样品处理方法：米酒在2 300×g、4 ℃条件下离心5 min，上清液经0.22μm薄膜过滤器过滤。气相色谱条件如下：载气为高纯氮气（N2），氢气（H2）流量为30 mL/min，空气流量为400 mL/min；进样温度及检测温度均为220 ℃，进样量0.4 μL，分流比10∶1；柱温55 ℃，保持3 min，以3.5 ℃/min的速率升温至150 ℃，保持1 min；以10 ℃/min的速率升温至200 ℃，保持30 min。以保留时间定性、内标法计算各风味物质的含量。
1.3.5 米酒中风味物质的气味活性值计算
以传统自然发酵的米酒为对照，根据测定的米酒风味物质含量，通过风味成分的嗅觉阈值，按如下公式计算各种成分的气味活度值（odor activity value，OAV），其计算公式如下：
式中：C1表示风味物质的含量，mg/mL；C0表示风味物质的阈值，μg/L。
依据米酒风味物质的OAV值作米酒风味轮廓图。
1.3.6 感官评定
参考GB/T 13662—2018《黄酒》中的感官评定方法，组建感官评定小组，对酿造米酒的外观、香气、滋味、整体协调度4个方面进行评价[24]，满分100分，感官评定标准见表1。
表1 酿造米酒的感官评定标准
Table 1 Sensory evaluation standards of brewed rice wine
1.3.7 数据处理
试验数据以均值±标准差表示，采用Excel 2010作图；采用SPSS 16.0进行单因素方差分析，显著性水平为0.05，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 不同酵母接种量对酿造米酒的影响
由表2可知，风味物质中乙醛、正丙醇的含量差异较大（P＜0.05）。乙酸β-苯乙酯的含量差异不显著（P＞0.05），乙酸在接种量0.8%～1.0%及1.2%～1.6%时有显著差异（P＜0.05）。接种量为1.0%时，酿造米酒中乙酸乙酯、异戊醇、β-苯乙醇、乙酸异戊酯含量较高。
由表3可知，接种量1.4%时米酒的酒精度最高（14.59%vol），但其总糖含量最低（0.64 g/L）；接种量1.2%时的总酸最高（1.94 g/L）。酿造米酒的米曲霉含丰富的淀粉酶、蛋白酶等酶类，酶解淀粉为糖类，还产柠檬酸、乳酸等有机酸[25]，所以米酒中含有糖分和有机酸。接种量大，酵母生长旺盛，产酒能力就强；总糖和总酸含量的变化，可能是由于酵母和米曲霉中的酶相互作用的结果。适量的糖和酸能提高米酒品质，从理化指标结果来看，接种量1.0%为宜。感官品评结果显示，接种量0.8%、1.2%时的米酒感官品评得分较低，原因可能是在发酵过程中产生了不利于口感的物质。接种量1.0%时发酵的米酒感官品评得分最高（81.62分），在口感上相对较好，总酸和总糖含量比较适宜，米酒酸甜适口。从感官得分结果来看，酵母接种量1.0%为宜。
表2 不同酵母接种量对发酵米酒的挥发性风味物质含量的影响
Table 2 Effect of different yeast inoculum on volatile flavor compounds contents of brewed rice wine
注：“ND”表示未检出。不同小写字母表示在P＜0.05 水平上存在显著差异。下同。
表3 不同酵母接种量对酿造米酒理化指标和感官评分的影响
Table 3 Effect of different yeast inoculum on physiochemical indexes and sensory score of brewed rice wine
2.2 发酵温度对酿造米酒的影响
由表4可知，不同发酵温度乙醛、乙酸异戊酯的含量有显著差异（P＜0.05）；β-苯乙醇差异不显著（P＞0.05）。25 ℃发酵的米酒中乙酸异戊酯、乙酸β-苯乙酯的含量最高，分别为4.06 mg/L、26.94 mg/L。异戊醇、β-苯乙醇随发酵温度的升高略有减少，原因可能是较高的温度导致相关的酶类活性降低。
由表5可知，不同发酵温度条件下酿造米酒在酒精度和酸度上差别不显著（P＞0.05）；21～23 ℃及25～29 ℃发酵时有显著差异（P＜0.05）。21 ℃时酿造米酒的总糖量最高，为1.49 g/L。可能是随着发酵温度的升高，米曲霉的酶活性受到影响，造成分解淀粉的能力降低，发酵温度较高时酿造米酒的总糖量较少。由于米酒发酵过程中的温度适宜酵母菌的作用，不同发酵温度对酒精度和酸度的影响不大。25 ℃发酵的酿造米酒感官品评得分最高（81.18分）。糖度和酸度对米酒口感的影响较大，25 ℃发酵时酿造米酒风味物质的含量较协调，口感也相对较好，曲霉菌产酶活性最佳[25]。因此，确定酿造米酒的最适发酵温度为25 ℃。
表4 不同发酵温度对酿造米酒挥发性风味物质含量的影响
Table 4 Effect of different fermentation temperature on volatile flavor compounds contents of brewed rice wine
表5 不同发酵温度对酿造米酒理化指标和感官评分的影响
Table 5 Effect of different fermentation temperature on physiochemical indexes and sensory score of brewed rice wine
2.3 发酵时间对米酒品质的影响
由表6可知，随着发酵时间的延长，酿造米酒的风味物质含量也随着增加，在发酵前5 d，酿造米酒的风味物质含量快速上升，在发酵13 d时趋于稳定。酿造米酒特征香气成分乙酸β-苯乙酯、β-苯乙醇的含量在发酵前5 d分别从6.12 mg/L、4.62 mg/L上升至18.63 mg/L、87.76 mg/L，到13 d时缓慢上升至23.47 mg/L、120.22 mg/L。到发酵13 d后，酿造米酒中风味物质含量的差异不显著（P＞0.05），延长发酵时间增加米酒中风味物质含量的意义不大，13 d的发酵时间较为适宜。
表6 不同发酵时间对酿造米酒挥发性风味物质含量的影响
Table 6 Effect of different fermentation time on volatile flavor compounds contents of brewed rice wine
续表
表7 不同发酵时间对酿造米酒理化指标和感官评分的影响
Table 7 Effect of different fermentation time on physiochemical indexes and sensory score of brewed rice wine
由表7可知，在发酵前5 d，酿造米酒的酒精度快速上升，从2.39%vol上升至12.71%vol，随后酒精度变化不大，发酵13 d米酒酒精含量为13.21%vol。发酵前3 d酿造米酒酿造体系中的淀粉水解酶起作用，将淀粉水解为糖类，总糖含量有所上升，3～5 d时酵母利用糖类产酒，总糖含量快速下降，从19.74 g/L下降至2.62 g/L，与酒精含量的变化趋势相反；前期总酸含量缓慢上升。7 d后的总酸、总糖含量趋于稳定，是由于酿造体系中的可发酵性糖被利用完及少有酸产生。从理化指标结果来看，发酵时间13 d为宜。且此条件下时酿造米酒口感较好，感官品评得分最高，为87.14分。因此，确定米酒的最适发酵时间为13 d。
2.4 酿造米酒的风味特征
采用不同方法酿造米酒的理化指标和感官得分见表8，相关挥发性风味物质的嗅觉阈值、感官描述风味物质含量和OAV见表9，选择OAV较高的风味物质为主体特征作米酒的风味轮廓图见图1。
表8 两种米酒的理化指标和感官评分
Table 8 Physiochemical indexes and sensory score of two kinds of rice wine
由表8可知，酿造的米酒和传统米酒的酒精度、总酸、总糖和感官评分有显著差异（P＜0.05）。酿造米酒酒精度和感官评分较高，而总酸、总糖较低，可能是由于传统方法酿造过程中对糖的利用较好，受杂菌污染产生了较多的酸。
表9 两种米酒中风味物质的嗅觉阈值及香气活性值
Table 9 Olfactory threshold and OAV of flavor compounds in two kinds of rice wine
由表9可知，米酒特征香气成分乙酸β-苯乙酯、β-苯乙醇的含量无显著差异（P＞0.05），表明酿造米酒与传统米酒的风味无明显差异；其他成分除异丁醇外具有显著差异（P＜0.05）。不同挥发性组分的气味阈值显著不同，含量较低的物质可能由于其阈值极其低，使得其OAV非常高。通常认为OAV＞1的物质对米酒的风味有贡献，OAV＞10的则认为是重要香气物质[29]。
图1 米酒风味轮廓特征
Fig.1 Aroma characteristics of rice wine
选择OAV较高的风味物质为主体特征，包括具有香蕉香味的乙酸异戊酯、具有花香味的乙酸β-苯乙酯、具有苹果香味的己酸乙酯、具有青草味的乙缩醛和醇香味的正丁醇。由图1可知，酿造米酒与传统米酒的主体风味特征为水果香和花香，并有醇香和青草香等；颜色呈米黄色，酒体丰满醇和，香气自然纯正。
3 结论
酿造米酒的适宜酵母菌接种量为1.0%，最佳发酵工艺参数为发酵温度25 ℃、发酵时间为13 d。在此最佳条件下，酿造米酒酒精度13.21%vol，总酸1.37 g/L，总糖0.95 g/L，感官评分87.14分。米酒关键香气物质乙酸β-苯乙酯、β-苯乙醇的含量分别为23.47 mg/L、120.22 mg/L，酿造米酒的主体风味特征为水果香、花香和醇香等，口感较好，与传统发酵米酒的风味特征无明显差异，可为酿造米酒的产业化生产提供理论依据。
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